2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省重点实验室，成都 610041
, YANG Lu1, XIANG Hua1
, ZHANG Huanrong1, REN Yupeng1, YANG Falong1, HE Honghong1, ZHU Jiangjiang2
2. Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 610041, China
1977年，耶鲁大学学者在人类基因组库中首次筛选并克隆出BIRC5基因，发现BIRC5是凋亡抑制家族(IAP)中最小的成员之一[1]。BIRC5基因大小为14.5 kb，位于真核生物染色体臂的17q25处，编码142个氨基酸，包含4个外显子和3个内含子[2]。BIRC5作为凋亡抑制家族较为特殊的成员，仅有一个BIR结构域和由Cys/His基锌指折叠的70个氨基酸组成，且此结构域被认为对细胞凋亡起着至关重要的作用[3]。随着BIRC5基因的发现，研究者们对其功能展开了一系列地研究。Adams等[4]发现，BIRC5蛋白与染色体前体蛋白(chromosomal passenger proteins)、极光激酶B(aurora-B kinase)、内着丝裂蛋白(the inner centromere protein)及端粒酶盘抗原(the telophase disk antigen，TD-60)共同组成染色体前体蛋白(chromosomal passenger protein，CCP)复合物，参与细胞有丝分裂的调控。Ebrahimiyan等[5]研究发现，BIRC5蛋白能促进人T细胞和B细胞的增殖。而后，Sohn等[6]在关于急性髓性白血病的研究中发现，BIRC5能通过调节机体T细胞的发育进而调控机体的免疫系统。BIRC5蛋白的表达可促进神经母细胞瘤内血管的形成[7]。Serpeloni等[8]发现，敲低BIRC5基因表达后可促进肺腺癌A549细胞的增殖。同年，Narimani等[9]利用CRISPR/Cas9技术敲除BIRC5基因后可诱导白血病细胞系HL60和KG1的凋亡。Yang等[10]研究发现，敲低BIRC5基因表达后能抑制肺癌细胞的增殖并诱导其凋亡。Li等[11]利用生物信息学和细胞生物学技术发现，BIRC5基因可调控人源骨肉瘤细胞的凋亡过程。可见，BIRC5基因在细胞周期调节、细胞凋亡抑制、细胞适应性、血管形成、机体免疫应答及miRNA的调控方面发挥着重要的作用[12-16]。
在调控细胞凋亡作用方面，BIRC5被认为是目前所发现具有最强作用的凋亡抑制因子[17]。如BIRC5蛋白可通过抑制细胞内Caspase3和Caspase7的活性，进而抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞增殖[18-19]。同时，BIRC5可通过靶向Caspase 9和线粒体衍生的Caspase激活物直接抑制凋亡蛋白结合蛋白，从而在细胞凋亡过程中起到抑制作用[20]。研究发现，在大部分的肿瘤患者中，BIRC5基因的过表达能抑制肿瘤细胞凋亡，进而降低肿瘤患者的生存率[21]。BIRC5还可与Kruppel样因子2(Kruppel2，KLF2)相互作用后抑制肺腺癌细胞的增殖、侵袭，诱导肺腺癌细胞凋亡[22]。BIRC5还可在胚胎组织(如神经元前体细胞和胚胎成纤维细胞)和肿瘤(包括癌细胞和癌症干细胞)中高度表达从而直接影响胚胎细胞和癌细胞的有丝分裂及凋亡过程[23]。对于BIRC5蛋白抑制细胞凋亡及其具体的机制仍不清楚，且目前尚无山羊BIRC5基因序列及其在调控细胞凋亡方面的相关报道。羊口疮病毒主要感染羊胚胎皮肤细胞、羊和牛原代睾丸细胞和肾细胞等[24-25]。
本试验以简州大耳羊为研究对象，采用RT-PCR技术克隆山羊BIRC5基因序列并进行生物信息学分析；在构建pcDNA3.1(+)-BIRC5真核表达载体的基础上，将其转染山羊睾丸细胞，研究BIRC5蛋白对细胞周期、凋亡及凋亡相关基因表达的影响；同时敲低BIRC5基因的表达，探究其对细胞周期、凋亡及凋亡相关基因表达的影响，为进一步全面揭示BIRC5基因功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物本试验所用动物为3只3日龄3 kg左右健康简州大耳羊公羊，屠宰后立即取其脾组织样本，使用无菌的DEPC水清洗组织后将其用锡箔纸包好，迅速投入液氮中保存，备用。pcDNA3.1(+)真核表达载体由西南民族大学青藏高原研究院惠赠。
