2. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室云浮分中心，云浮 527400
, CHEN Weidong1, YANG Wenzheng1, MO Jianxin2, HONG Linjun1, ZHANG Xianwei2
, HUANG Sixiu1
2. Yunfu Branch, Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agricultural Science and Technology, Yunfu 527400, China
精原细胞经过有丝分裂和减数分裂形成携带X染色体和Y染色体的精细胞[1-2]。研究发现，X精子和Y精子之间存在差异，包括体积大小、DNA含量、游动速度、表面电荷以及耐冻性[3-7]。据报道，X染色体要比Y染色体具有更多的编码基因[8]，为X精子和Y精子之间表达产物差异提供了基础条件，说明两种不同的精子之间可能存在不同的蛋白。蛋白质组学技术的进步为研究X/Y精子的差异蛋白提供了有利条件。2012年，Chen等[9]报道，公牛的X精子和Y精子间存在16个差异蛋白。随后几年，越来越多的公牛X/Y精子差异蛋白被报道出来[10-12]。此外，有研究者运用一种针对公牛Y精子表位蛋白的单克隆抗体与公牛精子孵育，Y精子头对头凝聚而沉淀到底部，对X精子无显著影响，进而将X/Y精子分离[13]。寻找X/Y精子的差异或特异蛋白是开发精子性别鉴定和分离免疫学方法的基础。通过抗原抗体反应来改变精子的功能或状态，有望建立高效、廉价、简便和低损伤的性控精子分离方法，这对于畜牧业意义重大。
Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是一类具有天然识别功能的受体，其广泛存在于抗原呈递细胞中，通过与微生物中特异分子相互识别进而在固有免疫或适应性免疫中发挥重要作用。TLR家族共有13个成员TLR1-13，其表达模式在物种间存在差异，如在小鼠中不表达TLR10，在人类中不表达TLR11-13[14]。TLRs在人类疾病的研究中较多，然而在精子上的报道相对较少。最近有报道称，位于X染色体上的Toll样受体7/8(TLR7/8)基因在小鼠X精子上特异表达，将TLR7/8的共同配体R848与小鼠精子共孵育，它通过抑制糖酵解途径使X精子产生ATP水平降低，进而降低X精子的活力，使X/Y精子分离[15]。此外，研究人员使用分离的X/Y精子进行体外受精和胚胎移植，得到的预期后代率高达81%以上。之后，利用TLR7/8分离牛和羊X/Y精子相继被报道，并取得了显著的效果[16-18]。然而，到目前为止，暂未发现TLR7/8蛋白在公猪精子上有相关报道。
若TLR7/8在公猪精子上的表达模式与小鼠、牛精子相类似，可以借鉴R848分离小鼠和牛X/Y精子的方法来分离公猪X/Y精子，这将有望开发一种简单廉价的生产猪性控精液的方法，对生猪养殖业的发展具有极大的推动作用。因此，本研究运用qRT-PCR和免疫组化方法探究TLR7/8在公猪性腺以及精子中的表达情况；运用细胞免疫荧光分析TLR7/8在公猪X/Y精子的表达模式，并与小鼠和牛精子相比较；R848孵育公猪精子探究其对分离猪X/Y精子的作用，评价是否能通过TLR7/8配体来分离猪X/Y精子。
1 材料与方法 1.1 公猪、小鼠和牛精子以及公猪性腺组织的获取手握法采集的3头健康成年公猪精液和假阴道法采集的公牛精液装在保温杯中立即带回实验室，用计算机辅助精子分析仪(CASA)进行常规质量评估，包括活力、活率和畸形率，合格的精子用于后续试验。公猪X精子和Y精子的分离在内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院进行。从附睾中采集健康成年小鼠精子，37 ℃水浴锅中孵育20 min后，吸取上层精子用于后续试验。采集3头健康成年大白猪睾丸、附睾头、附睾体和附睾尾组织，使用预冷的PBS缓冲液冲洗，一部分用4%多聚甲醛固定，剩余部分分别装进冻存管中做好标记并立即置于液氮中冷冻，用于后续试验。
1.2 RNA提取与cDNA合成采用TRIzol法提取公猪睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾以及精子的RNA，通过Nanodrop 2000检测RNA的纯度和浓度。然后，取1 μg总RNA根据Evo M-MLV反转录试剂盒说明书合成cDNA用于后续试验。
1.3 精子DNA提取将含1 000~2 500个精子的精液在2 000×g条件下离心5 min，弃上清，用5 μL裂解液(200 mmol·L-1 KOH，50 mmol·L-1 DTT)重悬，并在PCR仪中65 ℃孵育20 min。加入5 μL中和液(900 mmol·L-1 Tris-HCl，pH为8.3)终止反应，并用ddH2O稀释至40 μL。
