2. 甘肃农业大学动物医学院, 兰州 730070;
3. 云南省畜牧兽医科学院 云南热带亚热带动物病毒病实验室, 昆明 650224
2. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
3. Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory, Yunnan Animal Science and Veterinary Institute, Kunming 650224, China
给易感动物接种疫苗是防控口蹄疫(foot-and mouth disease, FMD)传播的最经济和有效的手段,各国研究人员为此开发了诸多种类的疫苗:弱毒疫苗、灭活疫苗、VLPs疫苗、核酸疫苗和活载体疫苗等[1]。其中,VLPs是由病毒的衣壳蛋白自组装成的与天然病毒粒子相似但不含病毒核酸的空壳结构,具有很好的安全性,并可用于鉴别诊断自然感染与疫苗免疫动物(differentiation between infected and vaccinated animals, DIVA),VLPs接种后往往能诱导持久中和抗体和其他免疫反应[2-3],是安全、高效的新型基因工程疫苗[4]。目前,多个表达系统均可生产FMD VLPs[5-8],Guo等[9]借助SUMO蛋白可辅助蛋白质折叠的特性,构建了在原核系统表达的FMD VLPs,可达到与灭活疫苗相似的免疫效力,极大降低了疫苗生产成本。
FMD VLPs存在耐热性不足的问题,疫苗在储存和运输过程中必须全程冷链,这给临床应用带来了一定的局限。生物矿化是生物选择性的从周围环境吸收元素并将其转化为具有一定结构和功能的矿物的过程[10],例如,软体动物的贝壳可以为其提供对外界恶劣环境的防护。Wang等[11]利用这一技术为EV71弱毒疫苗“穿”上矿化壳,极大改善了疫苗的耐热性,且不影响疫苗的免疫效果,同时避免疫苗抗原受热降解造成的免疫失效,此后生物矿化用于疫苗的研究层出不穷。受此启发,本实验室尝试采用生物矿化技术来解决FMD VLPs的热稳定性问题[12]。本研究将矿化疫苗免疫猪和牛,比较了矿化VLPs与普通VLPs诱导体液和细胞免疫应答的差异,发现不同血清型的矿化VLPs可以联合使用,为矿化VLPs疫苗免疫剂量和免疫程序等方面的研究提供了数据支撑。
1 材料与方法 1.1 实验动物12头,60日龄(35 kg±5 kg)的大白猪(已接种猪瘟疫苗和猪圆环病毒病疫苗,未接种口蹄疫疫苗)由临洮县某种畜养殖场提供;16头,6月龄(165 kg± 10 kg)的黄牛(未接种口蹄疫疫苗)由武威市某种养专业农民合作社提供。所有动物的3ABC抗体检测均为阴性(图 1),猪的A、O型液相阻断ELISA抗体效价均不高于1∶8, 牛的A、O型液相阻断ELISA抗体效价不高于1∶16(图 4),所有动物均符合用于口蹄疫疫苗效力检验的要求标准。
表达His-SUMO与FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3的重组融合蛋白的菌种、表达SUMO蛋白酶的菌种、仓鼠肾成纤维细胞(BHK-21)、抗FMDV结构蛋白的猪血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫防控技术创新团队保存。FMDV/O/China99和FMDV/A/WH/2009均由国家口蹄疫参考实验室菌毒种库保存。口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒和口蹄疫A型和O型LPBE抗体检测试剂盒购自兰州兽研生物科技有限公司;Bovine IFN-γ ELISA kit与Bovine IL-4 ELISA kit购自欣博盛生物科技有限公司;Porcine IFN-γ ELISpotPLUS kit(HRP)购自Mabtech;HRP标记的兔抗猪抗体购自SIGMA;猪外周血淋巴细胞分离试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;PMA(佛波肉荳蔻醋酸)和Ionomycin(离子霉素)购自Biolegend;Montanide ISATM 201佐剂由法国Seppic公司馈赠;96孔U型板购自康宁;PierceTM BCA Protein Assay Kit购自ThermoFisher Scientific。