1.2 主要仪器与试剂CO2恒温培养箱、PCR仪、高速冷冻离心机Sorvall ST 8R购自ThermoFisher Scientific公司；荧光倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；电泳仪、凝胶成像仪、半干转移电泳槽购自Tanon公司；恒温水浴摇床购自上海齐欣科学仪器有限公司；超净工作台购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；多功能免染蛋白印记系统购自日本Cytiva公司。
DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker、Premix TaqTM、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ、BamH Ⅰ限制性内切酶、Xhol Ⅰ限制性内切酶、T4连接酶购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒、PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)购自北京索莱宝科技有限公司；TRIzol、RIPA、opti-mem减血清培养基、LipoGeneTM 3000转染试剂购自ThermoFisher Science公司；胎牛血清(FBS)购自北京全式金公司；Annexin V-FITC/PI Kit凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司；DMEM培养基购自Gibco公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自武汉博士德生物有限公司；Protein Maker(M222)购自北京康润诚业生物科技有限公司(GenStar)；HRP标记山羊抗鼠IgG、鼠anti-Flag单抗(sc-166355)购自Abmart公司；ECL化学发光底物购自美国Millipore公司。
1.3 试验方法1.3.1 山羊脾组织总RNA提取及cDNA合成 使用TRIzol法提取简州大耳羊脾组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测确保RNA完整性，分光光度计测定总RNA样品的浓度以及OD260 nm/OD280 nm值，确保符合试验要求。等量混合后，按照反转录试剂盒说明书将总RNA及时反转录为cDNA，置－20 ℃保存备用。
1.3.2 山羊BIRC5基因的克隆及生物信息学分析 根据NCBI预测的山羊BIRC5基因序列(XM_005694094.3)，利用Primer Premier 5设计引物(上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表 1)，以“1.3.1”保存的cDNA为模板进行BIRC5基因的扩增。PCR扩增体系：Taq PCR Master Mix9(2×)12.5 μL，上、下游引物分别为1.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，ddH2O补足至20 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，50.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环，72 ℃完全延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后对目的片段进行切胶回收，将回收产物与pMD19-T Simple载体进行连接并转化，阳性菌落PCR鉴定并测序鉴定正确后，将重组质粒命名为pMD19-BIRC5。参考王宪军等[26]方法对序列进行分析。
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表 1 引物信息 Table 1 Primers information |
1.3.3 真核表达载体pcDNA3.1(+)-BIRC5的构建及鉴定 以BIRC5的CDS区序列为基础设计特异性引物，引物序列见表 1。上游引物划线部分为BamH Ⅰ酶切位点，斜体部分为Kozak序列，划线加粗部分为Flag标签，下游引物划线部分为Xhol Ⅰ酶切位点。使用限制性内切酶BamH Ⅰ及Xhol Ⅰ线性化空载体pcDNA3.1(+)并纯化，利用引物扩增获得BIRC5编码区。使用T4连接酶进行连接转化，经测序验证正确后将真核表达载体命名为pcDNA3.1(+)-BIRC5。
