畜牧兽医学报  2023, Vol. 54 Issue (4): 1568-1578. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2023.04.020    PDF    
猪圆环病毒3型的分离及致病性分析
库旭钢1,3,4, 于学祥1,2,3, 孙琪1,2,3, 李盼盼1,3, 张梦佳1,2, 罗锐1,2, 钱平1,2, 何启盖1,2,3,4     
1. 华中农业大学动物医学院, 武汉 430070;
2. 农业微生物学国家重点实验室, 武汉 430070;
3. 生猪健康养殖协同创新中心, 武汉 430070;
4. 华中农业大学动物疫病诊断中心, 武汉 430070
摘要:猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)是2016年由美国首次报道引起母猪繁殖障碍的一种新型猪圆环病毒,该病毒的致病性尚不完全清楚。为研究PCV3对断奶仔猪的致病性,本研究用PK-15细胞自临床病料分离到1株PCV3毒株,命名为PCV3/CH/HB/XY/2018,全基因组测序分析表明,该毒株属于PCV3a-IM基因亚型。分别用PCV3阳性病料初始匀浆液和第8代细胞培养物采用滴鼻和肌肉注射2种方式感染28日龄断奶仔猪,每组试验猪5头,并设置空白对照组。通过观察和分析试验猪的临床表现、体温、增重、病毒血症、各组织的病毒载量和病理变化等方面评价仔猪感染试验结果。结果显示:PCV3阳性病料初始匀浆液和细胞培养物在感染断奶仔猪后均会引起仔猪出现体温上升、消瘦、皮炎和生长缓慢等现象;病毒血症时间超过14 d,但21 d消失,病毒的组织分布结果表明,PCV3主要感染扁桃体、淋巴结等免疫器官,在脾、肺和扁桃体等组织中的病毒载量最高;感染猪可出现间质性肺炎、淋巴小结增生和嗜酸性粒细胞增多等病理变化。本研究表明PCV3/CH/HB/XY/2018毒株对断奶仔猪有致病性,为PCV3的致病机制研究奠定了基础。
关键词猪圆环病毒3型    分离    致病性    病毒载量    
Isolation and Pathogenicity Analysis of Porcine Circovirus Type 3
KU Xugang1,3,4, YU Xuexiang1,2,3, SUN Qi1,2,3, LI Panpan1,3, ZHANG Mengjia1,2, LUO Rui1,2, QIAN Ping1,2, HE Qigai1,2,3,4     
1. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
2. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Wuhan 430070, China;
3. The Cooperative Innovation Center for Sustainable Pig Production, Wuhan 430070, China;
4. Animal Disease Diagnosis Center, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
Abstract: Porcine circovirus type 3 (PCV3) is a new genotype of porcine circovirus firstly reported cause reproductive in sows in the United States in 2016, pathogenesis is not fully known. In order to study the pathogenicity of PCV3 in weaned piglets, a PCV3 strain was isolated using PK-15 cells from clinical tissue samples in this study and was named as PCV3/CH/HB/XY/2018, which belonged to PCV3a-IM genotype indicated by whole genome sequencing (WGS). Groups of five 28-day old weaned piglets were infected by both nasal inoculation and intramuscular injection with PCV3 positive tissue homogenate and the 8th generation virus culture, respectively, meanwhile, a blank control group was set up. The results of infection test in piglets were evaluated in terms of clinical manifestation, body temperature, weight gain, viremia, tissue distribution and pathological changes. The results showed that after infection with PCV3 positive tissue homogenate or virus culture, the piglets in both groups showed high body temperature, emaciation, dermatitis and slow growth, and viremia lasted 14 days but disappear before 21 days post infection. Meanwhile, PCV3 was mainly found in tonsils and lymph nodes, and the highest viral load of PCV3 was found in spleen, lung and tonsils, the pathological changes in the lungs were characterized by interstitial pneumonia, lymphoid nodular hyperplasia and eosinophilia. This study proved that PCV3/CH/HB/XY/2018 was pathogenic to weaned piglets, and the isolation of this virus laid a foundation for the PCV3's pathogenesis mechanism research of PCV3-associate disease.
Key words: porcine circovirus type 3    isolation    pathogenicity    viral load    