1.3 A型、O型FMD VLPs纯化与仿生矿化1.3.1 VLPs纯化与鉴定 按照实验室已有方法[9]分别对His-SUMO与FMDV结构蛋白VP0、VP1、VP3的重组融合蛋白进行表达、Ni柱层析纯化、酶切去除标签,并将所获得的结构蛋白置于组装缓冲液(20 mmol·L-1 Tris-HCl,500 mmol·L-1 NaCl,1 mmol·L-1 CaCl2,pH 8.5)过夜组装成VLPs。随后通过SDS-PAGE和免疫印迹分析(Western blot, WB)鉴定表达和纯化的VLPs。
1.3.2 VLPs矿化与鉴定 使用BCA蛋白定量试剂盒调整VLPs的浓度并按下列方法完成FMD VLPs的矿化:将蛋白加入到硅酸盐试管中,然后加入磷酸盐溶液,并在4 ℃,5 000 r·min-1下搅拌30 min; 加入钙盐溶液, 并在4 ℃,5 000 r·min-1搅拌2 h。将溶液在16 000 r·min-1离心10 min,下层沉淀为CaP-VLPs,上清为未矿化的VLPs。收取上清并使用BCA试剂盒测蛋白浓度,计算最终的矿化效率。通过透射电子显微镜观察VLPs和矿化VLPs的超微结构:分别吸取10 μL的VLPs和CaP-VLPs滴在培养皿上,取铜网正面朝下盖在液滴上,5 min后取走铜网并吸去多余液体,滴加CaP-VLPs的铜网晾干后直接使用透射电镜(日立,HT7700)进行观察,滴加VLPs的铜网需要使用2%的磷钨酸进行负染后再进行观察。
1.4 疫苗制备及免疫分组疫苗制备:将矿化蛋白以质量比1∶1的比例缓慢滴加到ISA 201佐剂中,用IKA T10均质机以5 000 r·min-1的速度混匀15 min。乳化完成后的疫苗用于免疫猪和牛,动物分组和免疫剂量见表 1、表 2。
1.5.1 猪和牛血清中特异性抗体 使用口蹄疫A型和O型LPBE抗体检测试剂盒检测疫苗免疫动物的血清特异性抗体。
1.5.2 牛血清中和抗体检测 免疫14 d后的牛血清于56 ℃作用30 min灭活,将用含1% 双抗的无血清DMEM按照1∶4倍比稀释至1∶512,并设置回归对照;将病毒用含1%双抗的无血清DMEM稀释至200 TCID50·0.1 mL-1,等体积与稀释血清混合后在37 ℃温箱中作用1 h;将病毒的浓度分别调整为0.2 TCID50、2 TCID50、20 TCID50和200 TCID50后加入上述板中;每孔接种1×106个BHK-21细胞,5% CO2,37 ℃温箱中孵育72 h。在倒置显微镜下观察细胞病变并统计50%的细胞病变(CPE50),按照Reed-Muench方法统计血清的中和抗体效价(该中和抗体效价的检测过程在生物安全三级实验室完成)。
1.6 ELISpot检测猪外周血淋巴细胞分泌的IFN-γ首先采集免疫28 d后矿化的O型FMD VLPs组、O型FMD VLPs组以及PBS组试验猪的抗凝血,使用猪外周血淋巴细胞分离试剂盒分离外周血中的淋巴细胞,稀释后的IFN-γ(5 μg·mL-1)抗体加入Pre-coated MSIP white plate中4 ℃过夜结合;洗涤,加入O型FMD VLPs(10 μg·mL-1)和细胞悬液(1×106个·孔-1)避光培养24 h;洗涤,依次加入一抗(0.5 μg·mL-1)和二抗Streptavidin-HRP(1∶1 000稀释,50 μL·孔-1)并室温避光孵育1 h;洗涤后加入TMB,显色后清洗晾干,使用酶标仪进行计数。
1.7 免疫牛血清中细胞因子检测使用Bovine IFN-γ ELISA kit与Bovine IL-4 ELISA kit检测牛免疫第14天时血清中的IL-4、IFN-γ含量。
1.8 统计学分析文章图片由Graphpad 8.0软件生成,数据通过SPSS22软件使用单因素方差分析(One-way ANOVA),当P < 0.05表示差异显著,P < 0.01时表示差异极显著。
2 结果 2.1 FMD VLPs纯化O型FMD VLPs由FMDV的3个结构蛋白(VP0、VP3和VP1)经体外组装而成,SDS-PAGE结果显示,目的蛋白酶切前后的大小与预期的蛋白条带位置基本一致(图 2A),随后WB试验中观察到相同大小的蛋白条带,说明成功获得纯化的目的蛋白(图 2B)。A型的FMD VLPs同样使用这两种方法进行鉴定(图 2C和图 2D)。
使用钙盐溶液和磷酸盐溶液对FMD VLPs进行矿化处理,通过透射电镜观察VLPs和CaP-VLPs的超微结构。如图 3所示,FMD VLPs的粒径约为30 nm,CaP-VLPs的粒径大小为80~150 nm,这是因为矿化VLPs被磷酸钙壳层包封后,粒径显著增加,说明成功获得了CaP-VLPs。
为探究矿化VLPs与普通VLPs两种疫苗诱导体液免疫应答的差异,将A型、O型VLPs疫苗和矿化A型、O型VLPs疫苗免疫猪(表 1)。随后采用LPBE比较了两种疫苗在免疫猪后产生的特异性抗体水平,测得的血清抗体效价与动物攻毒保护结果呈良好的正相关[13-14]。结果显示(图 4),在免疫前期,动物血清内的抗体水平迅速上升,并在第28天时达到较高水平;另外矿化前后疫苗诱导产生的特异性抗体水平在所有时间点均无显著差异,说明矿化壳层并不影响疫苗的免疫原性。
