沙门菌分布广泛,是极具有危害的食源性致病菌,2018年有数据显示,沙门菌感染可造成上亿人患病并导致近四十万人死亡[1],更棘手的是在抗生素的选择压力下,沙门菌耐药的情况越来越严重,目前已相继检出多重耐药菌株[2-4],如申永秀等[5]对不同来源的沙门菌进行药敏试验及耐药基因携带情况进行调查,发现耐受3种及以上抗生素的菌株占63.2 %。如果不能有效解决抗菌素耐药性问题,将会导致更大的伤亡以及经济损失[6-7]。噬菌体是一种可以特异性地感染细菌且具有严格宿主特异性的病毒,我国农业部2017年颁布的《全国遏制动物源细菌耐药行动计划》就明确把噬菌体列为抗生素替代品[8]。噬菌体可应用于食品沙门菌污染预防[9-10],还可构建工程噬菌体通过靶向抗性基因来逆转抗生素耐药性[11-12]。本试验分离纯化获得1株温和性沙门菌噬菌体PEA2-3,并对其进行生物学特性测定及生物信息学分析,为后续该温和性噬菌体的应用奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验菌株本试验涉及的耐药性大肠杆菌主要来源于华南农业大学家禽研究室分离鉴定与保存;本试验中使用的部分沙门菌由华南农业大学兽医学院馈赠。大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)DH5α购自广州围谷科技有限公司。
1.2 主要试剂噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒(Aidlab)购自新泽生物科技有限公司,丝裂霉素C、硫酸镁、PEG8000购自广州健阳生物科技有限公司;艾迪生(AIDISHENG) SM液、密理博(Merck millipore) 0.22 μm滤器购自广州剪刀手基因科技有限公司。LB琼脂培养基、LB肉汤培养基购自广东环凯微生物科有限公司。
1.3 噬菌体的分离纯化将野生型耐药菌挑取单克隆接种于LB液体培养基中,37 ℃振荡过夜,8 000×g离心1 min弃旧培养液后加入3倍体积新鲜培养液重悬培养3 h,并加入丝裂霉素C至终浓度为1 μg · mL-1、37 ℃ 120 r · min-1继续振摇8~10 h,8 000×g离心10 min,上清液过0.22 μm滤膜除菌,将过滤液梯度稀释,取200 μL稀释液与200 μL对数期的原野生型耐药菌混合,另加入70 μL硫酸镁溶液(MgSO4, 1 mol · L-1),与7~8 mL的LB半固体混合均匀倾倒双层平板,凝固后倒置37 ℃培养10~12 h,挑取噬菌斑后得到第一代纯化噬菌体。重复以上方法3次,即可获得纯化后的温和噬菌体。
1.4 噬菌体的电镜观察采用醋酸铀负染法[20]处理噬菌体,铜片置于20 μL浓缩噬菌体中吸附5 min后用取出于空气中直接干燥,滴1滴醋酸铀染液,染色2 min后滤纸吸干;滴加1滴醋酸铀染液中染色2 min,滤纸吸干,待干燥后放回铜网盒,在场发射电子显微镜中观察噬菌体颗粒形态。
1.5 噬菌体的生物学特性分析1.5.1 宿主谱测定 采用点滴法[21]检测噬菌体对不同来源72株沙门菌以及52株大肠杆菌的裂解情况:将LB半固体培养基与200 μL待测对数生长期菌液混合均匀,并加入70 μL硫酸镁溶液(MgSO4, 1 mol · L-1) 在普通LB固体培养基上,凝固后取噬菌体液5 μL进行滴板,静置30 min后移至37 ℃恒温培养箱8~12 h,观察是否出现噬菌斑。
1.5.2 最佳感染复数MOI测定 噬菌体按照MOI为10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 g若干个梯度分别加入已知浓度的指示菌混合,各3重复采用双层平板法过夜培养。计算出各感染复数下的噬菌体效价,以产生最高噬菌体滴度的混合比例作为最佳MOI。
