2. 衡水志豪畜牧科技有限公司/河北省肉羊产业研究院，衡水 053000
2. Hengshui Zhihao Animal Husbandry Technology Co. LTD./Hebei Mutton Industry Research Institute, Hengshui 053000, China
黄体是动物排卵后卵泡膜的结缔组织、毛细血管等伸入到颗粒细胞层形成的具有内分泌功能的细胞团，分泌孕酮为妊娠提供保证[1]。母畜排卵后未妊娠，子宫内膜分泌前列腺素F2α(PGF2α)诱导黄体结构性退化与体积减小，并导致孕酮分泌降低，黄体正常退化是母畜发情的重要前提[2-3]。PGF2α作为哺乳动物的主要溶黄体因子，需与其受体(PTGFR，简称FP)结合，才能激活黄体退化一系列早期反应基因诱导黄体退化[4]。FP是具有7个跨膜结构域的G蛋白-偶联受体，在牛、绵羊、非洲爪蟾等多个物种上存在FP剪切异构体[5-7]，在绵羊中，FP存在FPA、FPB两种受体亚型，与FPA相比，FPB的氨基酸序列具有相同的氨基末端跨膜结构域，但羧基末端缺少46个氨基酸[6]。有文献报道，FPA与FPB可能在调控细胞骨架、血管构建等方面存在生理功能差异[7-8]，而FPA与FPB在哺乳动物黄体期的表达规律未见报道。
在自然及人工诱导的黄体结构性退化过程中，凋亡、自噬等细胞死亡起到了关键调节作用[9-10]。2005年Degterev等[11]首次发现了一种具有坏死形态特点，可以被小分子化合物坏死抑制蛋白1(necrostatin-1)抑制并受到严格调控的新型细胞死亡模式——程序性坏死(necroptosis)，也称坏死性凋亡。近期研究表明，程序性坏死参与调控牛黄体退化过程，是PGF2α诱导牛黄体退化的重要调节机制[12]。目前，关于程序性坏死通路的研究主要集中在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及其受体(TNFR1)上，TNF-α与TNFR1结合并激活受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)共同形成复合体，进一步激活受体相互作用蛋白激酶3 (RIPK3)，导致混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)发生磷酸化，引发程序性坏死[13]。
众多研究表明，PGF2α的溶解黄体作用会受到黄体阶段的影响，多个物种存在黄体早期或晚期对PGF2α不敏感现象[14-17]。Hernandez等[18]发现，排卵后7~10天的母羊在PGF2α处理后仍有33%未发生黄体溶解，桑国俊[19]采用一次氯前列烯醇宫注法对处于黄体期的黄牛进行同期发情后发情率只有53.8%，王川[20]采用一次氯前列烯醇肌注法为母羊进行同期发情，同期发情率仅60%。因此，探究PGF2α启动黄体溶解的机制对生产中应用外源PGF2α提高母畜繁殖利用率具有重要意义。本试验在湖羊育成母羊黄体期不同阶段注射PGF2α，研究PGF2α对黄体组织退化的影响，并通过检测PGF2α受体亚型及程序性坏死通路基因的表达，以期揭示PGF2α诱导黄体退化的作用机制。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点本试验于2020年11月20日至2020年12月29日在河北省衡水市武邑县志豪畜牧科技有限公司肉羊产业技术研究院进行。
1.2 试验动物及饲养管理选择健康、体重相近((34.94±2.99)kg)、体况良好的7月龄育成湖羊母羊60只。试验开始前对试验羊进行统一称重、驱虫，并对圈舍进行清扫消毒。所有试验羊均舍饲养殖，饲喂TMR日粮，精粗比为2∶8，每日于07:00和16:30饲喂，自由饮水。
1.3 试验设计和样品采集试验羊在正式试验开始前先进行发情周期同步化处理：氟孕酮海绵栓(MAP，45 mg·只-1，SYNCRITE-45 Vaginal Sponge，澳大利亚)埋置13 d，撤栓同时肌注PMSG(300 IU·只-1)。选择撤栓后24~48 h内发情的48只母羊，随机分为6组，每组8只。发情当天记为发情周期第0天，3个试验组母羊分别在第6天(黄体前期试验组)、11天(黄体中期试验组)、16天(黄体末期试验组)于早上饲喂前肌注1 mL PGF2α(0.1 mg，宁波三生生物科技有限公司)，3个对照组母羊在相同时期注射1 mL生理盐水。注射后3 h通过外科手术法采集一侧黄体组织，部分存于液氮中用于qPCR检测，另一部分置于10%的福尔马林溶液中固定用于制作石蜡切片。
