2. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室,广州 510642;
3. 云南西南农牧集团股份有限公司,昆明 650217;
4. 农业农村部畜禽资源(猪)评价利用重点实验室,长沙 410128
2. Guangdong Provincial Laboratory of Lingnan Modern Agricultural Science and Technology, Guangzhou 510642, China;
3. Yunnan Southwest Agriculture and Animal Husbandry Group Co. LTD., Kunming 650217, China;
4. Key Laboratory of Evaluation and Utilization of Livestock and Poultry Resources (Pigs) of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Changsha 410128, China
骨骼肌是哺乳动物机体的重要组成部分,约占成年动物体重的40%,对维持机体运动、呼吸和新陈代谢等起着重要作用[1-3]。在畜牧业中,骨骼肌的生长和发育决定肉的产量和品质。骨骼肌的形成是一个高度复杂且协调有序的生物学过程,受到众多转录因子和信号通路的调控[4-6]。肌管相关蛋白3(myotubularin related protein 3,MTMR3)是肌管相关蛋白家族的重要成员之一[7]。它与肌管蛋白具有广泛的同源性,包括催化结构域,但另外具有包含FYVE结构域的C末端延伸[8]。MTMR3是一种肌醇脂磷酸酶,同时存在于细胞膜和细胞质中[9]。在生物功能方面,MTMR3被证明是自噬的重要组成部分[10],通过调节磷脂酰肌醇3-磷酸(PTDINS3P)决定细胞自噬的起始和自噬体的膜结构大小[11]。研究发现,MTMR3敲降减弱了饥饿诱导的胃腺癌细胞自噬[12]。研究发现,MTMR3及其产物磷脂酰肌醇5-磷酸(PTDINS5P)可通过激活RAC1调控癌细胞迁移和侵袭[13];MIR-99A降低MTMR3的表达抑制口腔癌细胞的迁移和侵袭[14]。MTMR3在乳腺癌中高表达,且与肿瘤复发有关,MTMR3敲除后能抑制人乳腺癌细胞的增殖并诱导自噬[15]。miR-100-5p靶向MTMR3激活AKT和ERK信号通路促进人表皮干细胞增殖[16]。外泌体miR-1910-3p靶向MTMR3并激活NF-κB信号通路,促进乳腺癌细胞增殖、转移和自噬[17]。MTMR3是细胞自噬相关基因且与类风湿关节炎和系统性红斑狼疮风险有关[18]。因此,MTMR3在生物学功能上主要是参与细胞自噬、细胞迁移与侵袭,并且与癌细胞的生长发育密切相关。
在骨骼肌发育方面,研究发现Mtmr3能够被miR-99a-5p靶向促进鸡卫星细胞增殖并抑制成肌分化[19],但并未深入探究其在肌细胞中的表达规律和调控机制。MTMR3可与哺乳动物雷帕霉素复合物1(mammalian target of rapamycin complex, mTORC1)相互作用并抑制其活性调节细胞自噬[20],mTORC1是mTOR的两个蛋白复合物之一,且mTORC1是骨骼肌蛋白质合成的关键通路也是调控细胞自噬的重要基因[21-22]。Mtor主要通过调控下游基因P70s6k激酶或elF4E结合蛋白发挥各种生物学功能[23-25]。Mtor通路在成肌细胞增殖与分化过程中扮演着至关重要的作用,研究发现敲降Ccn3基因通过失活Mtor通路抑制成肌细胞的增殖与分化[26],miR-141通过失活Mtor通路加速C2C12细胞凋亡并引发肌功能性障碍[27]。因此,Mtmr3可能通过介导Mtor信号通路影响成肌细胞的增殖与分化。
小鼠成肌细胞系(C2C12)是研究骨骼肌生物学过程的通用模型[28]。