2. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所, 武汉 430070;
3. 武汉科前生物股份有限公司, 武汉 430070
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430070, China;
3. Wuhan Keqian Biology Co., Ltd., Wuhan 430070, China
正常动物机体肠道中有1013~1014微生物定居,数量最多的是肠道菌群。肠道菌群可以通过微生物协同分解、分泌代谢物等方式参与宿主机体代谢,宿主免疫等生理功能,对维持机体健康有重要作用[1-2]。仔猪出生后肠道就已经有微生物定植,但在断奶前后、保育期、生长期和育肥期肠道微生物有所不同,呈一定的动态发展规律。例如断奶后仔猪肠道菌群多样性和菌群结构发生了改变。有些菌是断奶前仔猪肠道特有的, 如嗜胆菌属(Bilophila)、具核梭杆菌属(Fusobacterium nucleatum),黄杆菌属(Flavobacteriaceae) 等,有些菌是断奶后仔猪肠道特有的, 如费克蓝姆菌属(Facklamia)、八叠球菌属(Sarcina) 等[3]。影响肠道菌群组成和丰度的主要因素有年龄、饮食、基因和疾病等[4]。当机体出现疾病,肠道微生物的组成和结构会发生明显的改变,疾病导致机体稳态被破坏,影响肠道微生物定植生存。另一个影响因素是药物的使用,尤其是抗生素的使用,抗生素介导肠道微生物组改变,导致肠道菌群失调。微生物群与宿主免疫系统之间的相互作用是多方面的、复杂的和双向的。以前认为肺部是无菌的环境,但最近的研究显示,肺部也存在微生物[5]。而目前的测序结果显示,肺部菌群与肺部上呼吸道菌群组成类似,相较上呼吸道丰度更低,表明肺部微生物大部分是通过上呼吸道吸入获得的。肺部是否存在真正的长期、自我维持的细菌菌群尚不清楚。但是在肺部感染中,肺部的菌群仍有重要意义。肺部正常微生物协同动物机体构成了抵抗病原微生物入侵的防御屏障。研究表明,下呼吸道复杂微生物群落会阻止下呼吸道及肺部发生感染的发生,这些微生物协同宿主的防御体系降低的肺炎发生概率[6]。肠道菌群和肺部菌群在感染性疾病的发展过程中发生的改变,或许起着预示疾病转归的作用。
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种急性传染病,该病毒主要通过侵入呼吸道和生殖道黏膜表面感染,不同年龄的猪均可感[7]。猪一旦感染后,会出现体温迅速升高、呼吸急促、喘气、咳嗽等主要临床症状,严重的还会出现皮肤泛红、全身出血,同时还会伴随腹泻、呕吐、食欲废绝等消化道症状,严重的还会导致大肠阻塞。与成年动物相比,仔猪和保育猪因为先天免疫系统发育不完善,更容易受到PRRSV感染。目前,尚无有效的方法治疗此病,使用抗生素是治疗此病最主要的手段。研究表明,PRRSV感染会引起机体免疫抑制,从而继发其他微生物感染和猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)[8-9]。肠道微生物是病毒感染中的一个重要角色,一方面肠道微生物通过直接和间接调控黏膜免疫,主要影响肠道病毒感染,另一方面,病毒感染后引起的机体免疫状态改变,会影响黏膜菌群[10]。断奶是猪生长发育的重要阶段,此阶段易发感染性肠道疾病。断奶期能否顺利度过,决定了后期育肥的速度和质量。临床上,肠道感染的治疗中通常会过度使用抗生素,过度使用抗生素已经引起了严重的经济和公共卫生问题,采用非抗生素疗法具有重要的经济价值[11]。目前,粪菌移植在感染性疾病和非感染疾病中均具有较大的治疗潜力[12]。肠道菌群产物也可通过调节免疫细胞缓解肠道炎症[13]。如采用微生态制剂的治疗方法,了解某种具体病毒感染过程中肺部和肠道的菌群变化,可更好地为治疗提供明确的指导。
本研究通过观察PRRSV感染断奶仔猪后,对肺部和不同肠段微生物变化的影响,探究病毒致肺部和肠道微生物的改变,并为相关疾病的非抗生素治疗方法治疗提供思路。
1 材料与方法 1.1 毒株与细胞系PRRSV毒株PRRSV/pig/CHN/JTS/201606,谱系8[14],分离自湖北某猪场临床样品,由华中农业大学实验室-80 ℃保存。Mac-145细胞由本实验室保存,用于PRRSV培养增殖和TCID50测定。