1.3.4 检测BIRC5蛋白在山羊睾丸细胞中的表达 本试验所用山羊睾丸细胞为实验室前期分离和纯化获得[27]。操作方法即取3日龄简州大耳羊公羊睾丸组织，去除白膜后暴露海绵组织，使用眼科剪将组织剪碎，使之成为体积约1 mm3的块状，采用0.125%胰蛋白酶消化法分离获得山羊睾丸细胞。将第五代生长良好的睾丸细胞接种于6孔细胞培养板内，待细胞生长至70%~80%时，按LipoGeneTM 3000转染试剂说明书进行转染，设置空白对照组、pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-BIRC5共3组，每组3个重复。转染48 h后，加入RIPA裂解液收集蛋白样品。细胞总蛋白经SDS-PAGE电泳后，转入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上并进行封闭过夜。随后分别加入鼠源Flag单克隆抗体和兔源β-Actin，室温摇床孵育1 h。利用HRP标记山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG，室温摇床孵育2 h，随后使用ECL试剂显色，成像。
1.3.5 山羊BIRC5基因siRNA片段的合成与转染 将“1.3.2”克隆获得的BIRC5基因的CDS区序列送上海吉玛基因股份有限公司合成3条siRNA干扰片段，序列见表 2。泛表达转录子基因(ubiquitously-expressed transcript，UXT) 作为试验的内参基因[28]，引物序列见表 3，选择第五代细胞进行转染，具体步骤参照王江林等[29]的方法。转染48 h后，收集细胞提取总RNA并反转录为cDNA，RT-qPCR技术检测BIRC5基因的mRNA表达水平，筛选有效的siRNA干扰片段。每组设置3个重复。
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表 2 siRNA的序列 Table 2 siRNA sequences |
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表 3 凋亡相关基因引物序列 Table 3 Primer sequence of apoptosis-related genes |
1.3.6 BIRC5对山羊睾丸细胞周期的影响 参照“1.3.5”方式进行转染，待12孔培养板内细胞生长至70%~80%时，将真核表达载体pcDNA3.1(+)-BIRC5和pcDNA3.1(+)分别转染细胞检测过表达对细胞周期的影响。将干扰效率70%以上的干扰片段和阴性对照组分别转染细胞检测敲低BIRC5基因表达对细胞周期的影响。转染48 h后，按细胞周期检测试剂盒操作步骤收样，用流式细胞仪进行检测。每组设3个重复孔，试验重复3次。
1.3.7 BIRC5对山羊睾丸细胞凋亡的影响 同样参考“1.3.5”方式。转染48 h后，按细胞凋亡检测试剂盒操作步骤用不含EDTA的胰酶消化细胞，收样，立即使用流式细胞仪进行检测。每组设3个重复孔，试验重复3次。
1.3.8 BIRC5对山羊睾丸细胞凋亡相关基因表达的影响 根据NCBI公布的山羊凋亡相关基因Bax、Caspase3、Caspase7、Bcl-2及牛凋亡相关基因p53、BCL2L11、PARP1序列相似区域设计引物，序列见表 3。以UXT作为内参基因[28]，RT-qPCR检测BIRC5对细胞凋亡相关基因mRNA表达水平的影响。每组设3个重复孔，试验重复3次。
1.3.9 数据统计与分析 按照Livak和Schmittgen[30]文献对实时荧光定量数据进行分析，采用2-ΔΔCt方法进行处理。采用SPSS18.0软件对试验数据进行单因素方差分析，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。
2 结果 2.1 山羊BIRC5基因CDS区的克隆及序列分析胶回收产物克隆转化后进行PCR鉴定，得到与预期BIRC5基因大小相符合的条带(图 1A)。经测序得到BIRC5基因序列长度为506 bp，包含5′UTR 28 bp，CDS区429 bp，3′UTR 49 bp，编码142个氨基酸残基，上传其CDS序列获得GenBank登录号：ON645223。BIRC5蛋白分子式为C727H1120N192O217S9，总分子量为16.3 ku，为偏酸性不稳定蛋白。BIRC5属于亲水性蛋白(图 1B)，无信号肽结构(图 1C)，不存在跨膜结构域(图 1D)，共有6个磷酸化位点，分别为3个丝氨酸(Serine)和3个苏氨酸(Threonine)(图 1E)。二级结构中，以α螺旋为主，占比56.34%(图 1F)。三级结构预测见图 2A。STRING数据库预测与BIRC5蛋白可能存在互作的蛋白包括：KIF2C(kinesin family member 2C)、AURKB(Aurora Kinases B)、AURKA(aurora kinase A)、CASP3(Caspase 3)、DIABLO(direct IAP binding protein with low PI)、XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)、CASP9(Caspase 9)、CDCA8(cell division cycle associated 8)、INCENP (inner centromere protein)、BUB1 (budding uninhibited by benzimidazoles 1)(图 2B)。系统进化树显示，山羊BIRC5基因与牛亲缘关系最近，生物分类学保持一致，然后是绵羊、马、猪、猫、狗、人、大鼠，最远是小鼠(图 2C)。
