2. 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所, 杭州 310021
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
鹅星状病毒(goose astroviruses，GAstV)是一种可对雏鹅造成极大危害的传染病，自2016年在我国湖南首次出现并开始呈现蔓延趋势，陆续在黑龙江、山东、河南、安徽、江苏、福建、广东等主要养鹅地区暴发[1-6]。该病是一种以痛风为主要症状的传染病，患病雏鹅精神沉郁，卧地倦动，采食及饮水量降低，严重影响雏鹅的生长发育，剖检可见患病雏鹅的胸、腹腔及关节腔内出现严重尿酸盐沉积[7-10]。该病除能够进行种间传播外，还能进行垂直传播[11-12]，对20日龄以内雏鹅的致死率部分可高达50%以上[7, 12]，造成了巨大的经济损失。已有报道显示该病毒的两种基因型(GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ)均具有致死能力[7, 13-15]，其感染情况存在地区差异，或GAstV Ⅱ单一感染[16-17]，或GAstV Ⅰ、GAstV Ⅱ混合感染[18]。本研究室于2020年在浙江省同一发病鹅群中同时检测到了两种基因型，并分离得到病毒株ZJC14(GAstV Ⅰ)和ZJLD(GAstV Ⅱ)[19]。目前尚无有效的针对两种基因型的疫苗、抗体或抗病毒药物用来有效控制该传染病，故加强对GAstV的病原检测及监测、及时隔离扑杀患病雏鹅成为控制该病的防控重点。该病的单一基因型荧光定量检测方法存在工序复杂、成本高、费时费力等问题，因此建立一种能够同时检测GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ的荧光定量检测方法显得尤为重要。本研究根据GenBank已发表的GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ基因组中RdRp基因序列设计特异性引物和探针，建立一种双重荧光定量RT-PCR检测方法，以达到在同一反应体系中同时定量检测GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ的目的，为临床病原检测及监测提供更加高效精准的技术支撑。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 病毒株和临床样品 GAstV Ⅰ阳性毒株(ZJC14毒株)和GAstV Ⅱ阳性毒株(ZJLD和ZJCX毒株)由本实验室分离保存，鹅细小病毒(goose parvovirus，GPV)、鸭瘟病毒(duck plague virus，DPV)、鹅坦布苏病毒(goose-origin tembusu virus，GTMUV)、鹅呼肠孤病毒(goose-origin reovirus muscovy duck reovirus，GRV)、H9N2亚型禽流感病毒(AIV)均由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室保存。采集自江浙地区部分鹅养殖厂的疑似病例样本作为本实验的临床检测样品。
1.1.2 试剂及细胞 磁珠法病毒RNA抽提试剂盒购自济帆科技生物有限公司(中国广州)；MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0、DNA Marker 2000购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa，中国大连)；One Step PrimeScriptTM Ⅲ RT-qPCR Mix购自TOYOBO(日本)；HiScript® Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)、DH5α感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(中国南京)；pEASY®-T5 Zero Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司(中国北京)。
1.2 方法1.2.1 引物及探针的设计合成 根据GenBank上发布的两种不同基因型GAstV基因序列以及本实验室分离鉴定的毒株ZJLD(登录号：MZ819184.1)和ZJC14(登录号：MZ819185.1)的基因序列，选取保守序列RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)区域，利用Oligo7.0软件分别设计2对特异性qPCR引物和探针(表 1)，引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。
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表 1 GAstV Ⅰ型和GAstV Ⅱ型的特异性探针及特异性引物 Table 1 Specific probes and primers for GAstV Ⅰ and GAstV Ⅱ |
1.2.2 病毒核酸提取 取GAstV毒株ZJC14、ZJLD和ZJCX的阳性样品各200 μL，按照抽提试剂盒的说明，使用磁珠法自动提取纯化系统抽提样品核酸，-80 ℃保存备用。DPV、GPV、GTMUV、GRV、AIV(H9N2)的基因组RNA或DNA提取方法同上。
1.2.3 标准品的制备 参照GenBank上发布的GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ的RdRp基因序列，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品。使用上述引物扩增目的片段，将目的片段分别连接到pEASY®-T5载体上，分别命名为T5-GⅠ、T5-GⅡ，于-20 ℃保存备用。根据测定的质粒浓度和拷贝数计算公式，计算出T5-GⅠ和T5-GⅡ的拷贝数分别为4.33×1010和6.49×1010copies·μL-1。