1.2 动物试验和样品采集挑选14只35日龄断奶仔猪,试验前RT-PCR核酸检测PRRSV为阴性,且CSFV(classical swine fever virus)、PRV(pseudorabies virus)、PCV2(porcine circovirus 2)核酸检测均为阴性。动物试验根据华中农业大学动物研究伦理委员会的操作规范(许可证号4200695757)进行。随机将14头断奶仔猪分为空白对照组、PRRSV感染组,每组各7只,适应性饲养7 d后,于第8天,感染组每头猪接种1×105 TCID50·mL-1的JTS病毒液2 mL(1 mL肌注,1 mL滴鼻),对空白对照组仔猪接种2 mL DMEM细胞培养液(1 mL肌注,1 mL滴鼻)。感染组与对照组隔离饲养,自由饮水、自由采食。
将攻毒后第21天对各组仔猪进行剖杀。其中,感染组3头仔猪分别于攻毒后第10、12、19天死亡。将存活的仔猪于第21天集中剖检,对仔猪小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(盲肠、结肠、直肠)组织进行取样,一份样品先于液氮中速冻,后将样品置于-80 ℃长期保存,另一份置于4%甲醛溶液中固定。肠道内容物及肺泡灌洗液,采集后置于-80 ℃长期保存。
1.3 肺和肠道病理学检查肺、肠组织用4%多聚甲醛固定24 h以上,石蜡包埋切片。采用HE染色,在OLYMPUS CX41光学显微镜下观察组织结构的变化,并拍照。
1.4 肺、肠道和肠系膜淋巴结病毒分布检测将肺、肠、肠系膜淋巴结等器官切片进行脱蜡和微波抗原修复,用5%BSA封闭。滴加PRRSV一抗孵育过夜,之后滴加抗鼠二抗,DAB显色,苏木素复染后封片。镜下观察并拍照。
1.5 DNA提取和文库制备将总微生物提取DNA,并对扩增产物使用Nanodrop紫外分光光度计进行定量,然后使用1.2%琼脂糖凝胶电泳对样品进行质量检测,扩增产物使用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)切胶回收,随后采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。
1.6 16S rRNA高通量测序采用Illumina MiSeq平台对16S rRNA V3-V4区(上游引物:ACTCCTACGGGAGGCAGCA,下游引物:GGACTACHVGGGTWTCTAAT)进行双端测序,下机数据采用滑动窗口法进行质量筛查,窗口大小为10 bp,步长为1 bp,从5′端第一个碱基位置开始移动,要求窗口中碱基平均质量≥Q20,从第一个平均质量值低于Q20的窗口处截断序列,并要求截断后的序列长度≥150 bp,且不允许存在模糊碱基(ambiguous base)N,随后利用FLASH软件[15]对初筛后的双端序列进行配对连接,并获得每个样品的有效序列,通过数据分析,分析比较空白对照组和感染组肠道内容物和肺泡灌洗液的微生物组成、多样性的差异(上海派森诺生物科技股份有限公司)。
1.7 生物信息学分析通过使用QIIME软件,将OTU序列比对Greengenes数据库(Release 13.8,http://greengenes.secondgenome.com/)[16]按照97%的序列相似度进行归并和操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)划分,选取OTU丰度最高的序列作为该OTU分类的代表序列。通过使用QIIME软件对感染组和空白对照组不同样品计算Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数,反映Alpha多样性,并用R语言绘图。通过Galaxy在线分析平台(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)进行LEfSe分析。通过使用QIIME软件计算Beta多样性包括主成分分析(principal component analysis,PCA)、非度量多维尺度分析(nonmetric multidimensional scaling, NMDS),主要是反映不同组不同样本之间微生物群落结构的差异,通过R将结果可视化。
