2. 贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025
2. College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
哺乳动物的舌头作为味觉感受器可以感知鲜、甜、苦、酸和咸5种味觉[1-2]，味觉受体细胞的顶端存在味觉受体，每个味觉受体细胞都存在几种味觉受体，但只表达1种味觉受体[3]。目前研究较多的是味觉受体第一家族(taste receptor 1 family，T1Rs)和味觉受体第二家族(taste receptor 2 family，T2Rs)，其中T1Rs家族包括T1R1、T1R2和T1R3三个成员，分别由Tas1r1、Tas1r2和Tas1r3编码[4]，T1R3分别与T1R1和T1R2形成的异二聚体可以感知鲜味和甜味[5]，而T2Rs则主要感知苦味[1]。目前已知味觉受体除在口腔等味觉器官表达外，还在胰腺、脑、胃肠道、脂肪和睾丸等非味觉组织中表达[1, 5]。深入研究发现，小鼠胰岛细胞T1R3的表达与其胰岛素分泌有关[6]，而大脑椎体细胞和颗粒细胞层中该受体的表达，可能与其脑缺血过程有关[7]。同样地，肠道细胞T1R3/T1R1被激活后可引起生长素释放肽的释放，而存在于肠内分泌细胞的Gα-味导素，则会影响胰高血糖素样肽-1的释放[8-9]。本课题组前期研究结果显示，T1R3/T1R1在小鼠和猪的睾丸间质细胞中高表达，向小鼠睾丸内注射糖精钠，可激活T1R3和Gα-味导素，引起小鼠血清中睾酮、雌二醇和cAMP含量显著增加[10-11]。以上结果说明T1R3/T1R1在睾丸等非味觉器官中表达[12]，并发挥着特殊的非味觉功能，了解味觉受体在雄性生殖过程中的作用对提高雄性生殖具有重要意义。
哺乳动物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin, mTOR)复合物作为丝/苏氨酸蛋白激酶，包括雷帕霉素复合体1(mTOR complex 1, mTORC1)和雷帕霉素复合体2(mTOR complex 2, mTORC2)[13], 其中mTORC1参与细胞自噬、凋亡和能量代谢等过程[14]，mTORC1通过磷酸化p70核糖体S6激酶1(phosphorylating p70 ribosomal S6 kinase 1，p-S6K1)和真核细胞起始因子4E结合蛋白1(unc-51-like kinase 1, ULK1，4E-BP1)来促进蛋白质翻译和细胞生长。同时磷酸化unc51样蛋白激酶(unc-51-like kinase 1, ULK1)复合物从而抑制自噬的发生[15-16]。味觉受体T1R1/T1R3作为哺乳动物的氨基酸感受器，其将氨基酸的感知信号传递给mTOR从而抑制自噬，当味觉受体被抑制，mTOR的抑制作用减弱，阻断翻译起始，自噬增强。相关研究表明，T1R1/T1R3在感知氨基酸刺激后可直接激活mTOR抑制自噬，也可通过提高胞内Ca2+浓度激活ERK1/2从而磷酸化mTOR抑制自噬[17]。在小鼠成肌细胞中发现，蛋氨酸可有效激活通过T1R1/T1R3激活mTOR促进细胞生长[15]，该机制在小鼠胰腺β细胞和心肌成肌细胞中也得到验证[17]。此外，通过小鼠在体试验发现，T1R1敲除小鼠通过抑制mTOR通路从而抑制小鼠总产奶量和β-酪蛋白的合成[18]。现有证据表明，用氟处理后的小鼠睾丸间质细胞可能通过AKT/AMPK-mTOR通路促进自噬体的形成，导致间质细胞自噬加强[19]。而尼古丁处理小鼠后，引发的睾丸间质细胞凋亡率增加，以及睾酮合成下降，显示与mTOR介导AKT/Ca2+信号通路有关[20]。
目前有关T1Rs在雄性生殖上的研究集中于精子或生精细胞[21]，睾丸间质细胞作为分泌睾酮的重要生殖细胞，已有研究表明其自噬相对活跃，自噬程度与睾酮合成密切相关，可能通过自噬来调控胆固醇摄入进而影响睾酮合成[11, 22]。且味觉受体已被发现在睾丸间质细胞高表达[11]。基于此，本试验以从江香猪为研究对象，培养原代睾丸间质细胞，转染TAS1R3干扰载体，通过qRT-PCR和Western blot检测沉默TAS1R3基因对通路基因TAS1R1、ERK1、ERK2、mTOR和自噬基因BECN1、MAP1LC3B的影响，以期为进一步研究TAS1R3基因通过mTOR调控下的自噬对雄性生殖的影响提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料1.1.1 试验动物 选择30日龄健康雄性从江香猪3头，平均体重(8.5±1.5)kg，由贵州省绿生源畜牧技术开发有限公司提供，所有试验均由贵州大学机构动物伦理委员会批准。采用手术法采集公猪两侧睾丸，置于含3%双抗的PBS溶液中带回实验室，将所采集的3头公猪睾丸组织混合4 h内分离培养睾丸间质细胞。