1.2.4 荧光定量RT-PCR反应条件的优化 20 μL反应体系：One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix(2×)10 μL, GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ的PCR Forward Primer分别为0.4 μL、PCR Reverse Primer分别为0.4 μL、Probe分别为0.4 μL，引物浓度和探针浓度分别稀释为40、20、10和5 μmol·L-1用于浓度条件优化，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ 0.04 μL、模板2 μL，用DEPC水补足至20 μL。充分混匀，使用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System扩增。反应条件为52 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环，收集“FAM”和“CY5”荧光信号。
1.2.5 特异性试验 分别以GAstV ZJC14株和GAstV ZJLD株，及参考毒株GPV、DPV、GTMUV、GRV、AIV(H9N2)提取的病毒DNA或RNA为样品，以DEPC水作为阴性对照，按照“1.2.4”所述反应体系及条件进行扩增，验证各引物探针和鉴别诊断方法的特异性。
1.2.6 灵敏性试验 使用DEPC水对标准品T5-GⅠ和T5-GⅡ进行10倍比稀释(10-1~10-10)，每个稀释度的标准品各取1 μL制备混合模板，按照“1.2.4”所述反应体系及条件进行扩增，验证检测方法的敏感性。同时使用本试验所建立的双重RT-PCR检测方法[20]进行平行试验，电泳后观察并记录结果，比较两种方法的检测敏感度。
1.2.7 重复性试验 应用该检测方法，进行重复性验证试验。取稀释度为10-2、10-4、10-6、10-8的标准品混合模板，进行重复性检测，比较同组结果的变异系数(CV)。
1.2.8 临床样品检测 应用建立的双重探针法荧光定量RT-PCR方法和已建立的双重RT-PCR方法[20]及单基因型荧光定量RT-PCR方法对本实验室所收集到的90份疑似GAstV阳性的雏鹅组织进行检测，设置标准品T5-GⅠ和T5-GⅡ为阳性对照，DEPC水为阴性对照，对比3种方法对阳性样品的检出准确度。
2 结果 2.1 反应体系和反应条件完成对GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ引物及探针浓度的优化配比，确定该方法的20 μL反应体系：One Step PrimeScript Ⅲ RT-qPCR Mix(2×)10 μL、GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ PCR Primer各0.4 μL (10 μmol·L-1)、TaqMan Probe各0.4 μL(10 μmol·L-1)、ROX Reference Dye or Dye Ⅱ 0.04 μL、模板2 μL，DEPC水补充至20 μL。扩增条件：52 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，进行40个循环，收集荧光强度信号。
2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立为准确定量样品中所含病毒拷贝数，将标准品进行10倍梯度稀释后进行Taqman荧光PCR反应。根据标准品的病毒拷贝数和Ct值，使用绘图软件(GraphPad Prism 5)绘制出标准曲线，结果呈现出良好的线性关系，具体如下：y1=-3.276 6x+41.634，y2=-3.292 8x+40.818，相关系数R12=0.999 4，R22=0.999 2。
2.3 检测结果的判定根据荧光定量PCR反应收集到的荧光信号分析处理数据，得到其扩增曲线及Ct值。以能检测到的最低拷贝、阴性对照所对应的Ct值及其扩增曲线作为判定阳性的依据，根据所对应的荧光信号的种类判定对应的基因型。结果判定标准：待测样品的“CY5”荧光信号超过阈值且Ct值≤30，同时扩增曲线为平滑的“S”型，则判定该样品为GAstV Ⅰ阳性；若“FAM”荧光信号超过阈值且Ct值≤30，同时扩增曲线为平滑的“S”型，则判定该样品为GAstV Ⅱ阳性，否则判定为阴性。
2.4 特异性试验应用本方法分别对GPV、DPV、GTMUV、GRV、AIV与本实验室分离株ZJCX株进行特异性试验验证。结果显示，GPV、DPV、GTMUV、GRV、AIV均不能有效扩增，而分离株ZJCX及本试剂盒开发所用的毒株ZJLD和ZJC14能够有效扩增，并能够区分GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ的不同基因型(图 1)。该结果表明，本试验建立的试剂盒的特异性为100%，具有强特异性，方法中不同基因型的引物和探针能够与对应基因型病毒核酸特异性结合，与其他常见鹅源病毒核酸均无交叉反应。
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分别用GPV、DPV、GTMUV、GRV、AIV及GAstV(ZJCX、ZJLD、ZJC14)的核酸作为模板进行扩增，只有GAstV(ZJCX、ZJLD、ZJC14)能够产生有效扩增，其他病毒均为阴性 The nucleic acids of GPV, DPV, GTMUV, GRV, AIV and GAstV (ZJCX, ZJLD, ZJC14) were used as templates for the test, and only GAstV (ZJCX, ZJLD, ZJC14) could produce effective amplification, and other viruses were negative 图 1 GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ荧光定量PCR特异性检测结果曲线 Fig. 1 Specific detection curves of real-time PCR for GAstV Ⅰ and GAstV Ⅱ |