1.4 引物设计及qRT-PCR检测根据引物设计原则，用Oligo 7.0软件设计实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物(表 1)，由北京六合华大基因科技有限公司合成。qRT-PCR总反应体系为10 μL：5 μL PowerUp SYBR Green Master Mix，1 μL cDNA，上游引物和下游引物各0.2 μL，3.6 μL ddH2O。反应条件为95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；72 ℃ 7 min。每个样本均设置3个生物学重复，用2-ΔΔCt计算基因在不同样品间的相对表达量。
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表 1 引物信息 Table 1 Primers information |
采集的大白猪睾丸和附睾组织经过预冷的PBS缓冲液冲洗干净后，立即用4%多聚甲醛进行固定12 h以上，然后依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烘片。
1.6 免疫化学染色组织切片经过脱蜡和复水后，使用3%双氧水溶液于室温浸泡切片10 min，蒸馏水冲洗；随后在柠檬酸盐抗原修复缓冲液中浸泡10 min后再加热煮沸，待自然冷却至室温后，用PBS缓冲液在脱色摇床洗涤玻片3次，每次5 min；使用免疫组化笔在组织周围画圈，将5%的BSA覆盖组织区域于室温封闭2 h(以上均为免疫组织化学步骤)。精子经过PBS缓冲液洗涤两次后，取适量精子涂抹于载玻片上并风干；使用免疫组化笔在精子样品周围画圈，将免疫荧光固定液覆盖精子样品区域于室温固定15 min；然后吸去固定液，用PBS缓冲液在脱色摇床洗涤玻片3次，每次5 min。TritonX-100通透10 min，按照上述方式洗涤玻片3次后，用5%的BSA室温封闭30 min(以上均为细胞免疫荧光步骤)。将一抗Anti-TLR7(Bioss)和Anti-TLR8(abcam)按照说明书推荐稀释比稀释后，滴加于精子上在湿盒内4 ℃过夜孵育。吸去一抗并按照上述方式洗涤3次后，滴加对应的二抗并在湿盒内室温孵育1 h(细胞免疫荧光在此步骤以及后续步骤均需避光)。吸去二抗并按照上述方式洗涤3次后，滴加DAPI染料，室温孵育5 min。吸去染料并按照上述方式洗涤3次后，用抗荧光淬灭封片剂封片，用显微镜观察并拍照。
参照张倩等[19]的方法，每种组织随机选取6张切片，使用Image-Pro Plus图像分析系统分析TLR7/8蛋白在睾丸、附睾头、附睾体和附睾尾中的平均光密度值。
1.7 R848孵育公猪精子新鲜的公猪精液经过CASA评估质量合格后，用洗精液(0.1 g BSA溶解于100 μL的PBS缓冲液)洗涤两次(800 r·min-1，3 min)，精子沉淀用1 mL含不同浓度R848的精液分选液(葡萄糖37.15 g·L-1，柠檬酸钠6 g·L-1，EDTA 1.25 g·L-1，碳酸氢钠1.25 g·L-1，氯化钾0.75 g·L-1，超纯水1 L)重悬，随后将精子置于5% CO2的37 ℃细胞培养箱孵育2 h。
1.8 精子活力测定吸取10 μL待测精液滴加到37 ℃预热的载玻片，使用CASA分析精子的活力指标，每张玻片随机选择3个视野，总精子数大于1 000，进行拍照分析。
1.9 数据统计所得到的数据用GraphPad Prism 9软件进行分析，精子性别比例数据进行t-检验，TLR7/8在组织中的表达水平数据用单因素方差分析并进行多重比较，结果用“mean±SEM”表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 TLR7/8 mRNA在公猪性腺和精子的表达模式TLR7/8的mRNA表达情况如图 1所示，TLR7/8在猪的睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾组织以及精子中均有表达，睾丸中TLR7 mRNA表达量显著高于附睾组织(P < 0.05)，TLR8 mRNA表达量在睾丸和附睾组织差异不显著(P>0.05)。
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A. TLR7的相对表达量；B. TLR8的相对表达量。不同字母表示差异显著(P < 0.05), 相同字母表示差异不显著(P>0.05)，下同 A. Relative expression of TLR7 mRNA; B. Relative expression of TLR8 mRNA. Different letters represent significant differences (P < 0.05), the same letter represents no significant differences (P>0.05), the same as below 图 1 TLR7/8 mRNA在公猪睾丸、附睾和精子中的表达水平 Fig. 1 Expression levels of TLR7/8 mRNA in testis, epididymis and sperm of boar |