1.1.2 主要试剂及仪器 Gibco北美胎牛血清、DMEM/F12细胞培养基、I型胶原酶、PBS溶液、TRIzol、无内毒素质粒提取试剂盒、RIPA蛋白裂解液、PMSF溶液购自贵阳西宝生物技术有限公司(贵阳)；LipofectamineⓇ3000转染试剂盒、逆转录试剂盒、0.25%胰酶、SYBR Green qPCR Master Mix购自贵州卓一生物生物科技有限公司。3β-HSD染色液：A液：1 mg氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和0.5 mg脱氢表雄酮(DHEA)溶于0.5 mL二甲基亚砜；B液：10 mg辅酶I(NAD)溶于9.5 mL PB磷酸盐缓冲液中；
A液和B液混合后为工作液，4 ℃保存备用。抗体p-mTOR(1∶1 000稀释)、T1R3(1∶1 000稀释)、T1R1(1∶1 000稀释)、p-S6K1(1∶1 000稀释)和β-actin(1∶5 000稀释)购自Affinity Bioscience公司，p-ERK12(1∶1 200稀释)购自ABclonal公司，二抗(1∶16 000稀释)购自Immunoway公司。3β-HSD(1∶100稀释)购自Santa cruz公司。PCR扩增仪(型号; C1000TouchTM)、凝胶成像系统、荧光定量PCR仪(型号：CFX96 Real-Time System)购自美国Bio-rad公司。正置荧光显微镜(型号：Nikon ECLIPSE-Ni+DS-Ri2)购自日本尼康公司。
1.2 试验方法1.2.1 睾丸间质细胞培养与鉴定 香猪睾丸间质细胞的培养与鉴定参照王维勇[23]的方法。在超净工作台中，用酒精清洗睾丸1次，用含双抗的PBS清洗睾丸2~3次，用镊子小心剥离睾丸表面的白膜，然后置于已4 ℃预冷的75%酒精中消毒2~3 min，用PBS清洗2~3次，用已灭菌的剪刀剪成肉泥状，用0.1% I型胶原酶稀释后装入50 mL无菌离心管中，加入组织块2~3倍体积的0.1% I型胶原酶进行消化，37 ℃水浴1 h，期间每隔8~10 min晃动1次离心管；消化结束后(此时离心管中应没有肉眼可见的组织块)，用含10%胎牛血清的培养基终止胶原酶消化，然后经200目及400目细胞筛过滤，以1 000 r·min－1的速度离心10 min，弃上清；离心结束后用不含胎牛血清DMEM/F12培养液清洗细胞沉淀，以除去血细胞。然后，以800 r·min－1离心8 min，弃上清；离心结束后用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液重悬细胞沉淀，以600 r·min－1离心5 min，弃上清；离心结束后用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液重悬细胞沉淀制备细胞悬液并接种于细胞瓶进行扩大培养，4 h后更换培养基。
采用间接免疫荧光法鉴定分离培养的间质细胞纯度，当六孔板中的细胞密度达70%~80%时，弃掉培养液，PBS清洗3次，每次3 min; 4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS清洗3次，每次3 min; 0.35%TritonX-100通透细胞15 min，PBS清洗3次，每次3 min; 5%山羊血清溶液37 ℃封闭40 min，PBS清洗3次，每次3 min; 3β-HSD抗体(1∶100稀释)4 ℃摇床过夜，PBS清洗3次，每次3 min; FITC标记的山羊抗鼠二抗(1∶400)于37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次3 min; 用浓度为1 μg·mL－1的DAPI溶液染核10 min，PBS清洗3次，每次3 min，将细胞置于正置显微镜下观察拍照。
1.2.2 shRNA引物 根据课题组前期合成并筛选的干扰序列与空白序列为: GGCAAGT TCTTCGGCTTCTTC、GTTCTCCGAACGTGTCACGT，正义链模板5′端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的黏端互补，反义链末端5′端添加GATC，与BamHI酶切后的末端互补，中间序列插入TCAAGAGA的Loop结构，转录终止序列为T6结构。
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表 1 shRNA引物信息 Table 1 shRNA primer information |