猪圆环病毒病(porcine circoviruses diseases,PCVD)是由猪圆环病毒(porcine circoviruses,PCV)引起的一系列疾病的总称,该病是国际公认的严重危害养猪业发展的疾病之一,对生猪生产造成巨大的经济损失[1-4]

2016年,美国学者Phan发现了一种新的猪圆环病毒,该病毒基因组比PCV1和PCV2的基因组大[5],与PCV2的基因组相似性低,只有37%左右,依据病毒分类原则,被判定为一种新的基因型,命名为PCV3。PCV3 ORF2基因长645 bp,较PCV2 ORF2基因短,两者的核苷酸相似性低于30%,推测PCV2疫苗对预防PCV3感染可能无交叉保护力或交叉保护力较低。目前,PCV3在家猪和野猪中均有报道存在[6-7],且推测其与猪皮炎肾病综合征等疾病有密切的关联[5, 8]

作者早在2017年报道PCV3存在于我国多个省份,且各阶段猪群都有感染[9]。随后国内也有不少流行病学方面的报道,但对于病毒的致病性研究较少。本研究用PCV3阳性病料匀浆液和第8代细胞培养物分别感染断奶仔猪,观察感染猪的生长状况和临床表现,统计生长指标;剖检试验猪,观察各组织的病理变化并检测不同组织中病毒载量,评估PCV3的致病性。

1 材料与方法 1.1 样品来源

PCV3阳性病料来源于湖北省襄阳市某规模化猪场,采集时间是2018年1月。该猪场使用过猪圆环病毒2型亚单位疫苗,14日龄仔猪颈部肌肉注射1头份。猪群存在的问题:每批保育猪有8%~10%的猪出现被毛粗乱、弓背和消瘦等,疑为猪圆环病毒感染。选择有典型临床症状的4头发病仔猪放血处死,每头猪采集脾、淋巴结和扁桃体等组织样品和血样,通过冷藏方式带回实验室。分别选取不同组织的少量样品开展猪圆环病毒2型、3型(PCV2、PCV3)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪瘟病毒(CSFV)等病毒核酸检测,其余样品置于-80 ℃冰箱保存,用于后续病毒分离工作。

1.2 试验材料

猪肾传代细胞(PK-15)由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保存提供。QUANTUM-ST5-1100/26M凝胶成像系统由VIBER公司制造生产;PCR仪由苏州东胜兴业科学仪器有限公司制造生产;CFX-96荧光定量PCR仪由Bio-Rad公司制造生产;超净工作台由北京东联哈尔仪器有限公司制造生产;高速冷冻离心机由德国Eppendorf公司制造生产。Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa);DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。DMEM、胰蛋白酶为Gibco公司生产。氨苄青霉素(Amp)、链霉素和胎牛血清(FBS)为Invitrogen公司生产。D-氨基葡萄糖(Glucosamine) 为Sigma公司生产。

1.3 引物及扩增程序

参考文献序列信息设计PCV3 ORF2基因的检测引物、病毒全基因组测序引物[9]和PCV3 ORF2 TaqMan荧光定量PCR的引物和探针[10](表 1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表 1 用于PCV3检测的常规PCR引物和定量引物及探针 Table 1 Primers and probe used for PCV3 detection

PCV3 ORF2基因检测体系:Premix TaqTM 25 μL,上、下游引物(10 mmol·L-1)各2 μL,DNA模板8 μL,加ddH2O至50 μL,混匀。反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35个循环;72 ℃延伸10 min;16 ℃保存。

病毒全基因组测序扩增体系:Premix TaqTM 25 μL,上、下游引物(10 mmol·L-1)各2 μL,DNA模板8 μL,加ddH2O至50 μL,混匀。反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,57 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s,35个循环;72 ℃延伸10 min;16 ℃保存。