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A.山羊BIRC5克隆的凝胶电泳图(M.2000 bp DNA相对分子质量标准；N.阴性对照；P.BIRC5基因)；B.山羊BIRC5蛋白质疏水结构预测；C.BIRC5蛋白的信号肽分析；D.BIRC5蛋白跨膜结构预测；E.BIRC5序列的磷酸化位点预测；F.BIRC5蛋白质二级结构分析 A.Gel electropherogram of the goat BIRC5 clone (M.DL 2000 DNA Marker; N.Negative control; P.BIRC5 Gene); B.Prediction of hydrophobic structure of BIRC5 protein; C.Signal peptide analysis of goat BIRC5 protein; D.Prediction of transmembrane structure of goat BIRC5 protein; E.Predicted phosphorylation site in goat BIRC5 sequence; F.Secondary structure prediction of goat BIRC5 protein 图 1 山羊BIRC5基因克隆及BIRC5蛋白生物信息学分析 Fig. 1 BIRC5 cloning and bioinformatics analysis of BIRC5 protein in goat |
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A.山羊BIRC5蛋白三级级结构预测；B.山羊BIRC5蛋白与其他蛋白相互作用网络；C.不同物种间BIRC5蛋白的系统进化树 A.Tertiary structure prediction of goat BIRC5 protein; B.The interaction network of goat BIRC5 with other proteins; C.Phylogenetic tree of BIRC5 protein among different species 图 2 BIRC5蛋白生物信息学分析 Fig. 2 The bioinformatics analysis of BIRC5 protein |
对纯化后的质粒pcDNA3.1(+)-BIRC5进行BamH Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切，得到5 400和500 bp左右长度片段(图 3)。将目的基因胶回收后进行测序鉴定，表明成功构建载体pcDNA3.1(+)-BIRC5。
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M1.2000 bp DNA相对分子质量标准；1、2、3.双酶切产物；M2.5000 bp DNA相对分子质量标准 M1.DL 2000 DNA Marker; 1, 2, 3.Double enzyme digestion product; M2.DL 5000 DNA Marker 图 3 真核表达载体pcDNA3.1(+)-BIRC5双酶切鉴定 Fig. 3 Double enzyme digestion of eukaryotic overexpression vector pcDNA3.1(+)-BIRC5 |
以β-Actin为内参，Western blot结果显示，转染了pcDNA3.1(+)-BIRC5质粒的睾丸细胞中检测到了标签蛋白Flag的表达(17 ku)，而转染空载pcDNA3.1(+)的细胞内无Flag蛋白的表达，表明睾丸细胞内成功表达BIRC5蛋白(图 4)。
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图 4 BIRC5在山羊睾丸细胞内的表达 Fig. 4 Expression of BIRC5 in testicular sertoli of goat |