1.2.3 TAS1R3基因干扰载体转染与检测 将生长良好的睾丸间质细胞接种于六孔板，待细胞长至70%~80%时，按照Lipofectamine3000说明书进行转染，分别将shRNA-TAS1R3和shRNA-NC转染至睾丸间质细胞，每孔2 500 ng，空白组不转染质粒，加完样后十字方向轻轻摇匀，每个转染组3个重复。置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后于荧光显微镜下观察并拍照，利用qRT-PCR检测干扰效率。
1.2.4 qRT-PCR引物设计 根据NCBI上TAS1R3、TAS1R1、ERK1、ERK2、mTOR、BECN1和MAP1LC3B基因的mRNA序列，以β-actin为内参基因，利用Primer5.0软件进行引物设计，引物序列详见表 2。
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表 2 引物信息 Table 2 Primer information |
1.2.5 qRT-PCR检测 采用TRIzol法提取转染成功的睾丸间质细胞RNA，按照反转录试剂盒获得cDNA，采用实时荧光定量PCR检测目的基因在干扰组和NC组中的表达水平。反应体系为：ddH2O 3.2 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，2×SYBR Premix ExTaqTMⅡ 5 μL。反应条件为：50 ℃酶失活2 min；95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，40个循环。试验重复3次，每个样品进行4次平行试验。
1.2.6 Western blot分析 使用蛋白裂解液对转染好的细胞进行裂解，提取总蛋白，利用BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定，对蛋白浓度进行统一后加入5×SDS上样缓冲液，100 ℃变性10 min后进行SDS-PAGE电泳，在浓缩胶中60 V电泳30 min，在分离胶110 V电泳1 h。电泳后采用湿转法110 V转膜70 min，将转好蛋白的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜在5%脱脂奶粉中37 ℃孵育2 h。用TBST溶液将膜清洗干净后后加入相应一抗4 ℃摇床过夜。将孵育好的杂交膜用TBST溶液清洗3次，每次5 min，加入二抗溶液室温孵育1.5 h，将杂交膜用TBST溶液清洗3次，每次5 min，采用ECL超敏发光液显示蛋白条带。
1.2.7 数据统计与分析 采用2-ΔΔCt法计算细胞中目的基因mRNA表达水平，运用Image J1.8.0软件对Western blot条带进行灰度分析，利用GraphPad Prism9.0软件采用单因素方差分析数据，运用Multiple comparisons进行多重比较，数据均以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 从江香猪睾丸间质细胞培养与鉴定从组织分离的睾丸间质细胞最初呈圆形，4 h开始贴壁后增殖分化长出触角(图 1A)，16 h的细胞相较于4 h细胞增殖分化明显(图 1B)。采用3β-HSD酶活性染色(图 1C)及间接免疫荧光(图 1D~1F)检测显示原代间质细胞纯度超过90%，可用于后续试验。
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A和B分别为原代睾丸间质细胞培养4和16 h；C为睾丸间质细胞3β-HSD酶活性染色；D~F为3β-HSD间接免疫荧光染色 A and B are primary Leydig cells cultured for 4 and 16 h, respectively; C is 3 β-HSD enzyme activity staining for Leydig cells; D-F are 3 β-HSD indirect immunofluorescence staining 图 1 睾丸间质细胞原代细胞培养与鉴定 Fig. 1 Primary cultured and identification of Leydig cell |
干扰载体由上海吉玛制药技术有限公司合成，测序结果见图 2, 可知插入的重组质粒片段与预期设计的序列一致，可用于后续试验。
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图 2 重组质粒测序结果 Fig. 2 Sequencing results of recombinant plasmids |
