2. 西藏农牧学院动物科学学院, 林芝 860000
2. College of Animal Science, Tibet Agricultural and Animal Husbandry University, Nyingchi 860000, China
长久以来的抗生素滥用导致了全球范围内细菌耐药性的发生，超级细菌的出现加上新型抗生素研发的举步维艰迫使人们加快了寻找抗生素替代品的步伐。作为替抗候选者之一的噬菌体是一类可感染细菌的病毒，存在于任何细菌存在的环境中，利用烈性噬菌体特异性裂解宿主菌这一特性而开发出的噬菌体疗法目前在治疗特定耐药菌感染中被寄予厚望。目前噬菌体疗法在人类医疗领域(主要针对皮肤和某些器官的多重耐药菌感染)[1-4]、动物保健领域(主要针对动物消化道细菌性感染的治疗和预防)[5-8]和食品卫生领域(食品和器具表面)[9-11]均开展了大量应用性研究，并且取得了不错的效果。噬菌体作为原核病毒长久以来被认为不能感染真核细胞，但是目前的研究结果表明，噬菌体经黏膜给药后(饮水或饲料添加)会跨黏膜进入机体内环境，随后经血液运输可在机体的多种组织器官甚至是大脑中检测到，在这一过程中，噬菌体可能通过多种方式与真核细胞发生作用[12-14]，这些研究结果的发现增加了噬菌体疗法的不确定性。因此，除了预期的靶向清除致病菌效果之外，噬菌体作为一种外源的免疫原性物质，其对非目标微生物群和动物机体本身尤其是对免疫系统的影响仍然需要明晰，这对于作为药物开发的噬菌体具有重要意义。为此，本研究以断奶仔猪为试验对象，探究包括4种致病菌噬菌体的噬菌体鸡尾酒对于机体生长性能、常规血液指标、肠道菌群以及血清免疫指标的影响，以评价体内施用噬菌体制剂的安全性。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用噬菌体鸡尾酒包括猪霍乱沙门菌(Salmonella enterica serovar Choleraesuis)噬菌体S19cd、肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)噬菌体S143_2和N2以及产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)噬菌体C6，NCBI登录号分别为MZ150758、MZ189261、ON645936和MW679410。该4株噬菌体均为实验室前期于猪肠道食糜和黏膜样品中分离得到，并在体外或体内试验中表现出良好的抑菌效力[15-18]。
1.2 试验动物和分组将12头健康且体重相近((6.68±0.28)kg)的21日龄杜×长×大三元杂交断奶仔猪随机分为2组，包括对照组(CON)和噬菌体组(Phage)，每组6头。噬菌体组仔猪每天灌胃10 mL噬菌体鸡尾酒，其中包括噬菌体原液约600 μL，剩余部分用SM缓冲液(saline magnesium buffer)补足，每株噬菌体总量均为5×108PFU，并于试验前测定每株噬菌体原液中内毒素和仔猪饮水中内毒素水平，对照组每天灌胃等体积的SM缓冲液，连续灌胃20 d。饲养试验于南京农业大学动物房进行，试验期间饲喂商品全价料，每头仔猪单栏饲喂，自由采食和饮水，每天记录采食量。
1.3 样品采集及处理于试验第1天灌胃后4、8、12、24 h(第2天灌胃前)、48 h(第3天灌胃前)、72 h(第4天灌胃前)和第21天时(即第20天灌胃24 h后)取仔猪新鲜粪样，使用SM缓冲液匀浆并于8 500 r·min-1离心5 min，之后立即测定噬菌体浓度，用于评价噬菌体在仔猪粪样中的排出动态。于试验第11和21天时颈静脉采集血液样品(提前10 h禁食)，其中部分全血当天送至南京农业大学动物医院测定血常规指标，剩余血液样品在室温倾斜静置2 h后在3 000 r·min-1下离心15 min取血清，部分血清当天送至医院测定血清生化指标，剩余血清样品分装后保存于－80 ℃冰箱，用于后续抗氧化指标、炎症因子和免疫球蛋白水平测定。同时，在采集血液样品的当天利用直肠刺激法采集仔猪的新鲜粪样并置于－20 ℃冰箱保存，用于后续总DNA的提取。