RT-qPCR检测结果显示(图 5)，与对照细胞组表达水平相比，BIRC5-siRNA1对BIRC5的干扰效果最好，可降低BIRC5基因mRNA表达水平达70%，达到了极显著水平(P < 0.01)，可作为后续试验材料。
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**代表P＜0.01；*代表P＜0.05。下同 **represents P < 0.01;* represents P < 0.05. The same as below 图 5 定量检测siRNA 48 h后BIRC5的mRNA水平变化 Fig. 5 BIRC5 mRNA expression level changes through transfection siRNA after 48 h |
与对照细胞组(59.49%±0.94%)相比较，转染pcDNA3.1(+)-BIRC5组G0/G1期细胞数(45.25%±1.15%)极显著降低；而与对照细胞组(40.51%±0.94%)相比较，pcDNA3.1(+)-BIRC5组的G2/M+S期细胞数占比约为(54.75%± 1.15%)，细胞数上升呈极显著水平(图 6)。同时，从相反的方向验证了敲低BIRC5基因表达对细胞周期的影响。结果显示，与对照细胞组(61.15%±1.30%)相比较，转染BIRC5-siRNA1组的G0/G1期细胞数(77.58%±1.48%)极显著上升；而与对照细胞组(22.42%±1.30%)相比较，BIRC5-siRNA1组细胞的G2/M+S期占比约为(38.85%±1.48%)，细胞数下降呈极显著水平(图 6)。可见，BIRC5蛋白的表达促进山羊睾丸细胞被阻滞于G2/M+S期。
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A.转染pcDNA3.1(+)-BIRC5质粒的睾丸细胞的周期检测；B.转染 BIRC5-siRNA1片段的睾丸细胞的周期检测 A.Detection of cell cycles in goat testis cells transfected with pcDNA3.1(+)-BIRC5 plasmid; B.Detection of cell cycle in goat testis cells transfected with BIRC5-siRNA1 图 6 过表达或敲低BIRC5基因对睾丸细胞周期的影响 Fig. 6 Effect of overexpressing or interfering BIRC5 on cycle of testicular sertoli |
与转染对照细胞组早期凋亡率(2.72%±0.17%)、晚期凋亡率(12.03%±1.49%)和总凋亡率(14.75%±1.39%)相比，转染真核表达载体pcDNA3.1(+)-BIRC5的细胞的早期凋亡率(2.23%±0.19%)、晚期凋亡率(9.13%±0.86%)和总凋亡率(11.36%±0.69%)显著降低(P < 0.05)(图 7A、B、E)。同时，从相反的方向验证了敲低BIRC5基因表达对细胞凋亡的影响。结果显示，转染BIRC5-siRNA1组细胞的早期凋亡率为(3.83%±0.17%)，晚期凋亡率为(18.82%±0.74%)，总凋亡率为(22.65%±0.90%)；其早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率极显著高于转染对照细胞组早期凋亡率(2.98%±0.32%)、晚期凋亡率(15.34%±0.68%)和总凋亡率(18.82%±0.43%)。可见，BIRC5蛋白的表达可抑制山羊睾丸细胞的凋亡(图 7C、D、F)。
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A.转染pcDNA3.1(+)-BIRC5质粒的睾丸细胞的流式细胞图；B.转染pcDNA3.1(+)质粒的睾丸细胞的流式细胞图；C.转染BIRC5-siRNA1片段的睾丸细胞的流式细胞图；D.转染Negative Control片段的睾丸细胞的流式细胞图；E.BIRC5过表达对山羊睾丸细胞凋亡的影响；F.siRNA干扰BIRC5对山羊睾丸细胞凋亡的影响 A.Flow cytometry of transfecting pcDNA3.1(+)-BIRC5 into goat testis cells; B.Flow cytometry of transfecting pcDNA3.1(+) into goat testis cells; C.Flow cytometry of transfecting BIRC5-siRNA1 into goat testis cells; D.Flow cytometry of transfecting Negative Control into goat testis cells; E.The effects of pcDNA3.1(+)-BIRC5 on apoptosis of goat testis cells; F.The effects of BIRC5-siRNA1 on apoptosis of goat testis cells 图 7 过表达或敲低BIRC5基因对睾丸细胞凋亡的影响 Fig. 7 Effect of overexpressing or interfering BIRC5 on apoptosis of testicular sertoli |