将睾丸间质细胞接种于6孔板上，待细胞融合度达80%左右进行转染，24 h后在荧光显微镜下可以观察到干扰组红色荧光和NC组绿色荧光。而空白对照组未见荧光(图 3)。
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A. shRNA-TAS1R3; B. shRNA-TAS1R3-NC. C. 空白对照 A. shRNA-TAS1R3; B. shRNA-TAS1R3-NC; C. Blank control 图 3 RNA干扰载体转染至睾丸间质细胞 Fig. 3 Transfection of RNA interference vectors into legdig cells |
干扰载体转染至细胞48 h后，分别提取细胞总RNA和总蛋白，RNA逆转录后利用qRT-PCR检测各组内β-actin和TAS1R3 mRNA的表达量。蛋白条带进行灰度值分析后计算蛋白表达量。其中干扰载体干扰TAS1R3基因mRNA的效率为79.97% (图 4A)。在蛋白上的干扰效率为76.03%(图 4C)。
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A. 干扰载体转染至细胞后基因TAS1R3的mRNA表达量；B. 干扰载体转染至细胞后T1R3的蛋白条带；C为T1R3蛋白相对表达量。***. P＜0.01。下同 A. mRNA expression of TAS1R3 gene after transfection into cells; B. Protein band of T1R3 after interference vector transfection into cells; C. Relative expression of T1R3 protein. ***. P < 0.01. The same as below 图 4 TAS1R3基因干扰效率检测 Fig. 4 Detection of TAS1R3 gene interference efficiency |
提取干扰组和NC组细胞总RNA和蛋白，RNA逆转录获得cDNA。采用qRT-PCR技术检测沉默TAS1R3后TAS1R1、mTOR、ERK1、ERK2、BECN1和MAP1LC3B基因mRNA的表达量。同时通过Western blot技术检测蛋白p-mTOR、T1R1、p-S6K1、p-ERK12和Beclin 1蛋白的表达量。qRT-PCR结果显示抑制TAS1R3基因后，TAS1R1、mTOR、ERK1、ERK2、BECN1和MAP1LC3B基因表达量极显著低于对照组(P＜0.01，图 5A)，p-mTOR、T1R1、p-S6K1、p-ERK12蛋白表达量均极显著低于对照组(P＜0.01)，自噬蛋白Beclin 1极显著高于对照组(P＜0.01，图 5C)。
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A. 干扰载体转染至细胞后基因TAS1R3、mTOR、ERK1、ERK2、BECN1和MAP1LC3B的mRNA表达量；B. 干扰载体转染至细胞后p-mTOR、T1R1、p-S6K1、Beclin 1、p-ERK1/2的蛋白条带；C. 蛋白p-mTOR、T1R1、p-S6K1、Beclin 1、p-ERK1/2相对表达量结果 A. mRNA expression of TAS1R3, mTOR, ERK1, ERK2, BECN1 and MAP1LC3B after interference vector transfection; B. Protein band of p-mTOR, T1R1, p-S6K1, Beclin 1 and p-ERK1/2 after interference vector transfection; C. Result of relative expression of protein p-mTOR, T1R1, p-S6K1, Beclin 1 and p-ERK1/2 图 5 TAS1R3基因干扰后对相关基因蛋白表达量的影响 Fig. 5 Effect of TAS1R3 gene interference on protein expression of related genes |