免疫组织化学检测结果如图 2所示，在睾丸中，TLR7/8主要表达于生殖细胞中，包括精母细胞、圆形精子细胞和精子；在附睾头、体和尾组织中，TLR7/8主要在柱状细胞的微绒毛中表达。TLR7蛋白在睾丸中的表达水平显著高于附睾头、附睾体和附睾尾组织(P < 0.05)，而TLR8蛋白在上述组织中的表达无显著差异(P>0.05，图 3)。
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图 2 TLR7/8蛋白在睾丸和附睾中的表达模式(400×) Fig. 2 Expression pattern of TLR7/8 proteins in testis and epididymis (400×) |
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A.TLR7蛋白的表达水平；B. TLR8蛋白的表达水平 A. Expression level of TLR7 protein; B. Expression level of TLR8 protein 图 3 TLR7/8蛋白在睾丸和附睾中的表达水平 Fig. 3 Expression levels of TLR7/8 protein in testis and epididymis |
本研究对小鼠、牛和猪的精子进行免疫荧光染色，结果如图 4所示，免疫荧光显示TLR7蛋白在牛和小鼠的X精子(黄色箭头标注)表达，在Y精子(红色箭头标注)中不表达，TLR7蛋白主要定位于X精子的尾部前段(图 4)；在公猪的普通精子中，所有精子都出现阳性信号，各精子之间无荧光强弱差异，TLR7蛋白主要在公猪精子头部表达，精子尾部表达较弱(图 5A)。公猪X精子和Y精子中，TLR7表达无显著差异(图 5B、5C)。
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A.小鼠精子；B.公牛精子。黄色箭头代表X精子，红色箭头代表Y精子 A. Mouse sperm; B. Bull sperm. Yellow arrows represent X sperm, red arrows represent Y sperm 图 4 TLR7在小鼠和牛精子中的定位 Fig. 4 Localization of TLR7 in mouse and bovine sperm |
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A.未分选的精子；B.X精子；C.Y精子 A. Unsorted sperm; B. X sperm; C. Y sperm 图 5 TLR7在公猪精子中的定位 Fig. 5 Localization of TLR7 in boar sperm |
TLR8蛋白的免疫荧光定位结果如图 6所示，TLR8蛋白在小鼠和牛的X精子(黄色箭头标注)尾部表达，在Y精子(红色箭头标注)中不表达；在公猪普通精子中无荧光强弱差异，主要表达在精子尾部(图 7A)。公猪X精子和Y精子中，TLR8表达无显著差异(图 7B、7C)。
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A.小鼠精子；B.公牛精子。黄色箭头代表X精子，红色箭头代表Y精子 A. Mouse sperm; B. Bull sperm. Yellow arrows represent X sperm, red arrows represent Y sperm 图 6 TLR8在小鼠和牛精子中的定位 Fig. 6 Localization of TLR8 in mouse and bovine sperm |
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A.未分选的精子；B.X精子；C.Y精子 A. Unsorted sperm; B. X sperm; C. Y sperm 图 7 TLR8在公猪精子中的定位 Fig. 7 Localization of TLR8 in boar sperm |
不同浓度的R848孵育精子结果如图 8A所示，精子活力随R848添加量增加而逐渐降低。由于R848添加浓度大于0.3 μmol·L-1时，精子活力无明显变化，因此选择0.3 μmol·L-1R848孵育精子，并提取上层精子DNA。针对X染色体和Y染色体特异序列基因AMELX和SRY设计引物，通过qRT-PCR检测确定X精子和Y精子的比例。结果如图 8B所示，上层精子的X精子占(46.49±2.27)%，Y精子占(53.51±2.27)%，X精子与Y精子比例无显著差异(P>0.05)。
