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引用本文
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WANG Zi, WANG Nianxiang, TIAN Changming, ZHAO Fujie, LIU Lintao, MA Mengyao, JIA Xinhao, LIU Guoxing, ZHENG Lanlan. Using Mouse to Evaluate the Immune Effect of Bridged Diphenylalanine Dipeptide with Inactivated Porcine Deltacoronavirus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2023, 54(4): 1590-1597.  
桥连双苯丙氨酸二肽增强灭活猪丁型冠状病毒在小鼠上的免疫效果分析
王子1, 王年祥1, 田长明2, 赵福杰1, 刘林涛1, 马梦瑶1, 贾鑫浩1, 刘国星2, 郑兰兰1,3     
1. 河南农业大学动物医学院, 郑州 450002;
2. 河南农业大学理学院, 郑州 450002;
3. 河南省动物性食品安全重点实验室, 郑州 450002
收稿日期：2022-08-03
基金项目：河南省高校科技创新人才支持计划（21HASTIT039）；河南农业大学拔尖人才项目（30501049）
作者简介：王子(1998-), 男, 河南安阳人, 硕士, 主要从事动物分子病原学与免疫学研究, E-mail: wang1998zi@163.com.
通信作者：刘国星, 主要从事智能有机超分子发光材料研究, E-mail: gxliu@henau.edu.cn; 郑兰兰, 主要从事动物分子病原学与免疫学研究, E-mail: lanlan@henau.edu.cn.
摘要：猪丁型冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）会引起新生仔猪腹泻、呕吐甚至死亡，对生猪养殖造成了严重危害。苯丙氨酸二肽及其衍生物可自组装成纳米超分子组装体，具有负载并递送药物的功能。本研究旨在探究桥连双苯丙氨酸二肽是否可以增强PDCoV的免疫原性。首先对桥连双苯丙氨酸二肽进行细胞毒性评价，之后作为佐剂（0.1 mg·mL-1）等体积混合灭活PDCoV（PDCoV HNZK-02，TCID50为108·0.1 mL-1），制备灭活疫苗。将灭活疫苗免疫小鼠（200 μL·只-1），采用ELISA方法检测PDCoV N蛋白特异性IgG抗体、CCK-8试剂盒检测淋巴细胞增殖SI指数、乳酸脱氢酶（LDH）方法检测特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性。小鼠免疫5周后，灌胃攻毒PDCoV（500 μL·只-1），3 d后进行回肠等组织病毒载量检测。结果显示，桥连双苯丙氨酸二肽对猪睾丸细胞没有明显毒性作用，作为佐剂与灭活PDCoV混合免疫小鼠后，PDCoV N蛋白特异性IgG抗体水平、SI和CTL检测结果均高于灭活PDCoV组，肠道组织病毒载量显著低于灭活PDCoV组。桥连双苯丙氨酸二肽有良好的佐剂效果，具有成为新型安全有效佐剂的潜力。
关键词：桥连双苯丙氨酸二肽    佐剂    猪丁型冠状病毒    免疫评价    
Using Mouse to Evaluate the Immune Effect of Bridged Diphenylalanine Dipeptide with Inactivated Porcine Deltacoronavirus
WANG Zi1, WANG Nianxiang1, TIAN Changming2, ZHAO Fujie1, LIU Lintao1, MA Mengyao1, JIA Xinhao1, LIU Guoxing2, ZHENG Lanlan1,3     
1. College of Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
2. Institute of Physical and Chemical, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
3. Henan Provincial Key Laboratory of Animal Food Safety, Zhengzhou 450002, China
Corresponding author: LIU Guoxing, E-mail: gxliu@henau.edu.cn; ZHENG Lanlan, E-mail: lanlan@henau.edu.cn.
Abstract: Porcine deltacoronavirus (PDCoV) can cause diarrhea, vomiting and even lead to death of newborn piglets, which has serious harm to pig breeding. Phenylalanine dipeptide and its derivatives can be self-assembled into nanometer supramolecular assemblies, which have the function of loading and delivering drugs. This study was conducted to explore whether bridging diphenylalanine dipeptide can enhance the immunogenicity of PDCoV. Firstly, its cytotoxicity was evaluated. Then, it was used as adjuvant (0.1 mg·mL-1) and mixed with equal volume of inactivate PDCoV (PDCoV HNZK-02, TCID50=108·0.1 mL-1) to prepare inactivated vaccine. Mice (200 μL per mouse) were immunized with inactivated vaccine, and the specific IgG antibody was detected by ELISA method, the SI index of lymphocyte proliferation was detected by CCK-8 kit, and the activity of specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) was detected by lactate dehydrogenase (LDH). After 5 weeks of immunization, mice were challenged with PDCoV (500 μL per mouse) by intragastric administration, and the viral load of ileum and other tissues was detected 3 days later. The results showed that bridged diphenylalanine dipeptide had no obvious toxic effect on porcine testicular cells. Mice immunized with inactivated PDCoV with bridging diphenylalanine dipeptide could produce high level of IgG, SI and CTL were higher than those of the inactivated PDCoV group, and the intestinal tissue viral load was significantly lower than that of the inactivated PDCoV group. Bridged diphenylalanine dipeptide showed a good adjuvant effect and has the potential to become a new safe and effective adjuvant.
Key words: bridging diphenylalanine dipeptide    adjuvant    porcine deltacoronavirus    evaluation of immune    

猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种新型猪肠道病毒，属于冠状病毒科，丁型冠状病毒属，可引起新生仔猪腹泻，给世界养猪业造成严重的经济损失。2012年，Woo等[1]在中国香港进行禽类和哺乳动物冠状病毒监测时首次发现该病毒，2014年，Hu等[2]在美国暴发腹泻的仔猪中首次分离出PDCoV。随后PDCoV迅速蔓延到韩国、加拿大、日本、越南和泰国等地[3-5]。PDCoV主要引起仔猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡，具有广泛的组织嗜性和严重的病毒血症，临床症状与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)非常相似[6-7]。PDCoV具有跨物种传播特性，它可以体外感染猪、猫、人、小牛和鸡的细胞[8-9]。并且感染PDCoV的小鸡和火鸡雏鸡表现有腹泻症状[10-11]。PDCoV对小鼠也具有易感性，小鼠感染PDCoV后，肠道和肺组织均表现有明显的损伤[12-13]。2021年报告了第1例人类感染PDCoV病例[14]。然而目前针对PDCoV还没有有效的治疗药物与商业疫苗，接种疫苗仍是猪腹泻类病毒最有效的控制手段，因此研发安全高效的疫苗是快速有效预防和控制PDCoV的关键。灭活疫苗作为经典的疫苗研发路线已广泛应用于生物医药行业。然而单纯的灭活病毒往往免疫原性较低，需要添加佐剂增强免疫刺激，来实现更好的免疫效果。

肽类物质自组装是自然界普遍存在的分子自组装现象之一，生物体内的蛋白质、核酸等也是通过自组装形成[15-16]。肽类自组装体作为新－代的生物材料可以形成多种结构，具有良好的生物相容性及对pH、温度、酶、氧化还原有敏感特性等诸多优点[17]。苯丙氨酸二肽(Phe-Phe)及其衍生物可以通过氢键和两个苯环与酰胺键形成的π-π堆积作用形成纳米超分子组装体，其已作为药物递送载体得以应用[18-19]，且具有一定的抗病毒及免疫调节作用[20-21]，具备潜在的疫苗佐剂效应。

本研究使用桥连双苯丙氨酸二肽(简称双苯丙氨酸二肽)作为佐剂制备PDCoV灭活疫苗，在小鼠上检测其免疫原性，分析双苯丙氨酸二肽的佐剂效应，为开发新型纳米及小肽类分子佐剂提供依据。

1 材料与方法 1.1 毒株、细胞与蛋白

PDCoV HNZK-02株、猪睾丸细胞(ST)、猪肾细胞(LLC-PK1)、PDCoV N蛋白及PDCoV N单抗[22]由河南省动物性食品安全重点实验室保存。

1.2 主要试剂

二噻吩乙烯桥联双苯酚、溴代苯丙氨酸二肽购自国药集团化学试剂有限公司；CCK-8、TMB显色液、刀豆蛋白A(ConA)、小鼠淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 实验动物

体质量为18~22 g、6周龄健康昆明雌性小鼠27只，购自郑州大学实验动物中心。

1.4 双苯丙氨酸二肽的制备

桥连双苯丙氨酸二肽由河南农业大学理学院合成并鉴定。其由二噻吩乙烯桥联双苯酚与溴代苯丙氨酸二肽发生取代反应制备获得。为淡蓝色固体粉末，分子量1 257.33, 纯度98%。

1.5 双苯丙氨酸二肽的细胞毒性检测

为了检测双苯丙氨酸二肽对细胞增殖的影响，在96孔板中培养好ST细胞，取不同浓度的双苯丙氨酸二肽(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8μmol·L-1)，加入96孔板中，同时设未处理细胞作为阴性对照。作用24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8孵育4 h，酶标仪检测OD450 nm值。