味觉受体T1Rs作为G蛋白偶联受体(G-protein couple receptors, GPCRs)超家族C亚型成员，其结构包含1个捕蝇草结构域(Venusflytrap domain，VFT)、富半胱氨酸结构域(Cysteine-rich domain, CRD)和螺旋跨膜结构域(Heptahelical transmembranendomain，HD)，其中VFT上具有很多识别和结合配体的位点[24]。T1R1/T1R3作为氨基酸的感受器，可以将胞外氨基酸可用性的信号传递至胞内mTORC1，mTORC1对氨基酸的感知在哺乳动物上具有保守性，味觉受体被干扰引起的氨基酸缺陷和细胞饥饿都可以引起自噬(图 6)，有研究表明当味觉受体被干扰后，细胞会上调编码几种转运蛋白的mRNA，以增加对其它氨基酸的摄取[25]。已有相关研究表明，在小鼠成肌细胞中干扰TAS1R1基因会抑制mTOR的表达，在大鼠心肌细胞中干扰TAS1R3基因同样可抑制mTOR表达，且自噬水平升高[15]。本试验通过转染TAS1R3干扰载体至睾丸间质细胞观察到TAS1R3基因在mRNA水平和蛋白水平均受到抑制，为后续研究该基因在间质细胞中调控自噬通路提供理想试验材料。
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图 6 T1R1/T1R3被激活后调节mTOR的通路图[16] Fig. 6 Pathway diagram of regulating mTOR after T1R1/T1R3 is activated[16] |
自噬作为哺乳动物机体内的保守代谢过程，通过形成双层膜结构与溶酶体结合将细胞器和老化的蛋白降解为小分子的氨基酸和核苷酸用于细胞重新利用[26]。LC3和Beclin 1是参与自噬的重要标志物，其中LC3主要参与自噬体膜的延伸和形成，Belin 1参与自噬体的起始和成熟[27]。本试验发现，当TAS1R3基因被干扰，MAP1LC3B和BECN1的mRNA表达增加，Beclin 1蛋白表达量增加，在对大鼠心肌细胞和Hela (Henrietta Lacks)细胞的研究发现，敲除T1R3会增加细胞自噬程度，减少对ULK1的抑制[17]。mTOR作为营养、能量和生长等多种通路的感受器，整合外界摄入的氨基酸用以支持蛋白合成和细胞生长[28]。本试验表明，当TAS1R3基因被干扰，TAS1R1、mTOR、ERK1和ERK2基因在mRNA水平和蛋白水平均降低，其中T1R1与T1R3形成的异二聚体共同参与对味觉的识别，mTOR位于味觉受体下游，受到味觉受体的正向调控。而ERK1/2也可直接磷酸化mTORC1的一个亚基Raptor促进mTORC1的激活。mTORC1被激活后，除可以抑制自噬，还可磷酸化S6K1和4E-BP1来促进细胞生长，本试验观察到当mTOR蛋白表达降低，p-S6K1蛋白表达降低，此结果在小鼠成肌细胞中观察到相同的结果。此外，在小鼠中还发现，T1R1敲除小鼠4E-BP1和p-S6K1表达降低，乳腺总产奶量降低[18]。张伟[29]研究发现，丝氨酸可激活猪源T1R1/T1R3，且过表达T1R1/T1R3时，丝氨酸刺激可显著促进mTOR、S6K1和ERK1/2的磷酸化，推测T1R1/T1R3可通过S6K1和ERK1/2调节mTOR。同样在小鼠成肌细胞中也发现蛋氨酸可通过T1R1/T1R3-PLC-Ca2+-ERK1/2信号通路调节mTOR[30]，具体机制如图 6所示。
哺乳动物睾丸中主要含有间质细胞、支持细胞和生精细胞3种[31]，间质细胞位于睾丸生精小管之间，虽然数量只有3%~5%，但分泌了90%以上的睾酮[31-32]。睾酮不仅可以维持雄性第二性征，对生精细胞的生成也有促进作用。现有研究已表明，自噬参与了精子发生和睾酮生成等生理作用[33-34]，在小鼠上已经发现自噬参与了睾酮合成[22]，在大鼠上研究发现，黄曲霉素B1可通过抑制AMPK/mTOR介导的自噬能量通路，促进睾丸间质细胞生成活性氧生成，诱导细胞凋亡[35]。目前更多的研究集中于药物刺激引起的机体和细胞自噬，鲜有与味觉受体进行结合的研究，味觉受体作为哺乳动物摄入外界物质的识别受体，目前已发现在多个组织和器官参与了生理过程的调控，基于此，本试验以睾丸间质细胞为研究对象，将味觉受体T1R1/T1R3与自噬相关联，探究味觉受体T1R1/T1R3在间质细胞中对自噬的调控机理。本试验结果表明，T1R3可能通过mTOR调控自噬过程，为研究TAS1R3基因在雄性生殖过程中的作用提供了借鉴。
4 结论本试验在培养从江香猪睾丸间质细胞的基础上，将TAS1R3干扰载体转染至细胞内，干扰TAS1R3基因的表达，观察到通路基因TAS1R1、ERK1、ERK2、mTOR和相关蛋白T1R1、p-ERK1/2、p-S6K1、p-mTOR表达降低，而自噬基因BECN1、MAP1LC3B和蛋白Beclin 1表达升高，推测TAS1R3基因参与了雄性生殖自噬的负调控，为探究味觉受体T1R1/T1R3在雄性生殖中的作用提供了理论依据。
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(编辑 范子娟)