为探究Mtmr3对骨骼肌生长发育的调控机制,本研究以C2C12细胞为试验对象,先检测Mtmr3在成肌细胞生长期与分化期的表达规律,再通过转染siRNA干扰细胞内Mtmr3的表达,研究Mtmr3对成肌细胞增殖与分化的调控机制,旨在为畜禽骨骼肌细胞增殖与分化的调控网络提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 细胞及试剂小鼠成肌细胞系(C2C12)由中国科学院亚热带生态研究所提供;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、马血清(horse bovine serum,HBS)、DMEM培养液均购于美国Gibco公司;总RNA提取试剂盒购于北京天根生物科技有限公司;Lipofectamine 2000脂质体、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒均购于美国Invitrogen公司;CCK-8试剂盒购于美国AFExBIO生物公司;EdU试剂盒购于大连美仑生物有限公司;siRNA片段由中国吉玛生物科技有限公司设计并合成;qRT-PCR引物合成于北京擎科生物有限公司;MTMR3抗体购于美国ABclonal公司;MyHC抗体购于美国DSHB公司;p-mTOR抗体购于成都正能生物有限公司;p-S6K抗体购于美国Cell Signaling Technology生物公司;PCNA抗体和CDK4抗体购于长沙艾方生物科技有限公司;β-actin购于美国Proteintech公司;Western blot(WB)试验中的二抗和的其它试剂材料均购于长沙艾碧维生物科技有限公司。
1.2 C2C12成肌细胞的培养和分化将常规复苏传代的C2C12成肌细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养,当细胞密度达到80%左右时,用胰酶消化进行传代。诱导细胞体外分化,细胞融合度达到80%时,将培养基更换成含2%马血清的DMEM培养基诱导细胞成肌体外分化,每2 d换1次培养液。以细胞贴壁后增殖生长第12、24、36和48 h以及成肌细胞开始诱导分化第0(D0)、2(D2)、4(D4)和6(D6)天收取细胞,用于qTR-PCR检测Mtmr3基因在生长期与分化期的表达。
1.3 细胞转染将C2C12成肌细胞接种于6孔或96孔板中,当细胞融合到一定程度时(增殖试验细胞密度为30%,分化试验细胞密度为80%),使用不含血清的DMEM饥饿细胞2 h,再根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书转染siRNA,处理细胞6 h后,根据不同试验更换相应培养基进行后续试验。
1.4 CCK-8和EdU检测细胞增殖C2C12成肌细胞接种在96孔板中进行转染处理,每组设置3个生物学重复,CCK-8细胞活力试验分别在转染后6和24 h加入CCK-8试剂,孵育4 h,置于酶标仪450 nm波长下检测细胞的吸光值,以6 h作为对照,计算24 h的相对增殖率。EdU细胞增殖试验按照EdU cell proliferation kit with fluor 555说明书进行,在96孔板中培养细胞,转染后24 h对细胞进行固定并EdU染色,最后置于倒置荧光显微镜下随机拍照并保存图片,每组设置3个生物学重复,每个孔至少采集5个不同视野。采用Image J软件对细胞进行计数,并计算EdU阳性细胞占总细胞数的比例。
1.5 免疫荧光染色试验(immunofluorescence technique)在6孔板中体外诱导成肌细胞分化第6天,根据传统的免疫荧光染色方法进行操作,本试验使用来源于不同种属的MyHC和MTMR3两支一抗,不同颜色的二抗进行双染色,设置3个生物学重复,最后置于倒置荧光显微镜下拍照获得图象。
1.6 蛋白质免疫印迹(Western blot)在6孔板中培养细胞,每组设置3个生物学重复,收取转染处理培养的成肌细胞并提取其总蛋白,根据BCA蛋白定量试剂盒使用说明测定蛋白浓度。经过一系列的WB试验后获得蛋白条带,并利用Image J软件进行灰度分析。
1.7 总RNA提取与实时荧光定量PCR按照TRIzol试剂盒说明提取细胞的总RNA,使用分光光度计检测RNA的质量和浓度。根据Invitrogen的逆转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA进行荧光定量。引物由NCBI网站在线设计,并由北京擎科生物有限公司合成,引物序列见表 1,结果以Gapdh为内参基因,基因的相对表达量使用2-ΔΔCT计算。
每组试验至少设置3个重复,使用GraphPad prism 8对处理组和对照组进行t检验,试验数据以“平均值±标准差”的形式表现,P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 Mtmr3在C2C12成肌细胞生长期与分化期的时序表达提取细胞生长期第12、24、36和48 h以及分化期第0、2、4和6天的细胞总RNA,使用qRT-PCR技术检测Mtmr3基因在成肌细胞生长期与分化期的时序表达。结果显示,Mtmr3在生长期的表达量总体呈下降趋势,且与增殖标志基因Pcna的表达趋势相反(图 1A-B);而在分化期则呈逐渐上升趋势,与成肌后期分化标志基因Myhc的表达趋势相同(图 1C-D)。免疫荧光染色结果显示,Mtmr3在成肌细胞分化第6天时呈肌管状,与Myhc高度重合(图 1E)。因此,Mtmr3基因可能参与调控成肌细胞的增殖与分化。