1.6 双苯丙氨酸二肽PDCoV灭活疫苗的制备

使用浓度为0.03%的β-丙内酯在PDCoV(TCID50为108·0.1 mL-1)溶液中4 ℃灭活12 h后，于37 ℃放置1 h。与等体积的浓度为0.1 mg·mL-1的双苯丙氨酸二肽4 ℃摇床混合2 h，制备PDCoV灭活疫苗。经无菌检验合格，4 ℃保存备用。

1.7 实验动物分组与免疫

将27只小鼠随机分为3组，每组9只，免疫方式采用背部多点皮下注射，试验分组、免疫剂量如表 1所示。分别在第1、15天进行首免和加强免疫。每周随机从每组选取3只小鼠，断尾采集血液，分离血清备用。首免5周后每组随机处死3只小鼠，取脾分离淋巴细胞；根据实验室建立的PDCoV感染小鼠模型[12]，首免5周后每组随机取3只小鼠进行PDCoV(TCID50为108·mL-1)灌胃攻毒500 μL·只-1。

表 1 实验动物分组及免疫 Table 1 Grouping and immunization of mice
1.8 PDCoV N蛋白特异性IgG抗体检测

使用双苯丙氨酸二肽-灭活PDCoV免疫小鼠后，每周随机从每组选取3只小鼠，采集小鼠血液分离血清，利用间接ELISA方法检测血清中PDCoV特异性IgG抗体水平，主要操作过程：将浓度为2 μg·mL-1的PDCoV N蛋白包被到ELISA板中，100 μL·孔-1，37 ℃温育3 h；用PBST洗涤液洗涤3次，甩干；每孔加入150 μL封闭液，37 ℃封闭2 h，弃去封闭液；加入160倍稀释的待检血清，每孔100 μL，37 ℃作用1 h，洗涤3次；加入由辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG酶标二抗(1∶20 000)，每孔100 μL，37 ℃作用45 min后洗3次；每孔加100 μL的底物显色液TMB，37 ℃避光显色8 min；每孔加入50 μL终止液(2 mol·L-1 H2SO4)终止反应；用酶标仪测定样本OD450 nm值。判定标准P/N>2判断为阳性。

1.9 脾淋巴细胞增殖能力检测

首次免疫5周后，无菌条件下取小鼠脾组织，分离淋巴细胞，细胞浓度为1×107·mL-1。使用CCK-8试剂盒检测灭活PDCoV刺激后脾淋巴细胞的增殖能力变化。将50 μL PDCoV加入分离的淋巴细胞悬液，同时设ConA非特异性刺激组、RPMI-1640培养液无刺激对照组，每组3个重复。将淋巴细胞置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养72 h；每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养4 h；酶标仪检测450 nm波长下的光吸收度值(OD450 nm)，计算淋巴细胞增殖指数SI。SI=(特异性刺激孔OD值-无刺激细胞对照孔OD值)/(非特异性刺激孔OD值-无刺激细胞对照孔OD值)。

1.10 细胞毒性T淋巴细胞检测

首次免疫5周后，无菌条件下取小鼠脾组织，分离淋巴细胞，细胞浓度为1×107·mL-1。使用乳酸脱氢酶(LDH)检测方法检测脾特异性T淋巴细胞毒性(CTL)活性变化。分离的小鼠脾淋巴细胞为效应细胞；LLC-PK细胞(细胞浓度为1×107·mL-1) 加入100 TCID50 PDCoV，作用12 h后的细胞为靶细胞；按效应细胞：靶细胞=25∶1的比例混合后作为检测样本；同时设只加RPMI-1640完全培养液的效应细胞为自然释放样本孔、加细胞裂解液的为最大释放样本孔，每组3个重复。置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养4 h，每孔取100 μL上清液，分别加入蒸馏水50 μL，250 μL基质缓冲液，2，4-二硝基苯肼，混匀，37 ℃避光孵育15 min；加入0.4 mol·mL-1的NaOH溶液，混匀，室温放置3 min；酶标仪检测OD450 nm。CTL活性计算：细胞毒性(%)=(检测样本-自然释放样本)/(最大释放样本-自然释放样本)×100%。