1.4 测定指标及方法1.4.1 生长性能 在试验第0和第21天早晨称量空腹体重(提前10小时禁食)，计算全期体增重和平均日增重(average daily gain，ADG)。计算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)并根据试验期间总采食量和总增重计算耗料增重比(Feed/gain，F/G)。
1.4.2 血清生化和血常规指标 血清生化指标和血常规指标的测定均由南京农业大学动物医院完成。
1.4.3 血清抗氧化指标 采用商业试剂盒(南京建成)测定血清中抗氧化指标，包括谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢(CAT)的酶活力、血清丙二醛(MDA)水平以及血清总抗氧化能力(T-AOC)，具体操作根据试剂盒说明书进行。
1.4.4 血清炎症因子和免疫球蛋白 采用江苏酶免ELISA试剂盒测定血清炎症因子和免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)水平，其中炎症因子指标包括白细胞介素-1(IL-1)、IL-4、IL-10、IL-17、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和转化生长因子β(TGF-β)，免疫球蛋白包括指标包括IgA、IgG和IgM，具体操作根据试剂盒说明书进行。
1.4.5 粪样菌群 利用Omega粪样DNA提取试剂盒提取粪样DNA，具体操作参照说明书。提取的DNA送至上海凌恩生物科技有限公司进行16S RNA基因测序。扩增区域选择V3-V4，引物为通用的特异性引物341F和806R。公司返回的测序结果经Excel简单处理后上传至在线分析网站(www.microbiomeanalyst.ca)进行下游分析，包括各分类学水平下菌群组成、菌群多样性分析和差异菌群分析等。
1.5 数据统计与分析除菌群以外的数据采用“平均值±标准误”来表示，通过SPSS 26的独立样本t检验进行组间差异性检验；菌群数据采用中位数表示，通过SPSS 26非参数检验两独立样本的Mann Whitney U检验比较组间菌群差异；P < 0.05表示具有显著性差异。使用Graphpad prism 8软件绘图。
2 结果 2.1 噬菌体原液和饮水中内毒素水平噬菌体通过裂解宿主菌进行增殖，由于本研究所用宿主菌均为革兰阴性菌，细菌胞体被噬菌体裂解后会释出大量的细胞壁脂多糖(即内毒素)进入噬菌体原液。作为一种毒性物质，过量的内毒素往往会导致机体出现病理现象。因此，本研究首先测定了灌胃的各株噬菌体原液以及仔猪日常饮水中的内毒素水平。如表 1所示，通过每株噬菌体原液和平均每日灌胃量计算出试验周期内每天灌胃的噬菌体鸡尾酒中内毒素总量为(25 728.68±814.46) EU。据统计断奶仔猪使用乳头式自动饮水器每日饮水量约1.5~2.5 L[19]，若以最小日饮水量1.5 L来计算，则对照组仔猪通过饮水摄入的内毒素量为(108 690±7 023.61) EU，相比之下, 噬菌体组仔猪通过饮水和灌胃每日所摄入的内毒素总量为(134 418.7±6 666.03) EU，两组间每日内毒素摄入量并无显著差异(P>0.05)，即本试验条件下的噬菌体原液的每日灌胃体积并不会造成仔猪内毒素摄入量的显著升高。
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表 1 噬菌体原液和饮水中内毒素含量 Table 1 Endotoxin content in phage fluid and drinking water |
复杂的胃肠道环境(如胃酸和消化酶)会导致大量灌胃的噬菌体失活，但不同的噬菌体在体内存活能力具有差异。在本试验中，通过测定第1天灌胃噬菌体后24 h内粪中各株噬菌体的排出数量、试验前4 d每天灌胃噬菌体前粪中残留的噬菌体数量和最后1 d灌胃完噬菌体24 h后粪中噬菌体数量，结果如图 1所示，在灌胃的4株噬菌体中，只有N2可以从各时间点检出，C6可在12 h检出，其余噬菌体在各时间点只在个别样本极少量检出；12 h为含噬菌体的粪样排出高峰，24 h时只有N2可以从粪样本中少量检出，48 h(第三天灌胃前)、72 h(第四天灌胃前)和第21天时(即第20天灌胃24 h后)同样只有N2可以检出，所有时间点可检出的噬菌体数量均显著低于灌胃的噬菌体数量(108PFU)。以上的结果说明噬菌体N2和C6具有优于其他两株噬菌体的过肠道存活能力，灌胃进入肠道后的噬菌体在第12小时就已大量排出，在第24小时已几乎全部排出肠道，即噬菌体在肠道中并未增殖，肠道中不存在这几株噬菌体的靶细菌。