1.4 组织切片制作与染色黄体组织在4%甲醛溶液中固定48 h后修成0.5 mm×0.5 mm切面平整的组织块，自来水冲洗24 h后酒精逐级脱水：用75%的酒精浸泡过夜，80%酒精浸泡2 h，85%酒精浸泡1 h，90%酒精浸泡1 h，95%酒精浸泡1 h，100%酒精浸泡1 h两次。脱水后组织用100%酒精∶二甲苯=1∶1浸泡1 h，在二甲苯浸泡至透明后包埋。KD-BM Ⅲ包埋机提前预热，组织块在65 ℃石蜡池中浸泡1 h，在70 ℃石蜡池浸泡0.5 h，取出组织将平滑切面向下放置在蜡盒中包埋，静置过夜后修块，用KD-2508转轮式切片机切成厚度为6 μm的切片。切片用毛笔小心转移至45 ℃的蒸馏水中充分展片，用载玻片伸入水中缓慢使切片黏附，60 ℃鼓风干燥箱烤片2 h。切片用二甲苯浸泡5 min，二次二甲苯浸泡5 min脱蜡，再用100%酒精∶二甲苯=1∶1浸泡3 min，100%酒精浸泡4 min，95%酒精浸泡4 min，90%酒精浸泡4 min，85%酒精浸泡4 min，80%酒精浸泡4 min，70%酒精浸泡2 min，蒸馏水浸泡2 min后进行HE染色。
HE染色步骤：苏木素染色15 min后自来水浸泡5 min，0.5%盐酸乙醇分化30 s，蒸馏水冲洗30 s，0.5%氨水复蓝30 s，蒸馏水冲洗30 s；梯度乙醇脱水至95%酒精时，使用1%的伊红酒精溶液染色7 min，继续梯度乙醇脱水，最后用中性树胶封片。成片置于XDS-1B倒置生物显微镜下观察黄体组织细胞浸润，细胞形态等病理状态。细胞空泡变性：胞核、包浆出现大小不一的空泡，细胞呈现蜂窝状或网状。中性粒细胞：胞浆成分较少，胞核明显并呈现分叶、杆状等多种形态，染色呈蓝紫色。细胞凋亡：胞体变小，胞质嗜酸性增强(染色颜色加深)，胞核固缩或崩解[21-22]。
1.5 基因相对表达量测定黄体组织放入液氮预冷的研钵中研磨，待组织样本研磨成粉末后，加入TRIzol试剂(天根生化，北京)提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取物完整性，利用分光光度计检测总RNA浓度，并通过OD260 nm/OD280 nm比值检测RNA纯度。使用反转录试剂盒HiScript III 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)(诺唯赞，南京)进行去基因组和cDNA合成。一步法荧光定量PCR试剂盒UltraSYBR One Step RT-qPCR Kit (康为世纪，北京)用于FPA、FPB、TNF-α、TNFR1、RIPK1、RIPK3和MLKL的qPCR测定。以GAPDH为内参基因，每组5个样品，每个样品3个重复。使用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物设计见表 1，由北京盘古汉图科技有限公司设计合成。
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表 1 基因引物序列 Table 1 Genes primer sequence |
采用SPSS 22.0软件对单个因素组间数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用最小显著差检验法(LSD)进行多重比较，使用GraphPad Prism软件作图。采用GraphPad Prism软件的Spearman检验程序分析各基因间相关性。P＜0.05表示差异显著。数据均以“平均值±标准误(mean±SEM)”表示。
2 结果 2.1 不同黄体期注射PGF2α对母羊黄体组织形态的影响由图 1可知，对照组黄体前期颗粒黄体细胞较多，体积相对较小，胞质着色较浅，膜黄体细胞较少，主要分布于小梁周围，间质毛细血管十分丰富；黄体中期颗粒黄体细胞显著增大，胞质着色加深，开始出现个别黄体细胞凋亡，膜黄体细胞增多，主要分布于颗粒黄体细胞之间；黄体末期黄体细胞凋亡增多，间质毛细血管分布减少。