TaqMan荧光定量PCR反应体系:2×Premix Ex Taq (2×)(Probe qPCR)10 μL,PCV3-qF/PCV3-qR(10 mmol·L-1)各1 μL,TaqMan Probe(5 mmol·L-1)1 μL,待检样品核酸模板4 μL,加ddH2O至20 μL,混匀。反应条件:50 ℃ 2 min,95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,60 ℃延伸1 min,40个循环。

1.4 病毒分离

1.4.1 样品处理   4头仔猪中有3头检测到PCV3,从中选择PCV3核酸阳性而PCV2、PRV、PRRSV、PEDV、TGEV、PoRV和CSFV等病原核酸阴性的组织用于病毒分离。在冰上将组织样品剪碎,然后按质量比1∶9加入生理盐水,将样品充分匀浆,在-20 ℃反复冻融两次,4 ℃ 10 000 r·min-1离心10 min,收集上清,用孔径为0.22 μm的滤器过滤,过滤液中按1/100体积加入青霉素和链霉素(双抗),分装1.0 mL·管-1,用于病毒分离,或置-80 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 细胞接种   选择生长状况良好的PK-15细胞,经胰酶消化后与处理好的组织悬液按10∶1体积比同步接种于T25细胞培养瓶,37 ℃ 5% CO2培养箱内培养24 h。细胞长成单层后加入适量300 mmol·L-1 D-氨基葡萄糖(以完全覆盖细胞单层为准),37 ℃孵育30 min,弃去D-氨基葡萄糖,加入含2% FBS的DMEM维持液37 ℃继续培养48~72 h后,反复冻融3次,收获细胞培养悬液,3 000 r·min-1离心10 min,1 mL·管-1分装,置-80 ℃冰箱保存。病毒传代培养是将上一代次细胞培养病毒液按1∶10体积比同步接毒。

取初始病毒分离用的组织悬液(F0)和传代F3、F6和F9代的病毒悬液,采用普通PCR和荧光定量PCR的方法检测PCV3核酸,通过荧光定量PCR鉴定病毒增殖情况。

1.5 全基因组测序

取F6代的细胞培养病毒液样品的核酸,扩增全基因组片段,将扩增产物克隆到pMD-18T载体后,挑取阳性克隆产物送生工生物工程(上海)有限公司测序,序列通过MEGA5.05进行序列拼接和基因组系统进化树分析。

1.6 动物回归试验

用PCV3阳性病料初始匀浆液和F8细胞培养物分别感染断奶仔猪,分析其对仔猪的致病性。该试验符合华中农业大学实验动物中心动物实验伦理标准,编号为HZAUSW-2018-025。

1.6.1 实验动物的筛选及分组   用荧光定量PCR方法[10]和PCV3-Cap蛋白间接ELISA方法[11]检测仔猪血样中的PCV3病原和抗体。筛选28日龄PCV3病原和抗体为阴性的断奶仔猪15头,随机分为3组,每组5头,分为阳性病料初始匀浆液感染组、细胞培养物感染组和空白对照组。各组试验猪单独隔离饲养。

阳性病料初始匀浆液感染组:滴鼻和肌肉注射核酸阳性样品匀浆液各3 mL,其中阳性样品匀浆液病毒核酸含量为8.0×106 copies·mL-1。细胞培养物感染组:滴鼻和肌肉注射培养的F8代病毒细胞培养物各3 mL,其病毒含量为8.08×106 copies·mL-1。空白对照组:滴鼻和肌肉注射各3 mL DMEM培养基。

1.6.2 感染后临床症状观察和体温测定   感染前和感染后每天在上午的固定时间段测量猪的体温(肛门温度),一直到感染组猪体温恢复正常后停止测量。观察各试验组猪的临床表现,如食欲、生长状况和采食量等。

1.6.3 病毒血症测定   分别于感染前和感染后第1、3、7、10、14、21和28天,采集前腔静脉血样,分离血清,用荧光定量PCR方法检测血清中PCV3的核酸含量。