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图 1 粪样噬菌体定量 Fig. 1 Quantification of phage in feces |
通过统计仔猪体重和采食数据(表 2)，发现仔猪的平均日增重、平均日采食量以及料重比等指标在对照组和噬菌体组之间并无显著差异(P > 0.05)即连续灌胃噬菌体鸡尾酒20 d后对仔猪生长性能无显著影响。
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表 2 噬菌体鸡尾酒对仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of phage cocktail on growth performance of piglets |
本研究中，灌胃噬菌体后仔猪血常规和血清生化指标数值均在正常参考范围内；血清生化结果显示(表 3)，连续灌胃噬菌体10 d后(即第11天时)，与对照组相比，噬菌体组仔猪血清中白蛋白水平降低了11%(P < 0.05)；在第21天时，两组间各血清生化指标均无显著差异(P>0.05)，第11天时显著降低的白蛋白含量恢复至对照组水平。此外，血常规结果显示，连续灌胃鸡尾酒10 d和20 d后，两组之间的各项血常规指标并无显著差异(P>0.05，数据未展示)。对血清中抗氧化指标的测定结果显示(图 2)，与对照组相比，灌胃噬菌体鸡尾酒20 d后引起仔猪血清中CAT活力升高了35%(P=0.066)，而其余3个指标在两组间无显著差异(P>0.05)。
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表 3 噬菌体鸡尾酒对仔猪血清生化指标的影响 Table 3 Effects of phage cocktail on serum biochemical indexes of piglets |
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图 2 噬菌体对仔猪抗氧化功能的影响 Fig. 2 Effects of phage on antioxidant capacity of piglets |
血清中炎症因子水平的测定结果显示(图 3)，与对照组相比，第11天时噬菌体组仔猪促炎因子IFN-γ水平升高了77%(P < 0.01)，TNF-α升高了165%(P < 0.001)，IL-1β升高了46%(P < 0.05)，抗炎因子IL-10水平降低了27%(P < 0.05)；第21天时噬菌体组仔猪血清的促炎因子IFN-γ和TNF-α水平分别升高了92%和148%(P < 0.001)，IL-17升高了45%(P < 0.01)，抗炎因子TGF-β水平升高了45%(P < 0.01)，IL-4和IL-10分别降低了27%和21%(P < 0.05)。
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图 3 噬菌体对仔猪血清炎症因子水平的影响 Fig. 3 Effects of phage on the level of serum inflammatory cytokines in piglets |
第21天仔猪血清中免疫球蛋白的定量结果显示(图 4)，与对照组相比，噬菌体组仔猪的IgA和IgG分别升高了35%和28%(P < 0.001)，IgM升高了25%(P < 0.01)。以上结果表明噬菌体灌胃引起了仔猪整体的免疫反应。