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A、C、E分别为黄体前期、中期和末期对照组的黄体组织形态；B、D、F分别为PGF2α处理后黄体前期、中期和末期试验组的黄体组织形态。绿色箭头处为黄体细胞凋亡，蓝色箭头处表示黄体细胞空泡变性，黄色箭头表示中性粒细胞 A, C, E. Morphology of luteal tissue in the control groups in early-luteal phase, mid-luteal phase and late-luteal phase; B, D, F. Morphology of luteal tissue in the experimental groups in early-luteal phase, mid-luteal phase and the late-luteal phase after PGF2α administration. The green arrow shows the apoptosis of luteal cells; The blue arrow shows the vacuolar degeneration of luteal cells; The yellow arrows shows the neutrophils 图 1 各组母羊黄体组织形态(HE, 400×) Fig. 1 Luteal tissue morphology of ewes in different groups (HE, 400×) |
试验组在不同黄体期注射PGF2α后黄体组织病变程度显著加重。黄体前期和黄体中期试验组可见较多黄体细胞空泡变性和凋亡，黄体末期试验组可见多量黄体细胞凋亡。黄体前期和末期组黄体细胞间质内出现少量炎性细胞浸润，黄体中期组黄体细胞间质内炎性细胞浸润程度较黄体前期和末期加重。
2.2 不同黄体期注射PGF2α对黄体组织中FPA、FPB mRNA表达的影响由图 2A可知，对照组FPA表达水平在黄体前期、中期显著高于黄体末期(P＜0.05)，试验组FPA表达水平在黄体中期显著高于黄体前期和末期(P＜0.05)；注射PGF2α可以显著降低黄体前期FPA表达水平(P＜0.05)，对黄体中、末期FPA表达水平没有显著影响(P＞0.05)。由图 2B可知，对照组黄体FPB表达水平在黄体前期显著高于黄体末期(P＜0.05)，黄体前、末期与黄体中期均无显著差异(P＞0.05)，试验组黄体FPB表达水平在黄体前期和中期显著高于黄体末期(P＜0.05)；注射PGF2α可以显著上调黄体前期和中期黄体FPB表达水平(P＜0.05)，对黄体末期没有显著影响(P＞0.05)。
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不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)；无字母或相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。下同 Different letters means significant difference(P < 0.05); no letter or same letter means no significant difference(P > 0.05). The same as below 图 2 不同黄体时期注射PGF2α对FPA、FPB mRNA表达的影响 Fig. 2 Effects of injection of PGF2α at different luteal phases on mRNA expression of FPA and FPB |
由图 3A可知，对照组黄体TNF-α表达水平在整个黄体期没有显著变化(P＞0.05)，试验组黄体TNF-α表达水平在黄体中期显著高于黄体前期和末期(P＜0.05)；注射PGF2α可以显著上调黄体中期TNF-α表达水平(P＜0.05)，对黄体前期和末期TNF-α表达影响不大(P＞0.05)。由图 3B可知，对照组和试验组黄体TNFR1表达水平均在黄体中期显著高于黄体前期和末期(P＜0.05)；注射PGF2α对各时期TNFR1表达均无显著影响(P＞0.05)。