1.8 RNA提取和实时荧光定量PCR取各组十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠组织和肺50~100 mg, 使用Trizol(TaKaRa, 9109)提取总RNA。用微量分光光度计检测RNA浓度。用反转录试剂盒(Vazyme, R233-01)将RNA反转录成cDNA。在NCBI上设计IL-6、IL-18、GAPDH、TNFα特异性引物(表 1),引物由生工生物工程股份有限公司合成。使用SYBR Green qPCR(Vazyme, Q311-02/03)试剂盒进行荧光定量。采用20 μL反应体系:2× ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,cDNA 2 μL,10 μmol·L-1上、下游引物各0.4 μL,50× ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL和ddH2O 6.8 μL。反应条件:95 ℃ 1 min预变性; 95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s, 共进行43个循环反应。每个样品重复3次,各个基因的相对表达水平以2-ΔΔCt进行统计分析。
免疫组化结果显示,病毒在仔猪肺部、肠道和肠系膜淋巴结中均有分布(图 1)。相较于对照组,感染组肺泡壁明显增厚,间质增生,气管绒毛和肺血管周围可见病毒感染(图 1E箭头所指黄色阳性信号)。肠道中,肠黏膜肠绒毛有明显缺损,感染组回肠肠绒毛变短,固有层内的集合淋巴小结数量增多,增生明显(图 2A)。病毒主要分布于于肠绒毛上和肠道固有层中(图 1F箭头)。肠系膜淋巴小结中可见散在被感染的细胞,淋巴小结生发中心明显(图 1D)。
2.2.1 OTU划分 使用QIIME软件比对Greengenes数据库(Release 13.8,http://greengenes.secondgenome.com/) [16],将有效序列以OTU的方式聚类,并按照97%的相似度进行划分,对样品OTU数进行统计(图 3A)。按组别对肺灌洗液及各肠段内容物分别比较绘制Venn图(图 3B)。肺灌洗液中,感染组与对照组共有905个OTU,仅在感染组独有的OTU有779个,仅在对照组独有的OTU有286个;十二指肠内容物,感染组与对照组共有688个OTU,感染组独有413个,对照组独有550个;空肠内容物共有758个OTU,感染组独有365个,对照组独有485个;回肠内容物共有956个OTU,感染组独有557个,对照组独有1 481个;盲肠内容物共有1 348个OTU,感染组独有732个,对照组独有828个;结肠内容物共有1 618个OTU,感染组独有806个,对照组独有844个;直肠内容物共有1 697个OTU,感染组独有659个,对照组独有591个。
2.2.2 Alpha多样性分析 Chao1、ACE指数可反映样品微生物的丰富度,估计群落中实际存在的物种数,Shannon、Simpson指数可反映样品微生物的多样性。如图 4所示,感染组肺中Chao1、ACE指数高于对照组,肠道中均低于对照组(图 4A、B)。Shannon、Simpson指数,感染组中肺、十二指肠、直肠Shannon指数高于对照组,空肠、回肠、盲肠、结肠低于对照组,而肺、回肠、直肠(图 4C),Simpson指数高于对照组,十二指肠、盲肠、结肠低于对照组(图 4D)。
2.2.3 分类组成分析 在各分类水平上对样品进行分类学统计。在门水平上,统计相对丰度前21的物种信息(图 5),PRRSV感染组和空白对照组的肺、十二直肠、空肠、回肠中,变形菌门(Proteobacteria)是优势物种,其中,感染组中变形菌门的占比大于空白对照组,分别占总序列的85.87%、89.85%、81.99%、66.35%;在感染组和空白对照组的盲肠、结肠、直肠中,厚壁菌门(Firmicutes)是优势物种,其中,感染组分别占总序列的70.74%、66.80%、65.80%,与对照组相比,盲肠(79.45%)、结肠(75.37%)厚壁菌门的含量较低,而在直肠(60.13%)中含量较高。发现PRRSV感染后变形菌门的相对丰度增加,厚壁菌门在所有样本中的相对丰度均有所下降。
在科水平上,肺及不同肠段之间优势物种不同(图 6),感染组与对照组相比,肺中巴斯德菌科(Pasteurellaceae)相对丰度从45.87% 下降到10.40%,假单胞菌科(Pseudomonadaceae)从9.46%增加到21.64%,十二直肠中假单胞菌科相对丰度从5.86%增加到30.66%,乳杆菌科(Lactobacillaceae)的相对丰度从21.73%下降到0.13%,空肠中巴斯德菌科从23.58%下降到21.88%,在感染组回肠中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是优势物种占比22.3%,而对照组占0.22%。在盲肠、结肠、直肠中,瘤胃菌科(Ruminococcaceae)为优势物种,感染组(盲肠:16.42%、结肠:16.96%、直肠:28.78%)较对照组(盲肠:32.26%、结肠:30.00%、直肠:28.83%) 的相对丰度均有所下降。