1.5.3 一步生长曲线测定 取1 mL对数生长期的指示菌,与已知效价的适量噬菌体清液按最佳感染复数混合,37 ℃中水浴10 min,10 000×g离心1 min,弃上清,用SM缓冲液重悬,再次离心并弃上清中止噬菌体吸附过程。取5 mL液体培养基重悬,37 ℃,220 r· min-1震荡培养。每10 min取200 μL培养液至120 min,次日统计各时刻的噬菌体效价,绘制噬菌体的一步生长曲线。
1.5.4 热稳定性和氯仿耐受性测定 不同温度的水浴锅中提前预热900 μL液体培养基,各管的培养基温度基本稳定后,将100 μL噬菌体上清液加入,孵育1 h,取上述液体梯度稀释计算噬菌体不同温度孵育后的效价;又取3 mL纯化培养后的噬菌体上清液,加入30 μL氯仿常温振荡30 s,使之混合均匀,在37 ℃摇床振荡培养。在6、12、18、24 h这4个时间点,取出300 μL,8 000×g离心10 min,收集上清液进行梯度稀释后测定各时间段噬菌体效价。
1.5.5 噬菌体再溶原条件测定 取1 mL培养到对数生长期,OD600约为0.5~0.6的宿主菌,以感染复数为100、10、1、0.1、0.01加入噬菌体孵育5 min。用接种环蘸少量培养后液体于LB固体平板上划线,37 ℃培养箱过夜。挑取单克隆,用噬菌体特异性引物进行PCR检测(表 1)。呈阳性的菌再次划线培养,并以上述步骤进行菌液PCR检测,重复3次。将稳定检测为阳性的菌落扩大培养用丝裂霉素C诱导分离鉴定,确认噬菌体再溶原化。
取10 mL浓缩后的噬菌体原液,加入20 μL RNase和20 μL DNase 37 ℃水浴30 min。加入2 mL噬菌体沉淀液,置冰上30 min。4 ℃,10 000×g离心30 min,弃上清后干燥。加入500 μL裂解缓冲液,吹打重悬,加入100 μL 20 % SDS,70 ℃温育10 min后冰上冷却。加入100 μL杂质沉淀液,4 ℃ 13 000×g离心10 min。转移上清后,加入0.7倍体积的异丙醇,静置15 min,4 ℃ 13 000×g离心20 min,弃上清。加入75 %无水乙醇,4 ℃ 13 000×g离心15 min,重复清洗2次。加入40 μL提前预热至65 ℃的去离子水,重悬溶解,放置-20 ℃保存。
1.7 噬菌体基因组学分析通过DNAstar软件中的Editseq对噬菌体的基因组进行一般性分析,包括4种碱基含量、GC含量;采用在线网页RAST对全基因组序列进行基因预测。利用DNAstar软件中的MegAlign对噬菌体PEA2-3的基因组进行同源性分析。采用在线网页工具ResFinder预测基因组中是否存在抗生素抗性基因。采用在线网页工具VirulenceFinder筛查噬菌体基因组中是否存在抗生素抗性基因和毒力基因,采用CG View Srever绘制基因组图谱。
2 结果 2.1 PEA2-3的分离纯化与透射电镜观察结果使用丝裂霉素C终浓度为1 μg · mL-1诱导1株野生型耐药大肠杆菌[13-14],成功从中分离出温和噬菌体,将此噬菌体命名为PEA2-3。经3次双层平板纯化培养后形成了均一、透明、边缘整齐无光晕、直径约1 mm的噬菌斑(图 1a)。使用醋酸铀负染噬菌体颗粒后(图 1b、1c),透射电子显微镜显示出PEA2-3头部宽约为61 nm,尾长93 nm,头部偏大,均为单尾但无类似于T4噬菌体的尾丝结构,属于有尾噬菌体目。
2.2.1 宿主谱测定 通过点滴法测定噬菌体PEA2-3的裂解谱,发现该噬菌体能够裂解实验室内储存的不同来源(猪源、鸡源、鸭源和人源)的沙门菌(38/72)及耐药性大肠杆菌(23/52),是1株宽裂解谱噬菌体。噬菌体PEA2-3跨宿主且宽谱的特性,在生物防治及临床上具有潜在的应用价值。