1.11 攻毒后组织病毒载量测定

首次免疫5周后，每组随机取3只小鼠以灌胃的方式进行攻毒，攻毒3 d后解剖小鼠，分别取肺、十二指肠及回肠组织，检测其组织病毒载量。

1.12 攻毒后组织学病变检测

首次免疫5周后，每组随机取3只小鼠以灌胃的方式进行攻毒，攻毒3 d后, 解剖小鼠，取各组小鼠回肠组织，制作切片，进行HE染色，观察组织学病变情况。

1.13 数据统计分析

使用GraphPad Prism8.0分析软件及Excel进行数据统计分析，经t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 双苯丙氨酸二肽对ST细胞的毒性

用10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10 μmol·L-1的双苯丙氨酸二肽与ST细胞共孵育24 h后，利用CCK-8试剂检测450 nm处的OD值。结果如图 1显示，双苯丙氨酸二肽在10-5~10 μmol·L-1范围内对ST细胞的生长没有影响，其具有良好的生物安全特性。

图 1 不同浓度的双苯丙氨酸二肽对ST细胞增殖的影响 Fig. 1 Effects of diphenylalanine dipeptide at different concentrations on the proliferation of ST cells
2.2 PDCoV N蛋白特异性IgG抗体检测

小鼠血清抗体检测结果如图 2所示，PDCoV-双苯丙氨酸二肽组在首免2周后特异性IgG抗体水平显著升高，在第5周达到高峰，PDCoV-双苯丙氨酸二肽组极显著高于灭活PDCoV组(P < 0.000 1)；PBS组和灭活PDCoV组在第4周后特异性IgG抗体水平均显著低于PDCoV-双苯丙氨酸二肽组(P < 0.05)。

*. P < 0.05；****.P < 0.000 1 图 2 PDCoV特异性IgG抗体水平检测 Fig. 2 Monitoring of PDCoV-specific IgG antibody levels
2.3 脾淋巴细胞增殖能力检测

首免后第5周解剖小鼠，取脾分离脾淋巴细胞后，使用灭活PDCoV刺激，使用CCK-8试剂检测淋巴细胞增殖结果。如图 3A显示，PDCoV-双苯丙氨酸二肽组SI显著高于灭活PDCoV组(P < 0.05)，PDCoV-双苯丙氨酸二肽组SI极显著高于PBS组(P < 0.01)。

*. P < 0.05；**.P < 0.01 图 3 小鼠脾淋巴细胞增殖(A)、细胞毒性(B)检测结果 Fig. 3 Results of proliferation (A) and cytotoxicity (B) test of mouse spleen lymphocytes
2.4 脾淋巴细胞毒性检测

在第5周解剖小鼠，取脾分离淋巴细胞后，使用LDH检测试剂盒检测淋巴细胞。结果如图 3B所示，PDCoV-双苯丙氨酸二肽组CTL活性显著高于灭活PDCoV组(P < 0.05)，PDCoV-双苯丙氨酸二肽组CTL活性极显著高于PBS组(P < 0.01)。

2.5 攻毒后组织病毒载量测定结果

每组随机取3只小鼠以灌胃的方式进行攻毒，攻毒3 d后解剖小鼠，分别取肺、十二指肠及回肠组织，检测其病毒载量。结果如图 4所示：在肺部，各组的病毒载量没有明显差别；在十二指肠中，PDCoV-双苯丙氨酸二肽组病毒载量显著低于灭活PDCoV组(P < 0.05)，PDCoV-双苯丙氨酸二肽组病毒载量极显著低于PBS组(P < 0.001)；在回肠中，PDCoV-双苯丙氨酸二肽组和灭活PDCoV组的病毒载量均显著低于PBS组(P < 0.05)。

*. P < 0.05；***.P < 0.001 图 4 攻毒3 d后各组肺、十二指肠、回肠组织病毒载量检测结果 Fig. 4 Viral load test results of lung, duodenum, and ileum in each group 3 days after challenge
2.6 攻毒后回肠组织学病变检测

PDCoV感染小鼠后其回肠组织病理学变化的特征是小鼠肠绒毛广泛的出现严重坏死现象，包括肠绒毛的脱落和坏死以及回肠中的淋巴细胞增多[11]。在PDCoV攻毒后3 d收集回肠组织用于组织病理学分析。如图 5所示：在PDCoV和PBS组的小鼠中回肠的病理变化更加严重，而PDCoV-双苯丙氨酸二肽组的小鼠回肠病理损伤相对较轻。

A.PBS组小鼠攻毒3 d后回肠病理切片；B.灭活PDCoV组小鼠攻毒3 d后回肠病理切片；C.灭活PDCoV-双苯丙氨酸二肽组小鼠攻毒3 d后回肠病理切片 A. Ileum pathological sections of mice in PBS group 3 days after challenge; B. Ileum pathological sections of mice in inactivated PDCoV group 3 days after challenge; C. Ileum pathological sections of mice in the inactivated PDCoV-diphenylalanine dipeptide group 3 days after challenge 图 5 攻毒3 d后小鼠回肠病理切片(400×) Fig. 5 Ileum pathological sections of mice in each group 3 days after challenge (400×)
3 讨论