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图 3 不同黄体时期注射PGF2α对TNF-α、TNFR1 mRNA表达的影响 Fig. 3 Effects of injection of PGF2α at different luteal phases on mRNA expression of TNF-α and TNFR1 |
由图 4A可知，对照组黄体RIPK1表达水平在整个黄体期没有显著变化(P＞0.05)，试验组黄体RIPK1表达水平在黄体末期显著高于黄体前期(P＜0.05)，黄体前、末期与黄体中期差异均不显著(P＞0.05)；注射PGF2α可以显著上调各黄体时期RIPK1表达水平(P＜0.05)。由图 4B可知，对照组黄体RIPK3表达水平在黄体中期显著高于黄体末期(P＜0.05)，黄体中、末期与黄体前期差异均不显著(P＞0.05)，试验组黄体RIPK3表达水平在整个黄体期差异不显著(P＞0.05)；注射PGF2α使各黄体时期RIPK3表达水平上调但未达显著水平(P＞0.05)。由图 4C可知，对照组黄体MLKL表达水平在整个黄体期没有显著变化(P＞0.05)，试验组黄体MLKL表达水平在黄体前、中期显著高于黄体末期(P＜0.05)；注射PGF2α可以显著提高黄体前期和中期MLKL表达水平(P＜0.05)，对黄体末期影响不显著(P＞0.05)。
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图 4 不同黄体时期注射PGF2α对RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表达的影响 Fig. 4 Effects of injection of PGF2α at different luteal phases on mRNA expression of RIPK1, RIPK3 and MLKL |
根据表 2可知，FPA与RIPK3、TNFR1表达呈正相关(P＜0.001)；FPB与MLKL、TNF-α表达呈正相关(P＜0.001)。
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表 2 FPA、FPB基因与程序性坏死基因表达的相关性分析 Table 2 The expression correlation analysis between FPA, FPB genes and necroptosis-associated genes |
黄体的发育、退化均表现“类炎症”过程，在PGF2α作用下，黄体组织内大量免疫细胞聚集是黄体组织快速溶解的必要条件[23]。本研究通过黄体组织切片HE染色发现，黄体中期颗粒黄体细胞增大，但此时出现个别细胞凋亡情况，黄体末期凋亡进一步增多，说明黄体在中期分泌功能较好，处于细胞死亡与发育的动态平衡中，黄体末期处于黄体结构性退化阶段。注射PGF2α后，各时期黄体组织病变均显著加重，尤其在黄体中期组织间隙炎症细胞浸润程度较重，表明在注射PGF2α后黄体组织进入了炎症早期阶段[22]。细胞出现程序性坏死时往往伴随着炎症发生，细胞内容物经胀破的细胞膜外泄，导致周围的组织出现炎症，程序性坏死细胞也可以释放损伤相关的分子模式(DAMPs)、激活炎症小体、诱导炎症因子产生，从而加剧炎症反应[24-25]。本研究中，在不同黄体期注射PGF2α后黄体均启动了结构性退化，且PGF2α可能诱导黄体细胞发生程序性死亡性细胞死亡现象。本研究表明，在黄体中期注射PGF2α诱导黄体结构性退化效果好于黄体前期和末期。