1.6.4 感染仔猪体重变化   感染前和感染后第7、14和28天,猪逐头称重。分别计算各组猪增重情况和平均日增重。

1.6.5 感染猪不同组织中PCV3分布   感染后28 d试验结束,剖检试验猪,采集心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肠道等21份不同组织各2份,1份用多聚甲醛溶液固定,用于组织切片的制作;1份按照荧光定量PCR的方法检测不同组织样品中PCV3核酸含量。

1.6.6 病理分析   使用多聚甲醛溶液固定脾、扁桃体、淋巴结等免疫器官和大脑、延髓等组织,制备石蜡切片,HE染色,镜检各组织的病理学变化。

2 结果 2.1 病毒分离

用含PCV3的脾和淋巴结的混合组织匀浆液同步接种PK-15细胞,24 h细胞长成单层后用D-氨基葡萄糖处理,2~3 d后冻融细胞收毒,之后传9代,每代病毒传代3~4 d。PCV3不引起PK-15细胞病变(CPE),故病毒培养时应密切观察维持液的颜色变化,当颜色过黄时表明维持液偏酸,酸性环境条件下不利于病毒的增殖。将细胞培养物冻融2次后作为继续传代的毒种,冻融过程中应振动细胞培养瓶,促进病毒释放。

使用PCR方法检测分毒用初始组织悬液、第3代(F3)、第6代(F6)和第9代(F9)细胞培养物,均为PCV3核酸阳性(图 1);荧光PCR方法检测F8代细胞培养液,其病毒含量为8.08×106 copies·mL-1

M.DNA 2000相对分子质量标准;1.含病毒的组织悬液;2.F3;3.F6,4.F9;P.阳性对照;N.阴性对照 M.DNA marker 2000; 1.PCV3-positive tissue suspension; 2.F3; 3.F6; 4.F9; P. Positive control; N.Negative control 图 1 PCV3病毒的鉴定 Fig. 1 Identification of PCV3
2.2 PCV3毒株全基因组分析

对分离到的PCV3毒株进行全基因组测序,获得的PCV3全基因组序列命名为PCV3/CH/HB/XY/2018,上传到NCBI GenBank中获得登录号MH607133.1。进一步选取GenBank中公布的其他33株PCV3全基因组序列进行比较分析,发现本研究分离的PCV3毒株属于PCV3a-IM基因亚型(图 2)。

图 2 PCV3毒株的系统进化树分析 Fig. 2 Phylogenetic analysis of PCV3 strain
2.3 PCV3致病性试验

2.3.1 PCV3感染猪的临床症状   PCV3阳性病料初始匀浆液感染组和F8细胞培养物感染组中分别有3头和2头试验猪生长缓慢,被毛粗乱、消瘦,耳朵和体表皮肤有红斑;阳性病料初始匀浆液感染组中有1头出现呕吐。对照组猪未见相似临床表现(图 3)。

图 3 PCV3感染试验猪的临床表现 Fig. 3 Clinical signs of PCV3-infected pigs

2.3.2 PCV3感染后体温变化情况   PCV3阳性病料初始匀浆液感染组中有1头在感染后第3天开始体温超过40 ℃,维持7 d,第10天体温恢复正常;另外2头猪分别在感染后第4、5天体温超过40 ℃,维持4 d和5 d;细胞培养物感染组中有2头猪分别在感染后第5、6天体温超过40 ℃,维持3 d。对照组体温正常。结果见图 4

图 4 PCV3感染试验猪的肛温变化 Fig. 4 Rectal temperature change of PCV3-infected pigs

2.3.3 感染猪体重的变化   感染前和感染后第7、14和28天,各组猪逐头称重。阳性病料初始匀浆液感染组中有1头猪生长停滞,有2头猪增重缓慢,另外2头猪增重正常;细胞培养物感染组中有2头猪增重缓慢,另外3头猪增重正常,对照组猪生长速度正常。试验结束(28 d)时,组织匀浆液感染组猪的日增重最小(图 5)。