PDCoV自2014年在美国暴发以来，逐渐在北美、东南亚乃至全球范围流行，我国也深受其害[23-24]。目前，我国除了内蒙古、云南等少数省份外，其余省份均检出PDCoV阳性病例，PDCoV抗原阳性率为10%~33%[25-27]。PDCoV主要引起仔猪腹泻，但在发病的仔猪中除了肠道，还可以在脾、肾及肺组织中检测到PDCoV，因此其具有广泛的组织嗜性。全球各地的PDCoV全基因组进化分析表明，美国和韩国毒株与中国毒株亲缘关系较近，而东南亚的PDCoV毒株与中国毒株亲缘关系较远且具有更强的致病性[28]。目前，全球尚无针对PDCoV的商品化疫苗，PDCoV的防治仍以加强病原监测和阻断传播途径等生物安全手段为主。

佐剂可以明显的增强免疫效应，但其作用机理并不清楚，目前公认主要是通过缓释抗原、增强抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)对抗原的递呈能力、激活细胞因子及刺激炎症小体等这几种途径来增强免疫效应[29]。根据佐剂发挥的效应不同，将其大致分为两类：传递系统佐剂(如明矾、免疫刺激复合物、脂质体等)和免疫调节分子佐剂(CD40抗体佐剂、非甲基化的CpG寡核苷酸佐剂细胞因子佐剂等)，它们可以单独或联合用于疫苗的配制。佐剂增强抗原的免疫刺激特性，一般要求有良好的生物安全性，并且可以生物降解[30-31]。

纳米佐剂是近年来探索和研发的热点，目前已有多种纳米小分子佐剂应用于疫苗研究。根据纳米佐剂的概念，粒径＜1 000 nm且具有佐剂效应的物质都属于纳米佐剂。苯丙氨酸二肽作为一种纳米级材料，其发挥佐剂效应可能与纳米佐剂发挥作用的机理相同。纳米佐剂具有提高疫苗抗原稳定性、免疫原性以及缓释性的特点，其表面有丰富的活化中心可以与抗原稳定结合，作为高效的运载工具将抗原进行靶向运输。目前认为纳米佐剂是通过封装包裹、被动吸收或基因融合等方式装载抗原，从而为抗原形成一个“仓库”以防止酶解或水解，将抗原以完整的形式运送到淋巴细胞或者APC中，促进抗原的提呈以及产生持久高效的记忆性免疫应答来增强免疫效应[32]。

苯丙氨酸二肽及其衍生物可自组装成纳米超分子组装体，本身具有良好的生物安全性，可作为载体递送小分子物质，对动物机体具有一定的免疫调节作用。同时苯丙氨酸二肽分子具有多种结构变化，其分子构象和理化性质也各有区别，其构成成分较为复杂；但苯丙氨酸二肽及各类衍生物，不仅具有药物治疗性质，还可以作为靶向递送各类分子的载体，本研究证明桥连双苯丙氨酸二肽同时也具有增强抗原免疫效应的佐剂特性，表明苯丙氨酸二肽化合物拥有成为一种新型安全有效的佐剂的潜力。

PDCoV特异性IgG抗体检测结果显示，桥连双苯丙氨酸二肽可以促进灭活PDCoV产生较高的特异性抗体；PDCoV-双苯丙氨酸二肽免疫小鼠后亦可以促进脾淋巴细胞增殖和提高淋巴细胞杀伤性，说明苯丙氨酸二肽可以作为佐剂增强机体免疫应答，从而提高疫苗的免疫效果。而且攻毒保护结果显示，桥连双苯丙氨酸二肽作为佐剂可以对动物易感组织和器官提供有效保护，进而有效降低对病毒的感染风险。

本研究为PDCoV的疫苗研发提供试验支撑，同时也为新型纳米佐剂的开发提供了一种新的材料和研究方向。

4 结论

桥连苯丙氨酸二肽作为纳米佐剂具有良好的潜力，其不仅具有良好的生物相容性，而且能够提高灭活疫苗的免疫原性、刺激机体产生较高的免疫应答水平。所制备的桥连双苯丙氨酸二肽-PDCoV灭活疫苗具有良好的免疫效果，对感染动物产生明显的保护效果。

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(编辑   白永平)