在属水平上(图 7),感染组的肺、十二指肠、空肠、回肠中不动杆菌属(Acinetobacter)(肺:17.33%、十二指肠:14.20%、空肠:20.53%、回肠:15.76%)的相对丰度明显高于空白对照组(肺:7.40%、十二指肠:9.79%、空肠:18.41%、回肠:10.97%);感染组盲肠、结肠、直肠的链球菌属(Streptococcus)(盲肠:13.66%、结肠:14.68%、直肠:1.51%)较空白对照组(盲肠:1.57%、结肠:0.24%、直肠:0.04%)也有明显的上升,柯林斯菌属(Collinsella)也有同样的趋势(感染组,盲肠:6.92%、结肠:4.51%、直肠:1.20%;空白对照组,盲肠:0.53%、结肠:0.42%、直肠:0.21%)。另外,乳酸菌属(Lactobacillus)在感染组中肺及所有肠段中都明显下降,且都处于在较低丰度水平(肺:0.17%、十二指肠:0.13%、空肠:0.65%、回肠:0.19%、盲肠:2.23%、结肠:1.66%、直肠:0.55%)。
Lefse分析统计用来描述组间差异显著的物种,分别展示了感染组和空白对照组中肺(图 8)、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠中差异显著的分类单元(LDA score>2,P<0.05)。其中,感染组乳酸菌属较空白对照组在各肠段中显著下降(图 9~14)。
2.2.4 Beta多样性分析 Beta多样性分析用来比较不同样本之间群落结构相似性的差异。PCA分析是基于属水平的群落组成结构进行的分析,进化中聚类相近的物种距离越近。结果表明,盲肠、结肠、直肠微生物聚类效果类似,十二直肠、空肠、回肠微生物聚类效果类似,说明其微生物组成较为相似,但是各样品在感染组和空白对照组之间存在差异(图 15A)。使用R对基于UniFrac距离矩阵分别进行NMDS分析,通过二维排序图描述群落样本的结构分布,NMDS分析也得出类似的结论(图 15B)。
荧光定量PCR结果显示,PRRSV病毒感染猪后,会引起肠道炎症因子的升高。IL-18在回肠、盲肠和结肠中有较高的表达量(图 16A)。IL-6在盲肠和结肠中有较高的表达量(图 16B)。病毒在菌群较多的回肠、盲肠和结肠促使更多的炎症因子释放。但是肺部炎症因子表达水平均降低(图 16C)。
PRRSV是威胁着我国乃至世界养殖业的发展的重要病原,引起母猪出现高热及繁殖障碍,仔猪呼吸困难,并伴随顽固性水样腹泻。病毒引起的呼吸道疾病对消化道的影响越来越受到关注。研究发现,流感病毒感染小鼠后可引起肠道菌群组成和结构的改变,且强毒株与弱毒株产生不同的菌群改变,而给小鼠灌服强毒株感染中存活小鼠的肠道菌群,可以提高小鼠在致命性感染中的存活率[17]。本研究结果发现,断奶仔猪感染PRRSV后,除有明显的呼吸道症状,尤其在静息状态下喘息更加明显,并伴随有厌食、腹泻等消化道症状。通过对肺和肠道菌群测序显示,感染病毒后增加了肺部的菌群种类,但是菌群种类在肠道中减少了。从菌群组成的相似度上看,小肠部分,十二指肠、空肠、回肠菌群相似度较高;大肠中的盲肠和结肠相似度较高。在感染病毒后,有益菌群乳酸杆菌在肺和肠道中均下降。
3.1 断奶仔猪感染PRRSV后对肺部微生物群落的影响肺与外界相通,是进行气体交换的重要器官,肺部微生物的组成结构与维持肺部健康相关[18]。肺癌患者,肺部微生物的多样性显著低于正常人,但部分物种丰度如厚壁菌门(Firmicutes)、韦荣球菌属(Vellionella)、链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和TM7等的丰度明显升高[19]。Garcia-Nuňez等[20]的研究证实了慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者中肺部微生物多样性的减少,主要是变形菌门和放线菌门的相对增加以及厚壁菌门和拟杆菌门的相对减少,并认为呼吸道中变形菌门和放线菌门相对丰度增加可以刺激产生更强烈的肺部炎症。
本研究结果显示,肺中菌群总的丰度上升,炎症因子表达水平下降。在门水平上,变形菌门等有害微生物的相对比例增加,而厚壁菌门等有益微生物的相对丰度下降;科水平上,感染PRRSV后巴斯德菌科相对比例明显下降,假单胞菌科比例明显上升,属水平上,乳酸菌属相对丰度显著下降。PRRSV感染后肺内微生物丰度的上升和有害菌群的增加可能与PRRSV引起免疫抑制,导致有害菌群增殖有关。