以不同稀释度的混合模板为样品，使用本方法进行检测，并使用普通双重PCR进行同步检测作为对比。结果显示，本方法能够检测到43.3 copies·μL-1的GAstV Ⅰ标准品和6.49 copies·μL-1的GAstV Ⅱ标准品，并且在100~109这10个数量级的拷贝范围内均能表现出良好的线性关系(图 2)，表明该方法有极高的灵敏度。
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1~10.分别将标准品按100~109倍进行稀释，以此为模板进行扩增后的反应曲线，上方为GAstV Ⅰ的反应曲线，下方为GAstV Ⅱ的反应曲线，每个反应3个重复 1-10. The standard products were diluted by 100-109 times respectively, and use them to amplification, the upper picture was the reaction curve of GAstV Ⅰ, and the lower was GAstV Ⅱ. Each reaction was repeated three times 图 2 GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ荧光定量PCR灵敏性检测结果曲线 Fig. 2 Sensitivity detection curves of real-time PCR for GAstV Ⅰ and GAstV Ⅱ |
以稀释度为10-2、10-4、10-6、10-8的混合模板作为待测样品，利用本方法进行重复性试验验证，一次试验中的3个重复样品对应的变异系数(CV)均小于0.5%，说明该方法具有极高的重复性。
2.7 临床样品检测使用本方法对90份疑似阳性的临床样品进行检测，结果有78份样品为星状病毒阳性，阳性率为86.7%。阳性样品中GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ均为阳性的有5份，GAstV Ⅱ单阳性的有72份，仅有1份为GAstV Ⅰ单阳性。本方法与单荧光定量RT-PCR相比较(表 2)，阳性样品的检出准确度是相同的；同时使用本实验室已建立的双重RT-PCR检测方法对这90份样品进行检测，结果有13份样品因病毒拷贝数较低被鉴定为阴性(表 3)，表明本方法对阳性样品的检出准确度更高。
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表 2 双重qRT-PCR与单qRT-PCR之间阳性检出符合率(C.R.)比较 Table 2 Comparison of positive detection coincidence rate between double qRT-PCR and single qRT-PCR |
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表 3 双重qRT-PCR与双重RT-PCR检测结果比较 Table 3 Comparison the detection results of double qRT-PCR and double RT-PCR |
GAstV作为能够引起雏鹅痛风的新发疫病病原，近几年来给我国鹅养殖产业带来了巨大的经济损失。此外，已有的流行病学调查显示，GAstV也可引起不同品种雏鸭发病及实验室环境下感染SPF鸡，因此及时发现并鉴定该病原有助于对GAstV的临床防控。本实验室通过对患病雏鹅的基因组高通量测序发现，临床样品中的GAstV存在有两种不同的基因型[20]。通过进一步的病毒基因组序列分析发现，这两种基因型的病毒虽都属于GAstV，但其核苷酸序列差异较大，分别为以ZJC14、FLX、AHDY株为代表的GAstV Ⅰ型和以ZJLD、GD和SDPY株为代表的GAstV Ⅱ型，且均可感染20日龄以内的雏鹅，部分检测结果显示发病雏鹅内存在两种基因型混合感染的情况[19]。
传统的病毒检测方法如病毒分离、电镜观察、血清学检测等存在费时费力、操作难度高、特异性较差、敏感度差等诸多不足，故准确快速并且能够定量检测的方法在病原诊断上具有巨大优势，尤其是对多种不同病原或相同病原不同基因型混合感染情况的快速鉴别。目前，已有研究人员建立了GAstV的荧光定量PCR检测方法[21-23]，但都是针对单一病原展开的检测，不能同时检测两种基因型的病毒。鹅星状病毒作为一种新发病原，目前对其研究较少，发病机制也尚不清楚，因此建立一种快速准确的检测该病毒且能区分基因型的荧光定量探针检测方法，可实现操作便利，结果可靠的目的，也具有临床推广应用的价值。
GAstV两种基因型的基因组均由3个开放阅读框构成，分别为ORF1a、ORF1b和ORF2，分别编码丝氨酸蛋白酶、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)和病毒衣壳蛋白[24-25]。本方法选取更为保守的RdRp区域基因序列作为检测的靶基因设计特异性引物和探针，建立了一步法双重TaqMan荧光定量PCR方法。该方法操作简单，可以实现RNA为检测模板，在同一反应体系中反转录并扩增检测两种不同基因型的GAstV。经对反应体系和条件进行优化，敏感度更高，最低可检测出43.3 copies·μL-1的GAstV Ⅰ和6.49 copies·μL-1的GAstV Ⅱ。而且检测的特异性强，不会被其他鹅源病毒核酸所干扰。应用该方法对临床样品进行检测，发现目前引发GAstV感染的主要病原依然是GAstV Ⅱ型病毒，GAstV Ⅰ和GAstV Ⅱ混感情况也同时存在；而GAstV Ⅰ单独感染的情况较少。本试验所建立检测方法在临床应用中的结果也与当前已有的报道相互印证。
4 结论本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法具有较高的敏感性，GAstVⅠ和GAstVⅡ的最低病毒检出量分别为43.3、6.49 copies·μL-1；对其他的鹅源病毒基因组在同等条件下检测均为阴性；可用于临床GAstVⅠ和GAstVⅡ的快速鉴别诊断，也可用于两种基因型GAstV的定量分析。总之，本方法具有敏感、特异、重复性好等特点，能够为GAstV的综合防控提供高效、精准的鉴别检测手段，为该病在鹅养殖区的监控及大规模流行病学调查提供重要技术支撑。
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(编辑 白永平)