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A.不同R848添加量对精子活力的影响；B.添加0.3 μmol·L-1 R848对上层精子性别比例的影响 A. Changes of sperm motility with different amounts of R848 added; B. Effect of adding 0.3 μmol·L-1 of R848 on the sex ratio of upper spermatozoa 图 8 R848对精子活力及X/Y精子分离的影响 Fig. 8 Effects of R848 on sperm motility and X/Y sperm separation |
减数分裂完成后，在圆形精子细胞发生形态学变化而形成精子这一过程中，过渡蛋白开始出现并取代大部分的组蛋白，之后体积更小的鱼精蛋白出现并取代过渡蛋白，导致染色质高度浓缩，细胞核体积急剧缩小，精子的转录通道关闭，转录活性逐渐降低[20-21]。但是，并非所有转录通道就此关闭，越来越多的研究证实了精子RNA的存在[22-23]。在本研究中，通过qRT-PCR检测了TLR7和TLR8基因在睾丸、附睾以及精子中的转录水平，结果显示射出的精子中存在TLR7/8的转录本。TLR7的转录水平在睾丸中显著高于附睾组织，虽然TLR8的转录水平在睾丸和附睾中无显著差异，但有递减的趋势。TLR7/8在启动免疫反应中起着重要作用，并在巨噬细胞中表达水平较高[24-25]。有研究报道，附睾头、附睾体和附睾尾中的巨噬细胞数量依次递减[19]，而巨噬细胞参与血-附睾屏障的构成，并且屏障作用从附睾头到附睾尾依次降低[26]。因此，TLR7/8在附睾中表达趋势的变化可能与血-附睾屏障的作用有关。此外，有报道显示TLR7/8在牦牛睾丸中表达水平较高，并推测其在抵御生殖系统感染过程中起重要作用[27]。本研究中，TLR7在睾丸的表达水平显著高于附睾组织，推测其对睾丸的免疫系统有重要作用。
TLR7/8主要表达于心、脾、肺、淋巴结等组织以及各种免疫细胞中，如B细胞、T细胞和巨噬细胞等[28]。它们被报道主要与肿瘤、癌症的化学免疫治疗有关，而与精子功能相关的报道较少。2019年，Umehara等[15]发现，TLR7/8在小鼠一半的精子中表达，并证实它们只在小鼠X精子中表达，在Y精子中不表达。TLR7蛋白定位于小鼠X精子尾部的前段和中段，TLR8蛋白定位于小鼠X精子尾部的前段。TLR7和TLR8蛋白在公牛X精子均定位于精子的尾部[16]。近几年，虽然TLR7/8在其他物种精子中的表达情况都相继被报道，并在分离X精子和Y精子上取得明显的效果，但TLR7/8在公猪精子的表达情况还未知。本研究免疫荧光结果显示，TLR7/8在小鼠和牛X精子的尾部表达，在Y精子中不表达，与前人报道类似[15-16]。TLR7和TLR8在公猪X和Y精子都有表达，荧光强弱无显著差异。有趣的是，TLR7在公猪精子的头部表达较高，尾部表达非常低。在精子发生过程中，生殖细胞之间存在一种被称为细胞间桥的通讯通道，它能使精子之间彼此共享物质，包括RNA和蛋白质，以此减小X和Y精子之间的差异，使得每个精子的成熟和功能基本相同[29-30]。本研究结果显示，TLR7/8蛋白在两种性别精子中都有表达，说明在精子发生过程中，由X染色体编码的TLR7/8蛋白在两种性别精子中可能得到了共享，但这并不是所有物质都能得到共享[31]。猪精子的TLR7/8蛋白表达模式与小鼠、牛精子存在着很大的差异，这可能是不同物种间的差异性导致同一蛋白表达模式差异的结果。
精子主要通过氧化磷酸化和糖酵解两种途径来获得能量以保证正常功能的行使，如获能、顶体反应、受精以及鞭毛摆动等[32]。糖酵解途径的抑制可影响精子ATP的产生，进而影响其活力。糖原合成酶激酶3α/β(GSK3α/β)是TLR7/8的下游通路[33]，GSK3α/β的磷酸化能降低糖酵解途径的限速酶-己糖激酶的活性进而减少葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖和ATP的产生[15, 34]。雷西莫特(R848)是TLR7/8受体的激活剂[35]，Umehara等[15-16]使用R848激活小鼠和牛X精子的TLR7/8蛋白，通过R848-TLR7/8-GSK3α/β-己糖激酶轴抑制糖酵解，降低X精子的ATP合成速率进而降低了其活力。本研究中，经R848孵育后精子的活力降低，上层两种性别精子的比例没有显著变化。最近关于猪X和Y精子蛋白质组学的研究显示，在公猪的X/Y精子差异蛋白中并未发现TLR7/8蛋白[36]。R848处理后的精子活力降低，可能是因为精子的糖酵解途径被抑制，产生的ATP减少而影响了精子的运动，而TLR7/8在猪的两种性别精子中都有表达，这可能使R848孵育后X/Y精子活力都受到影响而无法将其分离，这与免疫荧光显示TLR7/8在X/Y精子中没有显著差异的结果相一致。
4 结论本研究发现，TLR7/8在公猪X/Y精子中的表达模式与小鼠和牛存在较大差异，并且在猪的X和Y精子间表达差异不显著。R848能降低公猪精子活力，但不能使X/Y精子分离，表明通过TLR7/8去分离猪X/Y精子的方法是不可行的，为后人通过其他途径开发分离猪X/Y精子的方法提供参考。
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(编辑 郭云雁)