3.2 不同黄体期注射PGF2α对黄体组织中FPA、FPB基因mRNA表达的影响成熟卵泡排卵后，卵泡颗粒细胞转变成颗粒黄体细胞，卵泡膜细胞则转变为膜黄体细胞[26]。Graves等[27]在绵羊颗粒黄体细胞中发现了FPA和FPB两种FP亚型。研究指出，稳定表达绵羊FPA和FPB受体的人胚胎肾细胞293细胞(HEK-293细胞)，均可在PGF2α作用下出现依赖于Rho鸟苷三磷酸酶(G-protein Rho)的细胞圆化；去除PGF2α刺激后，FPA表达细胞形态在1 h左右恢复，而FPB表达细胞的恢复则比FPA慢得多，这种功能差异归结于二者羧基末端的不同[7-8]。但在PGF2α刺激下，只有FPB表达细胞出现了β-连环蛋白(β-catenin)/转录因子(Transcription Factor，TCF)信号的激活[28]，并且相比于FPA表达细胞，FPB表达细胞具有更高的环氧化酶-2(Cox-2)启动子活性[29]。β-catenin/TCF信号通路是调控胚胎发育与肿瘤细胞分化的重要通路[30]，而Cox-2是PGs合成的限速酶，在肿瘤、炎症组织中处于上调状态[31]，这说明FPA和FPB在细胞骨架、炎症发生、肿瘤侵袭等方面具有不同的生理功能。Fujino和Regan[32]发现了仅由FPB介导的Rho扩增信号，提示可能与黄体退化的启动有关。本研究中，在母羊黄体期，FPA和FPB相对表达量在黄体前期和中期高于末期。黄体前、中期正处于黄体的快速发育时期，黄体膜细胞与黄体颗粒细胞增殖变大，黄体血管网络迅速增生，黄体功能大幅提升，而在末期黄体中功能完整、未启动退化的黄体细胞减少[1]，因此推测高水平的FPA和FPB可能与黄体细胞增殖分化有关，有待进一步研究证实。研究表明，在母牛发情的第5和第7天分别注射PGF2α，分别有57.1%和19.1%的黄体不能完全溶解，说明在黄体早期母牛对PGF2α有不敏性；同样，黄体早期的母羊也存在对PGF2α的不敏感现象[14, 16]。本试验也得到一致的研究结果，本研究中黄体前期注射PGF2α后可增加FPB表达，但降低了FPA表达，这可能是导致黄体前期应用PGF2α诱发黄体溶解效果较差的原因。在黄体中期注射PGF2α后FPA和FPB均表达上升，说明此时外源PGF2α对黄体组织退化的诱导效果较好，也说明黄体对PGF2α的应答存在阶段性差异。黄体末期注射PGF2α对FPA、FPB表达量没有显著影响，说明在黄体末期已启动退化程序的前提下，注射PGF2α可能对黄体退化作用不大。目前关于FPA与FPB受体亚型的相关研究较少，二者的相互关系及功能机理还需进一步研究。
3.3 不同黄体期注射PGF2α对黄体组织中TNF-α、TNFR1基因mRNA表达的影响TNF-α是生物体内主要的促炎因子，TNF-α与细胞膜表面的TNFR1结合后可以激活FADD-Caspase-8通路诱导细胞凋亡，或激活RIPK3-MLKL通路调控细胞程序性死亡，这是程序性坏死最为经典的通路[33-34]。Chang等[35]认为，黄体炎性细胞浸润所分泌的TNF-α是调控猪黄体退化的关键因素。Sakumoto等[36]研究指出，牛整个发情周期中颗粒黄体细胞与膜黄体细胞均表达TNF-α、TNFR1和TNFR2，当牛黄体处于末期时TNF-α表达量显著上调，说明TNF-α可以通过自分泌调节黄体功能。本研究中，各时期对照组羊的黄体组织中TNF-α相对表达量均较低，没有明显变化，黄体末期没有出现TNF-α表达量显著上升的情况，TNF-α表达是否存在畜种间差异值得进一步研究。在黄体中期注射PGF2α后TNF-α的相对表达量显著上调，黄体前期和末期注射PGF2α对TNF-α表达无显著影响，说明在黄体中期注射PGF2α后黄体出现炎症，TNF-α表达上调使黄体细胞发生凋亡与坏死，对黄体退化有积极作用，因此在黄体中期注射PGF2α诱导黄体退化的效果优于黄体前期和末期。TNFR1、TNFR2均是TNF-α的受体，但TNFR1具有独特的死亡结构域模块，在调控细胞凋亡、程序性死亡等细胞活性调控方面起着主导作用，且TNF-α/TNFR1通路是程序性坏死最为经典的介导途径[37]。有研究指出，牛黄体TNFR1表达量在整个发情周期没有显著变化，说明虽然TNFR1是TNF-α介导黄体细胞死亡的关键受体，但TNFR1数量不是黄体组织中TNF-α/TNFR1通路发挥作用的主要因素[36]。本试验结果表明，对照组TNFR1在黄体期呈现先上升再下降的变化趋势，黄体中期TNFR1表达水平最高，说明TNFR1可能参与了黄体功能的维持。但注射PGF2α后，湖羊黄体TNFR1表达量只小幅上升，与TNF-α显著上升的变化趋势不一致，说明TNFR1对PGF2α的作用不敏感。本试验发现，FPA与TNFR1表达呈正相关，FPB与TNF-α表达呈正相关。Fujino和Regan[32]研究指出，分别稳定表达FPA和FPB的人胚肾细胞(HEK细胞)中检测PGF2α对TNF-α启动子活性的调节，发现不管是自然状态下还是PGF2α刺激后，稳定表达FPB的HEK细胞具有更高的TNF-α启动子活性，与本研究结果一致。而TNFR1数量不在诱导黄体细胞死亡过程中起决定性作用，推测PGF2α可能主要通过与其受体FPB结合，介导TNF-α发挥调控黄体退化功能。