图 5 PCV3感染猪体重变化情况 Fig. 5 Body weight of PCV3-infected pigs

2.3.4 感染后病毒血症结果   使用荧光定量方法,检测感染后不同时间的血清样品,发现阳性病料初始匀浆液感染组和细胞培养物感染组的5头猪均从第1天出现病毒血症,持续时间不完全相同,但可持续到感染后第14天,第21天病毒血症完全消失。对照组猪未出现病毒血症。病毒血症检出比例及病毒载量见表 2图 6

表 2 感染后不同时间血清中PCV3检出比例 Table 2 The detection ratio of PCV3 in sera collected at different time after infection
图 6 PCV3感染试验猪病毒血症 Fig. 6 Viremia of PCV3 infected pigs

2.3.5 病理变化   在感染后第28天剖检试验猪,观察猪体表、淋巴结、脾等组织。阳性病料初始匀浆液感染组和细胞培养物感染猪的淋巴结分别出现肿大或出血,脾可见明显红色出血点,但未见肿大。而对照组猪未见肉眼可见变化(图 7)。

图 7 感染猪和对照猪的病理变化 Fig. 7 Pathological changes of pigs in infected group and blank group

2.3.6 感染后不同组织中PCV3检测结果   使用荧光定量方法检测试验猪的不同组织中的病原载量。在两个感染组所有猪的扁桃体和淋巴结均可检测到PCV3核酸,其次为肾和脾,其余的依次为肺、肝和脑,心PCV3检出率最低。其中,脾的病毒载量最高,其次是肺、扁桃体、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结,胃肠道也可检出病毒,但病毒载量最低的是胆汁。淋巴结和扁桃体中检出比例最高,为100%,具体检测结果见表 3图 8

表 3 试验猪不同组织中PCV3的检出比例 Table 3 The detection ratio of PCV3 in different tissues of experimental pigs
图 8 PCV3感染猪不同组织的病毒载量 Fig. 8 Virus distribution in different tissue samples from infected pigs

2.3.7 组织病理学检查   HE染色观察发现,两个感染组病理变化主要集中在脾、扁桃体、淋巴结等免疫器官。其中:阳性病料初始匀浆液感染组猪的脾中淋巴小结内细胞增生明显,可见明显核分裂象;扁桃体隐窝内有坏死的组织细胞,可见淋巴小结内有明显核分裂象;腹股沟淋巴结髓质内嗜酸性粒细胞增多,淋巴小结增多,小结内的巨噬细胞吞噬异物明显;肠系膜淋巴结中淋巴小结内细胞增生明显,巨噬细胞胞质内异物明显增多,淋巴窦内嗜酸性粒细胞增多;肺门淋巴结被膜下出血,髓质内嗜酸性粒细胞浸润,小结内细胞增生明显。此外,肺出现间质性肺炎,局部可见出血、坏死病变;大脑组织中可见淋巴管套;延髓中有出血现象,可见胶质细胞增多,呈卫星现象;肾中可见肾小球扩张,球内沉积含铁血黄素颗粒,囊内可见红染的蛋白样物质;皮肤表皮层可见小坏死灶,真皮层中的小血管周边有嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润。

细胞培养物感染组中猪的脾淤血,白髓面积减少,局部脾窦内嗜中性粒细胞聚集;扁桃体隐窝内充满坏死细胞,淋巴小结周围燕麦样细胞增生;腹股沟淋巴结被膜下淋巴窦内较多的嗜酸性粒细胞,淋巴小结内可见较多吞噬异物的巨噬细胞;肠系膜淋巴结被膜下淋巴窦扩张,嗜酸性粒细胞浸润,淋巴小结边界不明显;肺门淋巴结被膜下出血,淋巴小结周淋巴窦扩张,淋巴小结内有坏死的细胞;肺呈现间质性肺炎;大脑偶见卫星现象;延髓呈现出血,胶质细胞增生;肾肾小球扩张,球内沉积含铁血黄素颗粒,囊内可见红染的蛋白样物质;皮肤真皮层小血管大量嗜酸性粒细胞围管性浸润,具体见图 9

图 9 PCV3感染猪不同组织的病理变化(HE染色) Fig. 9 Pathological changes of different tissues with infected pigs (HE staining)