由图 8A可以看出，与对照组细胞相比较，转染pcDNA3.1(+)-BIRC5后可导致细胞内促凋亡基因Caspase7、p53、BCL2L11和抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达水平极显著下降(P < 0.01)，Bax表达显著下降(P < 0.05)，而Caspase3和PARP1 mRNA表达无显著变化。同样，从相反的方向发现，与对照组细胞相比较，敲低BIRC5基因表达后Caspase3、Caspase7和PARP1 mRNA表达极显著上升(P < 0.01)，p53和Bcl-2的表达显著下降，而Bax和BCL2L11表达无显著变化(图 8B)。
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A.过表达BIRC5基因对睾丸细胞中凋亡相关基因表达的影响；B.敲低BIRC5基因表达对睾丸细胞中凋亡相关基因表达的影响 A. The effect of overexpression of BIRC5 gene on expression of apoptosis-related genes in goat testis cell; B. The effect of silencing BIRC5 gene on expression of apoptosis-related genes in goat testis cell 图 8 过表达或敲低BIRC5基因表达对睾丸细胞中凋亡相关基因表达的影响 Fig. 8 The effect of overexpression and silencing of BIRC5 gene on expression of apoptosis-related genes in goat testis cell |
在人[31-32]、牛[2]、鼠[33-34]等生物体上已有关于BIRC5基因的研究，而山羊BIRC5基因的功能研究尚未见报道。本研究以简州大耳羊为研究对象，克隆得到山羊BIRC5基因CDS区序列429 bp，编码142个氨基酸残基。生物信息学分析显示，BIRC5蛋白无跨膜结构域，推测该蛋白可能不在生物膜上行使功能；无信号肽结构，表示其为非分泌型蛋白，可能在某些胞质基质中合成，被运输至细胞器中发挥其功能；二级结构中以α螺旋和无规则卷曲为主，推断BIRC5蛋白为Mixed样蛋白。STRING数据库检索到BIRC5蛋白可能与AURKA、AURKB、BUB1、CDCA8、CASP3、CASP9、XIAP、DIABLO、KIF2C、INCENP共10个蛋白存在相互作用。以上预测的相互作用蛋白常被报道参与细胞增殖、凋亡及机体免疫应答等[35-38]。沙娅·玛哈提等[39]研究发现，miR-124通过靶向调控AURKA促进胶质瘤细胞的增殖。吴昕等[40]发现，抑制AURKB的表达后可促进人源骨肉瘤143B细胞凋亡。Zhang等[41]发现，过表达BUB1基因后可促进人肝癌细胞的增殖，相反，敲低BUB1的表达可显著抑制Huh-7和HepG2细胞的增殖。Gao等[42]发现，抑制CDCA8的表达，会导致人源膀胱癌细胞增殖受阻并诱导其发生凋亡。对于BIRC5蛋白的功能研究发现，其主要在细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、细胞适应性及机体先天免疫应答方面发挥着重要作用[43-44]。因此，推测BIRC5蛋白可能与以上几类互作蛋白存在联系，共同参与细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡等方面的调控。