2.2.1 Mtmr3的干扰效率检测 成肌细胞转染Mtmr3 siRNA,分别继续增殖生长培养24 h收集细胞总RNA样品,培养48 h收集蛋白样品进行检测。结果显示,Mtmr3 siRNA组能够极显著地降低细胞内Mtmr3基因mRNA(图 2A)和蛋白(图 2B-C)的表达水平(P<0.01)。因此,可使用该干扰片段进行后续试验。
2.2.2 干扰Mtmr3对C2C12成肌细胞增殖的影响 鉴于Mtmr3在成肌细胞生长期的表达水平总体呈下降趋势,Mtmr3基因可能与成肌细胞的增殖呈负相关。为了揭示其对成肌细胞增殖的影响,转染Mtmr3 siRNA处理成肌细胞24 h,使用EdU和CCK-8技术分别检测成肌细胞的DNA复制能力和细胞活力。结果显示,与对照组相比,干扰Mtmr3表达后,EdU阳性细胞占总细胞的比率极显著增加(P<0.01,图 3A-B),细胞活力也极显著增加(P<0.01,图 3C)。
转染Mtmr3 siRNA处理成肌细胞48 h,使用Western blot检测增殖细胞核抗原(Pcna)和细胞分裂蛋白激酶4(Cdk4)的蛋白表达水平,以及使用qRT-PCR检测Pcna、Cdk4和Ccnd增殖基因的mRNA表达水平。结果显示,与对照组相比,干扰Mtmr3表达后,Pcna和Cdk4的蛋白表达水平极显著升高(P<0.01,图 4A-C);干扰Mtmr3表达后,Pcna、Cdk4和Ccnd基因的mRNA表达水平均极显著升高(P<0.01,图 4D-F)。由上述结果可知,干扰Mtmr3基因促进成肌细胞增殖。
已知Mtmr3在成肌细胞分化期的表达量逐渐增多且免疫荧光染色呈肌管状,因此,MTMR3可能与成肌细胞分化呈正相关。将Mtmr3 siRNA转染成肌细胞并诱导分化6 d后检测分化后期标志基因Myhc的蛋白表达水平,结果显示,Myhc的蛋白表达水平极显著降低(P<0.01,图 5A-B)。转染Mtmr3 siRNA分别诱导成肌细胞分化2、4和6 d后收集细胞提取总RNA,检测MTMR3、Myog和Myhc的mRNA表达水平,结果显示,在分化第4和6天,MTMR3、Myog和Myhc基因的mRNA表达水平均被极显著抑制(P<0.01,图 5C-E)。由上述结果可知,干扰Mtmr3基因抑制成肌细胞分化。
早期的研究报道,MTMR3能够与mTORC1相互作用并抑制其活性[20],而mTORC1是促进成肌细胞增殖与分化的重要通路,因此,推测Mtmr3可能是通过调控Mtor信号通路影响成肌细胞的增殖与分化。细胞转染Mtmr3 siRNA分别进行生长培养48 h和分化培养6 d。在细胞生长期,干扰Mtmr3后,Mtor和P70s6k的磷酸化蛋白表达水平均极显著升高(P<0.01,图 6A-C);而在细胞分化期,干扰Mtmr3后,Mtor和P70s6k的磷酸化蛋白表达水平均极显著降低(P<0.01,图 6D-F)。使用Mtor的特异性抑制剂Rapamycin(Rapa)及其阴性对照组二甲基亚砜(DMSO)分别与Mtmr3 siRNA和siRNA NC共同处理细胞24 h,CCK-8的结果表明(图 6G),Mtmr3 siRNA能够抵消部分Rapa的抑制作用,促进成肌细胞增殖(P<0.01);在成肌细胞诱导分化到第4天时加入Rapa及其对照组DMSO处理细胞24 h,细胞内Mtor、P70s6k、Myog和Myhc基因的mRNA表达水平均显著降低(P<0.05,图 6H)。由上述结果可知,干扰Mtmr3是通过介导Mtor信号通路促进成肌细胞增殖并抑制成肌分化。
肌管相关蛋白家族(myotubularin related proteins family,MTMRs)的主要成员包括MTMR3、MTMR5、MTMR6、MTMR7、MTMR8、MTMR9和MTMR14。有研究发现,Mtmr7在C2C12成肌细胞分化期的表达量逐渐增多,在干扰Mtmr7基因后,C2C12成肌细胞的增殖与早期分化能力极显著地增强[29]。MTMR8与PI3K互作调节肌动蛋白丝建模和肌肉发育[30]。MTMR14是一种新型磷酸酶,在睾丸、骨骼肌和心肌中高表达[31],并会随着年龄的增长而减少表达,通过改变钙稳态加速骨骼肌的衰老,在Mtmr14敲除后,小鼠会出现严重的肌无力和肌肉疲劳现象[32]。这些结果表明,肌管相关蛋白家族具有调控肌肉发育的作用。而MTMR3生物学功能的研究集中在细胞自噬与癌细胞生长方面[15],但在肌肉发育方面的研究鲜有报道,有研究发现Mtmr3能够被miR-99a-5p靶向促进鸡卫星细胞增殖并抑制成肌分化[19],但是关于Mtmr3在成肌细胞中的表达规律和调控机制并未深入探究。