在本研究中,通过ELISpot试验[15-16]分析了矿化VLPs组与VLPs组动物淋巴细胞经抗原刺激后分泌特异性IFN-γ的能力,以评估疫苗接种对细胞免疫的影响。结果表明:矿化VLPs组分泌IFN-γ的数量显著高于未矿化疫苗组,说明矿化疫苗可有效诱导机体的细胞免疫应答(图 5)。
上述研究结果证实矿化壳层在不影响VLPs的免疫原性前提下增强疫苗的细胞免疫应答强度。随后,将矿化A型疫苗,矿化O型疫苗,矿化A型、O型二价疫苗分别免疫牛(表 2)。采用LPBE方法检测不同类型疫苗免疫后血清中抗口蹄疫病毒特异性抗体水平的变化,其中3个试验组在免疫后第7天时就能检测到较高水平的口蹄疫特异性抗体,并且单价疫苗与双价疫苗诱导产生的抗体水平在免疫后第7、14天时均无显著差异(图 6)。
病毒微量中和试验检测了疫苗免疫第14天时血清中的中和抗体滴度。结果表明,无论是A型中和抗体还是O型中和抗体,矿化二价疫苗组的中和抗体效价均维持在较高的水平,与矿化单价疫苗组相比,二者之间没有显著差异(图 7)。
双抗体夹心ELISA检测牛免疫第14天时血清中IL-4和IFN-γ水平,发现疫苗免疫后第14天血清中IL-4和IFN-γ水平均显著高于PBS组(P < 0.05或P < 0.01),说明疫苗在牛体内引起了较强的免疫反应。
口蹄疫灭活疫苗对牛和猪均具有良好的免疫原性,为口蹄疫防控提供了巨大帮助。随着基因工程技术的发展以及对FMDV结构的解析,合成肽疫苗、表位疫苗、VLPs疫苗、标记疫苗等新型疫苗研发均取得了良好进展。其中,VLPs疫苗作为一种基因工程新型疫苗,能最大程度地模拟天然病毒的结构及表位特征,有着优良的免疫效果、良好的安全性以及DIVA特征,可以作为预防疫病的新产品。但FMDV本身以及体外组装的VLPs对热均较为敏感。有报道指出,灭活的FMDV疫苗受热后会导致146S颗粒崩解成12S,造成疫苗效力大幅度下降[17-18],因此疫苗的储存运输需要全程冷链,这给临床应用带来了一定的困扰。通过生物矿化技术在疫苗表面生成的外壳可以有效改善疫苗的耐热性,这可能是因为矿化壳层稳定了VLPs的刚性结构,并且减少了VLPs与外界环境的直接作用[10]。
本研究将矿化FMD VLPs疫苗分别免疫了猪和牛来验证疫苗的免疫效果。在猪的免疫试验中,比较了VLPs与矿化VLPs在诱导体液和细胞免疫应答方面的差异,结果显示,两组疫苗诱导产生的特异性抗体的消长基本一致,并且在免疫第196天时动物血清中仍含有较高水平的特异性抗体,表明两种疫苗均可以诱导持久有效的体液免疫应答,并且诱导免疫应答强度相近。IFN-γ是1型T辅助细胞(Th1)分泌的一种细胞因子,被认为是细胞免疫应答中的关键调节因子[19]。本研究中,作者通过ELISpot试验比较了矿化VLPs和VLPs免疫猪外周血淋巴细胞产生特异性IFN-γ的水平,结果显示,矿化疫苗可以诱导更高水平的细胞免疫应答,可能是CaP-VLPs复合物在被抗原递呈细胞摄取后,发生了胞内的溶酶体逃逸现象,激活抗原交叉递呈,从而激活了一定的细胞免疫应答[20]。
为了进一步评价矿化VLPs的免疫效果,作者通过牛的免疫试验比较了矿化A型、O型的二价VLPs疫苗与矿化A型VLPs疫苗、矿化O型VLPs疫苗诱导免疫应答的差异。结果表明,矿化的二价疫苗可以在牛体内诱导产生高滴度的A型和O型特异性抗体,与对应的矿化单价疫苗诱导产生的特异性抗体无显著差异。另外,本研究比较了3种疫苗免疫第14天时牛血清中和抗体水平,矿化后的二价疫苗与两种单价疫苗诱导产生的中和抗体同样无显著差异。血清抗体检测结果说明,矿化二价疫苗不存在不同血清型间的免疫干扰,单针疫苗就能起到有效防治2种血清型的效果。VLPs疫苗能够诱导细胞分泌较高水平的IL-4和IFN-γ,其中IL-4是Th2型细胞因子,可以促进B细胞的细胞增殖活化以及向浆细胞的分化,是调节体液和适应性免疫应答的关键调节分子[21],IFN-γ的水平在一定程度上反映了体液和细胞免疫应答的强度。本研究结果证实,3种VLPs疫苗在牛体内均引起了较强的体液免疫反应。综合我国对FMD疫苗的免疫效果评价标准[22],可以初步认为矿化疫苗能为动物提供较好的免疫保护,具有良好的临床应用前景。
4 结论矿化FMD VLPs疫苗的壳层不会影响VLPs本身优异的免疫原性;疫苗可以在猪和牛体内诱导强烈的特异性免疫应答,并且矿化A型VLPs和O型VLPs疫苗可以联合使用,起到单针疫苗防治2种血清型的效果。
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(编辑 白永平)