3.4 不同黄体期注射PGF2α对黄体组织中RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA表达的影响RIPK1和RIPK3是受体相互作用蛋白(RIP)家族的成员，是调控组织发生炎症和细胞死亡的关键分子[38]。程序性坏死高度依赖于RIPK1和RIPK3介导，是由含有MLKL复合物执行的可调节性坏死[39]。TNF-α与细胞膜表面的TNFR1结合后招募肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域(TRADD)和RIPK1等形成复合体Ⅰ，激活NF-κB信号通路对细胞存活有积极作用，当复合物Ⅰ中RIPK1的多聚泛素化受到抑制，RIPK1会发生自磷酸化并激活caspase-8诱导细胞凋亡，一旦caspase-8的活性受到抑制或RIPK3过表达，坏死复合体形成导致RIPK3磷酸化并激活MLKL，寡聚化的MLKL转移至细胞膜上执行坏死[40-41]。Hojo等[12]在2016年首次提出程序性坏死参与调控牛的黄体退化过程，且RIPK1、RIPK3表达量随黄体期推移显著升高。本研究中，湖羊黄体RIPK1和MLKL的表达量在不同黄体阶段无显著差异，而RIPK3表达量在黄体前期和中期处于高水平，在中期表达量显著高于末期，与Hojo等[12]的结果不同，说明RIPK1和RIPK3在绵羊黄体中的表达模式与牛不同，自然状态下程序性坏死如何参与绵羊黄体退化的调节有待进一步研究。本研究中，在不同黄体阶段注射PGF2α后RIPK1表达量均显著上调，RIPK3表达量无明显变化，黄体前、中期MLKL表达量显著上调，黄体末期注射PGF2α对MLKL无显著影响，说明程序性坏死在PGF2α诱导的黄体退化过程中起作用。黄体末期注射PGF2α后RIPK1与MLKL变化不同，可能是因为RIPK1在程序性坏死过程中通过发生多种多聚泛素化修饰影响自身的激活与降解，决定细胞走向炎症、凋亡或程序性坏死[42]，推测黄体末期高表达的RIPK1可能诱导湖羊黄体同时发生了细胞凋亡。而MLKL作为程序性坏死的执行者，不同黄体时期对PGF2α的应答反应不同，说明在黄体前期和中期进行外源PGF2α处理可启动黄体细胞的程序性坏死，即PGF2α对黄体细胞程序性坏死的诱导作用存在阶段性差异，这种差异可能是由于FPB在不同黄体时期对PGF2α应答的差异造成的，也有可能是因为黄体末期细胞凋亡增加[43]，Caspase-8活性较高[44]，抑制了黄体细胞程序性坏死。本研究通过对PGF2α受体亚型与RIPK1、RIPK3、MLKL表达的相关性分析，发现FPA与RIPK3呈低度正相关(r=0.400)，FPB与MLKL呈中度正相关(r=0.711)，说明FPA和FPB虽然均可介导黄体发生组织退化，但可能FPB亚型在调控黄体退化和黄体细胞发生程序性坏死的过程中更为关键。
4 结论母羊黄体期注射PGF2α后黄体组织形态发生了变化，出现炎症细胞浸润与细胞凋亡，其中黄体中期退化程度最高。注射PGF2α后显著下调了黄体前期FPA基因表达，显著上调了黄体前期FPB、RIPK1与MLKL基因表达，黄体中期FPB、TNF-α、RIPK1与MLKL基因表达，以及黄体后期RIPK1基因的表达。表明PGF2α与其受体FPA、FPB结合后可能通过TNF-α/TNFR1通路启动黄体细胞程序性坏死，促进黄体组织退化，FPB在介导PGF2α诱导黄体退化与程序性坏死中发挥主要作用，PGF2α在黄体中期诱导黄体退化效果较好。
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(编辑 郭云雁)