2.2.2 最佳感染复数MOI测定 噬菌体按照不同MOI感染宿主菌,利用双平板法计算出各感染复数的噬菌体效价,以产生最高噬菌体滴度的混合比例作为最佳感染复数MOI。结果显示,噬菌体的最佳感染复数为0.01,在此MOI值下噬菌体效价可达2.3×1010PFU · mL-1(表 2)。
2.2.3 一步生长曲线测定 PEA2-3感染宿主菌后的20 min内没有显著变化,从20到90 min内持续上升,爆发期约为80 min,90 min后效价部分下降进入稳定期,可能是部分噬菌体进入宿主菌内转换为溶原周期所致。如图 2所示,PEA2-3感染宿主潜伏期为20 min,裂解期约为80 min,裂解量为19.6。
2.2.4 热稳定性和氯仿耐受性测定 使用初始噬菌体浓缩液为2.6×1012 PFU · mL-1做温度耐受试验,结果如图 3a所示。PEA2-3在20~30 ℃孵育1 h滴度没有明显变化,40~50 ℃滴度虽然有所下降,但依然能够保持在较高滴度(4.9×1011 PFU · mL-1),50 ℃ 1 h后还有为2.4‰噬菌体保持活性(6.2×109 PFU · mL-1);当温度超过60 ℃以上,噬菌体的效价急剧下降,1 h后仅剩为5.6×104 PFU · mL-1,当高温70 ℃时,30 min噬菌体已经全部失去活性。说明该噬菌体对温度有一定耐受性,但高温会使其迅速失活。另外,由于氯仿对脂类物质的高度亲和性,该噬菌体进行氯仿处理后的效价没有下降趋势,使用初始滴度为1.7×1010 PFU · mL-1噬菌体液测定,在24 h内依然保持与原始滴度差别不大。结果如图 3b所示,说明噬菌体PEA2-3的结构蛋白中可能未含有脂类物质,对于后续利用氯仿处理溶原菌促子代噬菌体释放提供了有利条件。
2.2.5 噬菌体再溶原条件测定 在试验中MOI为50感染DH5α菌株时能有效促进噬菌体的溶源化。将PEA2-3噬菌体特异性检测引物检测结果为阳性的菌落连续划线培养三代,其扩摇后利用丝裂霉素C同样浓度条件下可再次诱导分离获得噬菌体(图 4)。
2.3.1 噬菌体基因组一般性分析 噬菌体PEA2-3经过测序拼接,基因组全长52 770 bp,全基因组已经提交至NCBI的GenBank数据库中,序列登录号为MW508890。经DNAstar软件分析其碱基分布,其中A(27.11%)、T(26.90%)、G(22.98%)、C(23.01%),GC含量为(45.99%)。噬菌体PEA2-3基因组一共含有73个开放阅读框ORF,不存在tRNA基因。RAST结果有65个CDS(89.04%)被赋予假定性蛋白功能,仅有8个CDS(10.95%)被赋予已知的功能。其中最长的ORF为gp47,编码噬菌体尾丝形成蛋白GpI,包含951个氨基酸;最短的ORF为gp69,编码的是假设性蛋白,包含41个氨基酸(图 5)。
2.3.2 噬菌体PEA2-3全基因组序列分析 利用NCBI在线数据库进行BLAST比对,发现噬菌体PEA2-3全序相似性较高多为沙门菌噬菌体,同样也有大肠杆菌噬菌体。其中相似性最高的1株是四川农业大学分离的Salmonella phage LSE7621(MN379740),达到98.37%;然后Salmonella phage 8-19(MN379740)序列相似性98.18%。另外,同样与大肠杆菌噬菌体Escherichia phage JEP7(MT764207.1)有较高的相似性,并与大肠杆菌ABW_A19(CP067310.1)全基因组片段覆盖范围为98%,相似性为96.17%,进而可以推测该菌中有前噬菌存在,极有可能在此菌诱导分离噬菌体。与本试验结果相似,温和噬菌体PEA2-3是从大肠杆菌EA2-3菌株诱导分离得到的,从遗传信息学角度为沙门菌噬菌体,同时它也存在于大肠杆菌基因组内。利用MEGA 7软件基于噬菌体全基因序列以及末端酶大亚基序列构建噬菌体PEA2-3最大似然进化树(maximum likelihood tree,ML),结果如图 6、7所示。