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图 4 噬菌体对仔猪血清免疫球蛋白水平的影响 Fig. 4 Effects of phage on the level of serum immunoglobulin in piglets |
2.6.1 噬菌体鸡尾酒对菌群多样性的影响 由表 4可以看出，第11天时仔猪菌群的物种丰富度和均匀度指标在两组间无显著性差异(P>0.05)；第21天时，与对照组相比，噬菌体组的Shannon指数升高了8%(P < 0.05)。基于bray-curtis距离算法的PCoA分析(主坐标分析)显示(图 5)，第11天和21天时两组样品的分布较为集中，并未显著分离开(P>0.05)，说明组间微生物群落结构无显著性差异，即连续灌胃本试验所用噬菌体鸡尾酒在较短的时间周期内对仔猪肠道菌群整体的影响较小。
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表 4 噬菌体鸡尾酒对粪样菌群α多样性的影响 Table 4 Effects of phage cocktail on Alpha diversity of fecal microbiota |
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A. 噬菌体灌胃10 d后；B. 噬菌体灌胃20 d后 A. 10 days after phage gavage; B. 20 days after phage gavage 图 5 粪样菌群基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA) Fig. 5 Principal coordinate analysis (PCoA) of fecal microbiota based on Bray-Curtis distance |
2.6.2 噬菌体对仔猪粪样菌群组成的影响 在门水平上，两组的优势菌门均为拟杆菌门和厚壁菌门，二者相对丰度之和占总丰度的90%以上。在科水平上(图 6A和6B)，第11和21天时两组的优势菌科均为普雷沃氏菌科(Prevotellaceae，对照组33.81%，35.42%；噬菌体组29.68%，28.55%)、其次为颤螺菌科(Oscillospiraceae，8.01%，9.60%；11.54%，14.02%)、理研菌科(Rikenellaceae，10.36%和6.83%)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae，6.28%，9.06%；10.61%，8.63%)。
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A. 第11天菌群科水平组成；B. 第21天菌群科水平组成；C. 第11天菌群属水平组成；D. 第21天菌群属水平组成 A. Family level at day 11; B. Family level at day 21; C. Genus level at day 11; D. Genus level at day 21 图 6 粪样菌群在科、属分类学水平下组成(Top 15) Fig. 6 The composition of the fecal microbiota at family and genuslevels(Top 15) |
在属水平上(图 6C和6D)，11天时两组排名前三的菌属均为Prevotellaceae_NK3B31_group(对照组12.74%，噬菌体组13.11%)、Prevotella_9(10.49%，8.11%)和Rikenellaceae_RC9_gut_group(8.85%，5.88%)；21天时对照组排名前三的菌属为Prevotellaceae_NK3B31_group(21.95%，14.48%)、拟杆菌属(Bacteroides，9.47%，5.52%)和普雷沃氏菌属(Prevotella，5.39%，7.80%)。