3.2 断奶仔猪感染PRRSV后对肠道微生物的影响肠道微生物与机体的关系密切,参与机体消化吸收,免疫代谢,疾病发生发展,保护中枢神经[21],参与促进结直肠癌、乳腺癌[22]及心脑血管等疾病[23]的发生等。由此可以看出,微生物群也是构成机体的免疫屏障的一部分。机体发生疾病或炎症反应时,会造成肠道微生物稳态的破坏,从而使疾病或炎症发生进一步恶化。慢性充血性心力衰竭会导致肠道菌群失调,肠道微生物中普氏杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)减少和瘤胃球菌(Ruminococcus gnavus)增多,同时肠道菌群失调也导致粪便和血浆代谢物发生显著异常[24]。研究表明,克罗恩病(Crohn’s disease, CD)患者富含乳酸杆菌,而溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)患者富含双歧杆菌,但柔嫩梭菌群均显著降低,产丁酸盐的肠道微生物在维持肠道免疫稳态起重要作用[25]。本试验通过对断奶仔猪各段肠道的分析中可以看出,PRRSV感染后肠道各段的微生物丰富度下降。小肠(十二指肠、空肠、回肠)与大肠(盲肠、结肠、直肠)的结构组成不同,其对微生物群的影响也不同。小肠各肠段间和大肠各肠段间微生物组成相似度高。门水平上,小肠变形菌门是优势物种,在感染PRRSV后含量明显增多。变形菌门的增多,导致肠道上皮功能障碍,也可以作为肠道菌群失衡的标志。而大肠中厚壁菌门是优势物种,感染PRRSV后含量降低,厚壁菌门的大多数细菌存在电子外排系统,有利于肠道微生物适应肠道环境[26]。科水平上,大肠的瘤胃菌科为优势物种,感染PRRSV后下降明显。属水平上,断奶仔猪感染PRRSV后各肠段乳酸菌属的丰度均有下降。乳酸菌属具有缓解肠道免疫应激、提高免疫力、维持肠道菌群平衡等作用[27-28]。综上所述,断奶仔猪PRRSV感染后导致变形菌门有害微生物的相对比例增加,而厚壁菌门等有益微生物的相对丰度下降,从而导致肠道免疫防御能力降低,增加其他病原菌入侵的可能性。本研究结果在一定程度上反映出在仔猪感染PRRSV后,一些机体共生菌、有益菌遭到破坏,造成菌群失衡的现象,肠道的炎症反应或许是导致肠道菌群改变的主要原因。一项通过测序研究感染PRRSV的猪的支气管肺泡灌洗液和盲肠中的微生物群的研究结果表明,感染猪中弯曲杆菌属和梭菌属等有害菌群丰度增加[29]。与本研究得出的结果类似,PRRSV感染会导致仔猪肠道有益菌群丰度减少,有害菌群丰度增加。另一项对PRRSV易感猪和非易感猪肠道菌群的研究表明,在PRRSV易感猪的肠道中螺旋体、变形菌和衣原体相对丰度增加,而拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度降低[30]。提示失衡的菌群反过来也可以增加对于病毒疾病的易感性。由此可见,菌群失衡与病毒感染之间可以互为因果。
3.3 在PRRSV感染过程中肺部和肠道之间的互作肠道菌群稳态与肺部感染之间存在双向作用。病毒感染导致的肺部疾病从而诱导肠道菌群失调,而肠道微生物失调后,也可以通过“肠-肺”轴影响肺部免疫应答。既往关于呼吸道病毒感染的研究表明,呼吸道病毒感染期间,由于机体内免疫因子水平改变[31],小鼠摄食量减少等因素引起肠道菌群的失调[32]。一项对于甲型H1N流感对德国长白猪的呼吸和粪便微生物组的影响的研究表明,甲型流感感染期间猪胃肠道微生物组的微生物丰富度和多样性显着改变,主要是普氏菌科的丰度增加,而梭菌科和毛螺菌科的丰度降低[33]。而肠道菌群失调对肺部疾病进程的影响往往体现慢性疾病的过程中。在溃疡性结肠炎和克罗恩病等炎症性肠病患者中,常常会出现感染性或非感染性的呼吸道炎症[34]。无论导致免疫系统失调首先开始的部位是肠道还是肺部,都会影响另一远端器官的变化,最终都会导致肺部和肠道在面临新的病原时抵抗力下降。在一项研究结果中显示,甲型流感病毒(IAV) 感染期间肠道微生物群的失调有利于呼吸道细菌重复感染[35]。而本研究结果显示,PRRSV感染的过程中,肠道上皮绒毛变短,肠道炎症反应明显。表明PRRSV引起感染的过程中,在引起肺部感染的同时,也导致肠道结构及菌群的改变,进而影响肠道菌群的功能。提示PRRSV致肺部感染与肠道之间存在一定的联系,也会通过“肠-肺”轴进行沟通,并可能进一步影响肺部疾病的发生发展,但具体作用途径和方式有待深入研究。
4 结论断奶仔猪感染PRRSV后引起肺部微生物和肠道微生物多样性及丰度的变化,导致肺部和肠道免疫水平的改变。
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(编辑 白永平)