基于噬菌体全序构建进化树研究分析表明,噬菌体PEA2-3与沙门菌噬菌体Salmonella phage vB_SenM_PA13076(MF740800)形成了一个亚进化枝。使用末端酶大亚基(ORF54)的系统发育分析表明,噬菌体PEA2-3与全序相似性最高的沙门菌噬菌体Salmonella phage LSE7621(MN379740)具有密切关系,且与Salmonella phage brunost (MT074441)和Salmonella phage vB SenMPA13076 (MF740880)进化关系接近。与PEA2-3噬菌体类似的噬菌体与其他报道的属不同,在2020年ICTV将这类噬菌体定义为罗斯蒙特病毒属(Rosemountviru)[15]。这种被称为罗斯蒙特病毒的新属目前仅较少文献报道,希望能分离获得更多的罗斯蒙特病毒属噬菌体以供研究使用。
3 讨论诱导和分离溶原性噬菌体需要先打破前噬菌体和宿主的联系,使溶源性细菌的特异性受体蛋白阻止原噬菌体裂解性基因的转录,通过这种机制来抑制子代原噬菌体的产生以及进一步裂解的发生[16-17]。原噬菌体只要有足够的活性噬菌体阻遏物和调节元件,就可以保持在细菌内处于溶原性状态,作为一段细菌基因组片段跟随它复制甚至能够持续无数代[18-19]。本试验中利用丝裂霉素C诱导分离获得的PEA2-3噬菌体是1株宽裂解谱噬菌体,PEA2-3能够跨种属裂解沙门菌以及大肠杆菌,具有较好的应用前景,以往文献中亦有分离类似宽裂解谱噬菌体[20-21]。且PEA2-3能较稳定地处于裂解周期,有利于进行噬菌体生物学特性的测定,在试验中以较高MOI感染宿主细菌时能有效促进它的溶源化,PEA2-3的效价较高,具有较好的应用基础,例如利用经基因改造的工程噬菌体再溶源化递呈CRISPR系统进入耐药菌内[12, 22-23]。研究表明,裂解-溶原决策会受到某些随机事件的影响,如本研究提示PEA2-3噬菌体的数量可能对它调控其溶源-裂解途径的转换有重要影响,可以推测PEA2-3噬菌体有类似群体感应的现象[24-25]。目前有研究通过荧光标记和单分子研究技术同样显示了类似的结果,即对感染单一细胞的单个λ噬菌体进行全程示踪,发现噬菌体数量与感染的细菌数量的比值较低时,其进入溶原状态的概率较低,这可能是由于噬菌体溶原促进蛋白质在较大的细胞体系中被稀释的结果;而噬菌体数量与感染的细菌数量的比值较高,噬菌体倾向于整合到细胞内,最终导致溶原化细菌的形成[27]。
PEA2-3是新分离噬菌体,各基因功能目前尚未完全掌握,利用在线工具SWISS-MODEL对假设性蛋白比对发现其中gp31、gp32、gp33是与Mu噬菌体尾纤维组装蛋白U复合体及其伴侣相似度高区域(20534-22926 bp)。但PEA2-3结构蛋白模块基因、基因组包装模块基因、核酸代谢和复制模块基因、裂解模块基因、溶原模块基因其他功能模块基因等没有足够数据库信息支持分类,采用在线网页工具ResFinder和VirulenceFinder预测噬菌体PEA2-3全基因组中不存在抗生素抗性基因或者毒力基因,这在基因层面上解析了该噬菌体不存在有毒有害基因,为以后噬菌体PEA2-3的开发和应用提供支持和安全,避免了温和噬菌体应用导致抗性基因以及毒力基因的广泛传播[26-28]。
4 结论本研究通过丝裂霉素C诱导分离并鉴定1株野生温和噬菌体,将其命名为PEA2-3,基因组全长52 770 bp,序列登录号为MW508890。该噬菌体为有尾噬菌体目,罗斯蒙特病毒属;能裂解沙门菌及大肠杆菌,属于宽裂解谱噬菌体。
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(编辑 范子娟)