对top20菌科和top30菌属的组间差异性分析结果显示，第11天时两组间并未出现相对丰度具有显著性差异的菌科和菌属；21天时菌群组间差异性分析结果显示(图 7)，与对照组相比，噬菌体组颤螺菌科的相对丰度升高了37%(P < 0.05)，这一差异在属水平上则具体表现为Ruminococcus_gauvreauii_group升高了38.9倍(P < 0.05)。
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A.差异菌科(top 20)-Oscillospiraceae；B. 差异菌属(top 30)-Ruminococcus_gauvreauii_group A. Differential bacteria on family level (top 20)-Oscillospiraceae; B. Differential bacteria on genus level (top 30)- Ruminococcus_gauvreauii_group 图 7 噬菌体灌胃20 d后组间差异菌群 Fig. 7 Differential bacteria between groups after 20 days of phage gavage |
噬菌体是组成人和动物体内外微生物群落的成员之一，黏膜表面的黏液层是动物体内主要的微生物栖息环境。近年来提出的BAM(bacteriophage adherence to mucus)模型认为噬菌体可通过黏蛋白黏附于黏膜表面的黏液层来抵御病原菌的侵袭，提供一种非宿主来源的免疫[20]。噬菌体虽被认为不能感染真核细胞，但越来越多的噬菌体疗法研究发现，在经黏膜的给药方式下(如口服、鼻内)均可在血液中检测到噬菌体的存在，通过血液循环噬菌体可转移到全身的各组织器官，如脾、肝、肾甚至大脑[12-14, 21-22]，噬菌体制剂对机体的影响不再局限于直接消灭病原菌，对机体常规指标和免疫状态的潜在影响同样值得深究。
3.1 噬菌体鸡尾酒对仔猪生长性能及常规血液参数的影响本研究表明，连续灌胃20 d由4种致病菌噬菌体组成的噬菌体鸡尾酒对断奶仔猪的生长性能、血常规指标和血清生化指标无显著性影响(第11天时显著降低的血清白蛋白水平在第21天时恢复至对照组水平)。这与前人[23-25]的研究结果相一致，表明本噬菌体制剂对仔猪自身的生长发育影响较小，表现出良好的安全性。另外，本研究所选用的噬菌体均是针对致仔猪腹泻病原菌的噬菌体，但由于本研究未开展攻毒试验，所有仔猪均无腹泻情况发生，故无法评估本噬菌体制剂对腹泻仔猪的治疗或预防作用，但相关文献表明，噬菌体制剂对于由ETEC等致病菌所导致的仔猪腹泻具有显著的改善作用[26]。
在正常生理状态下，机体代谢产生的自由基被抗氧化系统不断清除，二者处于动态平衡状态。在某些病理或环境因素作用下，机体产生过量的自由基以至于无法及时清除导致氧化应激的产生。GSH-Px和CAT是机体两种重要的抗氧化酶类，对于体内自由基的清除起着重要作用[27]。MDA是生物膜脂肪酸受到氧自由基攻击而产生的脂质过氧化物之一，可反应脂质过氧化作用程度[28]。在本研究中，噬菌体组仔猪血清中CAT活力具有升高的趋势，同时血清MDA水平在两组间并无显著差异，说明灌胃噬菌体鸡尾酒对机体抗氧化系统可能具有积极作用。
3.2 噬菌体鸡尾酒对仔猪血清炎症因子和免疫球蛋白水平的影响炎症因子和免疫球蛋白均可反应机体当下的免疫状态。在本研究中，灌胃噬菌体制剂引起仔猪血清中三种免疫球蛋白和促炎因子水平的显著升高。研究表明，噬菌体在经口给药的方式下通常诱导的免疫反应较低，但是在高剂量和长周期情况下往往会导致显著的免疫反应[29]，因为噬菌体进入肠道后可能会跨越肠黏膜进入固有层，之后随血液流动可到达全身各处，从而对黏膜相关淋巴组织和机体其他部位的免疫细胞产生影响[30]。面对跨黏膜进入内环境的噬菌体，机体随即会通过吞噬作用和产生特异性抗体来清除噬菌体[21, 31]。Majewska等[32]研究发现，长期对小鼠饮水中加入高滴度的T4噬菌体(4×109pfu·mL－1)可以激活体液免疫，诱导肠内特异性的分泌型IgA反应和血清IgG反应。与Majewska等[32]的结果类似，在本试验中，噬菌体鸡尾酒灌胃20 d后引起仔猪血清的IgA、IgG和IgM水平显著升高，表明本噬菌体制剂的连续灌胃激活了体液免疫。