与其他凋亡抑制蛋白家族成员不同，BIRC5蛋白具有双重功能，既可以调节细胞凋亡，又可以调节有丝分裂[45]。研究发现，BIRC5蛋白可使人源结直肠肿瘤细胞停滞于G2/M期，进而在有丝分裂和微管稳定性等方面发挥关键作用[46]。而在小鼠原代心肌细胞中，BIRC5基因表达的下调可通过调控细胞周期停滞于G0/G1期，进而导致新生小鼠心脏发育异常[47]。推测BIRC5对山羊睾丸细胞周期具有重要的调控作用。本研究结果显示，过表达BIRC5基因后可导致细胞周期中，G0/G1期的细胞占比显著低于转染空载体pcDNA3.1(+)的细胞对照组，而G2/M+S期占比高于转染空载体的细胞组，这与Zhang等[48]报道的研究结果相符。同时，细胞周期进程主要受细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)、周期蛋白和内源性CDK抑制剂(cycin-dependent kinase inhibitors，CK)调控[49-50]。研究发现，CDKs可通过对BIRC5的34位点苏氨酸残基进行磷酸化进而调控细胞周期和凋亡作用[51]。细胞周期蛋白作为细胞有丝分裂的传感器，当细胞内DNA发生损伤时，细胞内周期蛋白及其依赖的激酶将共同调节细胞周期进程，导致细胞被阻滞于G0/G1期，促进细胞由G1向S期转变，利于细胞DNA的复制[52-53]。在本研究中，当敲低BIRC5基因表达后可导致G0/G1期细胞数显著上升，细胞被阻滞于G0/G1期，有利于细胞内DNA的复制。推测此种现象的产生可能是，当BIRC5基因表达发生变化时进而影响细胞内CDK的表达，从而调控细胞周期进程。
细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种典型方式，可通过清除受损或多余的细胞保证机体的正常生长发育。本研究结果发现，过表达BIRC5基因后可导致山羊睾丸细胞的凋亡作用受到抑制。同时，参考Hirunagi等[54]的方法，设计、筛选到干扰效率达70%以上的有效干扰片段BIRC5-siRNA1，并将其转染细胞得到干扰BIRC5基因后可促进细胞凋亡，进而从相反地方向证实了BIRC5基因的功能，这与王华彬[55]、李雪菲[56]、Yang[57]、Narimani[58]等报道的研究结果相符。
细胞凋亡分内在途径(线粒体途径)和外在途径(死亡受体途径)两种形式。虽然信号通路不同，但最终均由Caspase家族完成凋亡过程。在细胞凋亡的过程中，多种蛋白质参与机制的调节，例如：Bcl-2、Caspases、p53等[59]。Bcl-2在细胞凋亡过程中发挥着关键性的作用，能够抑制细胞色素c从线粒体释放，从而抑制内源性细胞凋亡[60]。许鸿雁等[61]发现，敲低BIRC5基因可在细胞内上调Caspase3和Caspase7的表达。赵艳等[62]研究发现，当Caspase3表达量降低时，子宫内膜细胞凋亡增多，Caspase3活性增加时，细胞凋亡进程被促进。赵芷藜[63]研究发现，BIRC5可通过促进p53的表达进而阻断细胞周期诱导细胞凋亡。El-Wetidy等[64]研究发现，当Bcl-2蛋白表达下调时，细胞周期出现停滞，细胞凋亡被促进。因此，BIRC5基因在细胞内可能通过与其他凋亡相关蛋白相互作用进而调控细胞的周期和凋亡。在本研究中，过表达BIRC5基因后可极显著下调促凋亡基因Caspase7、p53、BCL2L11和Bax mRNA表达，其基因表达量的变化与细胞凋亡率的变化规律是一致的，进而使细胞的凋亡作用受到抑制。已有研究显示，Bcl-2/Bax比值被认为是调控细胞凋亡的“分子开关”，在很大程度上影响着细胞的存活，其比值下降时，Bax容易形成同源二聚体，进而诱导细胞凋亡，而当其比值上升时，Bcl-2将发挥抑制细胞凋亡的功能[65]。因此，虽然抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达极显著下降，但Bax表达显著下降，但其Bcl-2/Bax比值相对上升，从而更进一步验证了过表达BIRC5基因后可抑制细胞的凋亡作用。同时，当干扰BIRC5基因表达后，Bax虽未有明显变化，但Bcl-2 mRNA表达显著下降，Bcl-2/Bax比值显著下降，从而促进了山羊睾丸细胞的凋亡。秦丽晶等[66]研究发现，当细胞DNA发生损伤时，细胞内PARP1的表达将导致Caspase3的激活，进而促进细胞发生凋亡现象。本研究发现，当干扰BIRC5基因表达后可导致Caspase3和PARP1的表达都极显著上升。相反，在过表达BIRC5基因后，Caspase3和PARP1的表达无显著变化。推测PARP1和Caspase3两者之间的表达可能存在相辅相成的关系，即当细胞内PARP1基因过度激活后导致Caspase3的激活，随后介导了细胞的凋亡。
4 结论山羊BIRC5基因序列长506 bp，包含5′UTR 28 bp，CDS区429 bp，3′UTR 49 bp，编码142个氨基酸残基。BIRC5蛋白可促进山羊睾丸细胞被阻滞于G2/M+S期，抑制山羊睾丸细胞的凋亡。试验结果为进一步深入研究BIRC5基因功能，揭示BIRC5基因诱导山羊睾丸细胞凋亡的分子机制提供重要的试验数据。
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(编辑 郭云雁)