通过比较分析,用相似病毒含量的阳性病料初始匀浆液与细胞培养物分别感染28 d仔猪,感染后第28天,剖检后发现共有的病变主要是肺呈间质性肺炎、不同部位淋巴结见淋巴小结增生、嗜酸性粒细胞浸润、肾见肾小球扩张,肾小球内有含铁血黄素。

3 讨论

PCV3感染是一种新发传染病,在世界范围内已广泛存在,但其分离技术少有报道。本研究采集和检测了多种组织样品,最终选取仅含有PCV3的样品分离病毒。已有研究表明,PCV2的增殖主要借助于细胞分裂期S期产生的蛋白,因此,将PCV2与PK-15细胞同步接种,当PK-15细胞进入分裂期的S期,可以给PCV2的增殖提供更多PCV2复制所需的聚合酶。鉴于PCV2和PCV3均属于同一病毒科,具有一定的同源性和相似性,因此,本研究在分离PCV3时也使用同步接种的方法。有研究报道使用D-氨基葡萄糖处理细胞可显著提升猪圆环病毒2型的病毒含量[12],故本研究在分离病毒和培养病毒时均使用D-氨基葡萄糖处理细胞,以获得更高含量的病毒用于动物试验。

本研究分离到的PCV3仅可传代至第10代,在第1~10代中均可检测到病毒,但第10代之后病毒含量则开始明显下降,所以,本研究动物感染试验中使用第8代病毒,但还需进一步探索可以将PCV3稳定传代的方法。我国华南农业大学研究团队报道可以使用感染性克隆方式拯救出具有感染性的可传代的病毒,第六代病毒达到104.8TCID50·mL-1,并在6周龄昆明小鼠开展动物感染试验[13],为PCV3的病毒分离提供了新思路。

PCV感染的动物回归试验一直不易成功,本研究中首先是筛选PCV3抗原和抗体均为阴性的断奶仔猪。猪购回后先静养观察3 d,消除猪转运的应激反应。在动物感染试验中,感染途径至关重要,有研究表明,口鼻感染可能是PCV3的自然感染途径,但也有仅通过口鼻接种的方式复制出较为成功的PCV3感染模型[14]。以前本实验室采用肌肉注射接种PCV2,获得了与临床感染相似的症状和病理变化,复制出病例,综合考虑,本研究选取滴鼻和肌肉注射两种感染途径同步进行。其次,高滴度的病毒接种物也是保证动物试验成功的重要因素。另外,本研究还在感染前连续3 d大剂量的注射地塞米松,以降低猪的免疫力,提升病毒在体内的感染和复制效率。本研究分别用含PCV3的病料和从该病料中分离到的病毒接种4周龄仔猪,分别有3/5和2/5猪出现病症,证明了PCV3的确有致病性。

有研究表明PCV3感染可导致母猪繁殖障碍、猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、全身炎症性疾病、呼吸系统疾病、腹泻、中枢神经系统疾病[15]和4周龄仔猪的死亡[16],但本研究中PCV3感染仔猪未见死亡,仔猪感染后出现皮炎和消瘦的症状,在病理剖检中可见脾、淋巴结的病理变化。通过检测不同组织中的PCV3核酸,发现所有感染猪的淋巴结和扁桃体中均可检测到PCV3核酸,其次为脾等免疫相关器官,但脾中病毒载量远高于其他组织,说明PCV3主要存在于免疫器官。本研究发现的PCV3组织分布情况与Jiang等[16]使用感染性克隆方式获得PCV3病毒,通过口鼻途径感染试验动物的组织分布结果相似。

4 结论

本研究成功分离到1株有限传代的PCV3a-IM基因亚型毒株,动物回归试验可见该毒株可引起断奶仔猪消瘦、皮炎和生产缓慢等临床症状,且感染后病毒主要分布于扁桃体、淋巴结等免疫器官,病毒血症可持续到第14天,第21天全部消失,表明PCV3对断奶仔猪具有致病性。

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(编辑   白永平)