关于噬菌体对机体炎症因子水平的影响，前人的研究结果并不一致，噬菌体的纯化程度、噬菌体类型、给药途径以及周期等多种因素都可能会影响噬菌体制剂诱导产生的细胞因子类型[33]。如Zeng等[34]研究发现，饲粮中添加噬菌体(400 mg·kg-1)可引起断奶仔猪血清促炎因子IL-1β和TNF-α水平的显著下降，对IFN-γ水平则无显著影响，表现出抗炎的效果。而在Gogokhia等[35]的研究中，无菌小鼠经口给药纯化的大肠杆菌噬菌体可引起IFN-γ和合成该细胞因子的CD4+T细胞和CD8+T细胞显著扩增，表现出促炎效果，并且在体外条件下该噬菌体或噬菌体DNA可刺激树突状细胞产生促炎因子IL-12、IL-6和抗炎因子IL-10。与Gogokhia等[35]的研究结果相似，在本研究中，连续灌胃噬菌体可导致血清促炎因子水平(IL-1β、IL-17、TNF-α和IFN-γ)的显著升高，抗炎因子水平IL-4和IL-10的显著下降。此外在本研究噬菌体导致血清TGF-β水平出现显著升高，已知TGF-β是一种可由多种细胞产生并具有免疫抑制活性的细胞因子[36]，可通过诱导调节性T细胞(Treg)的分化调节或抑制产生促炎细胞因子IL-17的辅助性T细胞17(Th17)，进而维持免疫稳态[37]，推测噬菌体可能通过TGF-β水平的升高来抑制免疫反应从而提高自身的存活概率，延迟被机体清除。结合仔猪血清免疫球蛋白升高和血清促炎细胞因子水平升高这两个结果，推测本噬菌体制剂通过跨黏膜转位进入了血液循环，从而引起了固有免疫(如TNF-α等细胞因子的水平升高，提示巨噬细胞参与[38])和适应性免疫应答(如IFN-γ和免疫球蛋白水平的升高[38])。
关于噬菌体促炎的原因，除了可能是噬菌体自身导致的促炎效果外，噬菌体裂解宿主菌增殖这一过程所产生的脂多糖LPS也可能是诱因之一。此外噬菌体制剂中过高的LPS水平也会对噬菌体治疗的效果产生不利影响[33]，因此在使用噬菌体制剂治疗之前通常需要去除内毒素。本研究虽未去除噬菌体鸡尾酒中的内毒素，但由于灌胃噬菌体体积小，且仔猪会通过饮水摄入一定量的内毒素，故噬菌体组和对照组两组间摄入的内毒素总量无显著差异，但在将来仍需对噬菌体去除内毒素后再进行深入的试验研究以尽可能地减少混淆因素。
3.3 噬菌体鸡尾酒对仔猪粪样菌群的影响与抗生素相比，噬菌体有严格的宿主特异性，只靶向特定的宿主菌，不会杀死肠道内其他细菌。本研究粪中噬菌体定量结果表明噬菌体灌胃后并未在肠道内增殖，说明肠道内不存在噬菌体的宿主菌，所以连续灌胃本试验所用噬菌体鸡尾酒在较短的时间周期内对动物宿主肠道菌群整体的影响较小。肠道菌群与宿主的能量摄入、免疫系统成熟、激素分泌等多种生理过程密切相关[39]，在本研究中，噬菌体灌胃导致仔猪血液中多种与免疫相关的指标发生了显著变化，考虑到菌群与机体免疫之间的互作关系，推测噬菌体在不存在宿主菌的情况下却导致粪样菌群结构发生改变的原因可能是灌胃噬菌体导致肠道免疫水平发生改变，从而间接影响菌群。
与多样性结果相对应，对组间差异菌群的分析发现，第21天时噬菌体组仔猪Ruminococcus_gauvreauii_group的相对丰度的显著升高。Ruminococcus是已知的短链脂肪酸产生菌之一[40]，其中Ruminococcus_gauvreauii_group可将葡萄糖作为底物发酵生成乙酸[41]。在已知的微生物代谢产物中，针对短链脂肪酸的研究相对最为透彻。短链脂肪酸和产生短链脂肪酸的细菌已被发现可通过抑制炎症反应[42-43]、维持肠道上皮的完整性[42]、保护黏膜免受病原体侵袭和提供结肠细胞营养[44-45]等多种方式来对宿主产生积极影响，并且在多种疾病中发现短链脂肪酸产生菌丰度的降低[46-48]。本研究中短链脂肪酸生成菌相对丰度的升高提示本噬菌体鸡尾酒对于机体可能具有更多间接影响，但具体通过何种方式仍需试验验证。
4 结论连续灌胃由致病菌噬菌体组成的噬菌体鸡尾酒对于仔猪机体生长性能和常规血液参数无显著影响；对血清抗氧化功能有积极作用并显著提高了粪样菌群的多样性，但同时可引起血清免疫球蛋白和促炎细胞因子水平的显著升高。
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(编辑 范子娟)