在本试验中,以小鼠成肌细胞为研究对象,研究结果显示,Mtmr3在成肌细胞生长期的表达量总体呈下降趋势且与增殖标志基因Pcna的表达趋势相反,这暗示Mtmr3可能与成肌细胞增殖呈负相关;而在分化期,Mtmr3与分化标志基因Myhc的表达量都呈逐渐上升趋势,双标免疫荧光染色检测Mtmr3呈肌管状且与Myhc高度重合。据报道,一些非肌源性转录因子Myoc[33]、Tgm2[34]和Clf2[35]等随着成肌细胞分化时间延长其表达量逐渐升高,免疫荧光染色也呈肌管状,功能性试验发现,它们具有调控成肌细胞增殖与分化的作用。因此,Mtmr3参与调控成肌细胞增殖与分化。随后通过干扰细胞内Mtmr3的表达分析其对成肌细胞增殖与分化的影响。结果表明,在增殖试验中,干扰Mtmr3后,EdU阳性细胞占总细胞的比率极显著升高并且细胞活力极显著升高,增殖标志基因Pcna和Cdk4的mRNA水平及蛋白表达水平均极显著升高;在分化试验中,干扰Mtmr3后,分化标志基因Myhc的蛋白表达水平极显著降低,并在成肌细胞分化第4和6天,Mtmr3、Myog和Myhc基因的mRNA表达水平均极显著被抑制。成肌细胞的增殖与分化过程非常复杂,受到众多转录因子的有序调控,包括增殖标志基因和分化标志基因参与,其中肌特异性增殖因子Pax3可以激活早期分化因子Myf5和Myod使成肌细胞退出细胞周期开始分化[36]。研究发现,干扰Ide基因促进成肌细胞增殖并抑制成肌分化[37],miR-487b-3p通过靶向PITX2促进成肌细胞增殖而抑制成肌分化[38]。因此,促进成肌细胞增殖则抑制其分化。
mTOR是一种丝氨酸-苏氨酸激酶,调节包括细胞增殖与分化在内的多种生物学过程。mTOR形成两个蛋白质复合体mTORC1和mTORC2,其中mTORC1在骨骼肌蛋白质合成中起主导作用,同时也是细胞自噬的重要基因[39]。mTOR通路现已被证明是骨骼肌生长发育的关键调控因子[40],控制肌纤维形成等多个过程[41]。在成肌细胞中,mTOR信号被上游的PI3K-Akt信号激活,导致P70s6k的磷酸蛋白表达水平增加,促进mRNA翻译和蛋白质合成,最终促进成肌细胞增殖和分化[42]。研究发现,MTMR3能与mTORC1相互作用并抑制其活性进而诱导细胞自噬[20]。因此,Mtmr3可能是通过调控Mtor信号通路影响成肌细胞的增殖与分化。在增殖期,干扰Mtmr3后,Mtor和P70s6k的磷酸化蛋白表达水平均极显著升高;使用Mtor的特异性抑制剂Rapamycin(Rapa)及其阴性对照组二甲基亚砜(DMSO)分别与Mtmr3 siRNA和siRNA NC共同处理细胞24 h,结果显示干扰Mtmr3能够扭转Mtor抑制剂对成肌细胞的抑制作用,促进成肌细胞增殖;在分化期,干扰Mtmr3后,Mtor和P70s6k的磷酸化蛋白表达水平均极显著降低。但失活Mtor通路会抑制成肌细胞分化吗?因此,使用Mtor通路抑制剂使Mtor通路失活,细胞内Mtor、P70s6k、Myog、Myhc的mRNA表达水平均显著降低。Mtor通路激活具有促进成肌细胞内蛋白质合成的功能,上调Mtor和P70s6k磷酸化蛋白表达促进成肌细胞的增殖与分化,下调Mtor和P70s6k的磷酸化蛋白表达则抑制成肌细胞的增殖与分化[43]。研究发现,过表达REV-ERBα通过激活Mtor通路促进成肌细胞分化[44],过表达miR-432失活Mtor通路抑制调控成肌细胞分化[45]。但是关于干扰Mtmr3基因后,增殖阶段Mtor和P70s6k的磷酸化蛋白表达上调,而分化阶段Mtor和P70s6k的磷酸化蛋白表达下调,两者不同的具体原因还有待探究。
4 结论本研究结果表明,Mtmr3在成肌细胞生长期的表达量呈下降趋势,而在分化期呈逐渐上升趋势,免疫荧光染色呈现肌管状。干扰Mtmr3后,通过激活Mtor通路促进成肌细胞增殖,通过失活Mtor通路抑制成肌细胞分化。本研究为Mtmr3在成肌细胞增殖与分化的调控机制等方面提供了参考。
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(编辑 郭云雁)