乳脂肪含量的高低直接决定了牛奶及其乳制品的品质与口感,同时也是评价牛奶质量的主要指标之一[1-2]。乳腺组织内部汇集大量具有泌乳功能的腺泡,牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)以单层而紧密的方式排列在腺泡周围,乳汁是在乳腺上皮细胞内由血液中的各类营养物质经过一系列复杂生化过程而形成[3-4]。乳脂主要是以脂滴的形式存在,甘油三酯的含量约占97%~98%,其余部分由构成磷脂膜的磷脂、胆固醇脂、胆固醇、二酰甘油、单酰甘油等构成。
乳脂合成调控受环境、遗传、激素、生理等多种因素的影响,其中遗传是影响乳脂肪合成调控的最主要因素[5-6]。目前已鉴定了一批与乳脂合成密切相关的基因功能:乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase-α,ACACA)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)可以促进脂肪从头合成[7-9];硬脂酰辅酶A脱饱和酶1(stearoyl-coenzyme a desaturase 1,SCD1)、二酰甘油酰基转移酶1(diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1)与类脂1(lipin 1,LPIN1)均参与三酰甘油的加工[10-14];白细胞分化36蛋白(fatty acid translocase,CD36)与脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein,FABP)在脂肪合成过程中执行运输功能[15-16];过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor,PPAR)以及固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein,SREBP)是哺乳动物脂质合成过程中的重要转录因子,在脂肪合成过程中发挥着重要的调控作用[17-18]。同时,非编码基因也被发现参与调节BMECs乳脂肪合成[19],但目前关于乳脂肪合成调控机制的认识仍十分有限。
lncRNA是指长度大于200个核苷酸的RNA分子,通常不具有编码蛋白质的能力,以RNA的形式参与机体生命过程的调控,在动物细胞的增殖、分化、新陈代谢以及疾病等方面均发挥重要作用[20]。lncRNA在细胞中不同位置可能产生不同功能,位于细胞质中的lncRNA可能通过竞争内源性RNA(ceRNA)机制与miRNA结合,以减弱miRNA对靶向mRNA表达的抑制进而发挥功能作用[21-22]。近年来,越来越多的证据表明lncRNA通过ceRNA机制在乳腺发育与泌乳调控方面发挥重要,郝志云[23]通过对不同品种的绵羊乳腺组织长链非编码RNA测序,发现lncRNA可通过竞争性结合miRNAs参与乳腺发育和泌乳,且证实MSTRG.7526.1通过竞争性结合miR-200c调控PANK3基因表达,进而抑制乳腺上皮细胞甘油三酯的合成;刘丽华等[24]研究发现,lncRNA MPNCR能够与miR-31竞争性结合靶向调控基因CAMK2D表达区调节乳腺上皮细胞的增殖;lncRNA EPB41L4A-AS通过负调控ErbB 3激活PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路从而促进乳蛋白的合成[25]。但是,目前lncRNA在奶牛乳脂合成方面的研究较少,lncRNA在BMECs乳脂合成中的作用机制研究刚刚起步,其所参与的分子调控网络有待阐明。因此,本研究在本实验室前期全转录组测序工作基础上,探究lncRNA-LRTN4RL1-AS对乳脂合成的作用。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所使用的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)由西北农林科技大学国家肉牛改良中心保存提供。
1.2 主要试剂与仪器1.2.1 主要试剂 DMEM/F12培养基购于Hyclone;胎牛血清(FBS)购于PAN-Biotech;Lipofectamine 3000 Reagent购自Invitrogen公司;牛胰岛素与氢化可的松购于Sigma;牛催乳素购于ProsPec;TRIzol与反转录试剂盒购于TaKaRa;荧光定量试剂盒购于全式金;miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒与miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)购于天根生化有限公司;油红O购于Solarbio;甘油三酯酶法测定试剂盒购于北京普利莱;去内毒素质粒试剂盒、胶回收试剂盒购于Omega;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于百赛生物公司(货号为F6075S);核质分离试剂盒购自Ambion® PARISTM Kit (货号: AM1921);PPARγ、β-actin抗体以及lncRNA-LRTN4RL1-AS的siRNA-600和siRNA-642与miR-27a-3p的mimics、NC、inhibitor、inhibitor-NC购于生工生物工程有限公司(序列见表 1)。
1.2.2 主要仪器 PCR仪、核酸电泳设备、半干转膜仪、实时荧光定量PCR仪、核酸凝胶成像仪、蛋白凝胶成像仪(Bio-Rad美国);冷冻离心机(Eppendorf德国);倒置显微镜(OLYMPUS日本);高压灭菌锅(ZEALWAY美国);超低温冰箱(-80 ℃)(SANYO日本)等仪器。
1.3 试验方法1.3.1 牛lncRNA-LRTN4RL1-AS的核质定位 使用未进行分化的奶牛乳腺上皮细胞,按照试剂盒说明书(Ambion® PARISTM Kit)进行细胞核与细胞质的RNA分离,同时验证RNA的完整性,然后将RNA反转录成cDNA进行实时定量PCR(RT-qPCR)试验,检测lncRNA-LRTN4RL1-AS在细胞质与细胞核的含量。
1.3.2 细胞转染、油红O染色以及甘油三酯测定 将BMECs接种于12孔板,密度达到70%左右时进行转染。转染前1 h更换培养基,siRNA试剂按照Lipofectamine 3000说明书步骤转染,每组设置3个重复孔。转染48 h后收集细胞,PBS清洗两遍,4%多聚甲醛固定30 min,弃去甲醛PBS清洗两遍,油红O染液(饱和油红O∶蒸馏水=3∶2)染色30 min,PBS清洗去多余的油红O染液,显微镜下观察拍照。甘油三酯按照北京普利莱甘油三酯酶法测定试剂盒说明书进行测定。
1.3.3 总RNA提取、反转录以及实时定量PCR 按照TRIzol说明书方法提取RNA。按照TaKaRa反转录试剂盒说明书合成cDNA,稀释为30倍。然后以该cDNA作为模板,通过RT-qPCR检测基因表达量,泛素表达转录因子(ubiquitously expressed transcript,UXT)为内参基因,对LRTN4RL1-AS、激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)、CCAAT/增强子结合蛋白α (CCAAT enhancer binding protein alpha,CEBPα)、CCAAT/增强子结合蛋白β (CCAAT enhancer binding protein beta,CEBPβ)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARγ)、脂肪酸结合蛋白2 (fatty acid binding protein 2,FABP2)、乙酰辅酶A羧化酶α (acetyl-CoA carboxylase alpha,ACACα) 进行定量分析。以U6为内参基因对bta-miR-27a-3p进行定量分析,引物序列见表 2。反应体系为15 μL:SYBR为7.5 μL,cDNA为6.9 μL,上、下游引物各为0.3 μL。反应程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,45个循环,基因相对表达量根据2-ΔΔCt法计算。
1.3.4 Western blot 吸出细胞培养板中所有培养基,并用PBS轻柔的清洗细胞3次;6孔板每孔按RIPA(蛋白裂解液)∶PMSF(蛋白酶抑制剂)=100∶1的比例加入150 μL混合液;冰上裂解30 min,于冰上用细胞刮刀刮细胞培养板底部,使细胞充分裂解;将裂解液转移至1.5 mL离心管中,4 ℃,12 000×g离心10 min,100 ℃变性10 min;制作分离胶和浓缩胶,电泳80 V 30 min、120 V 1 h;快速封闭30 min;一抗(1∶2 000)4 ℃孵育14~16 h;二抗(1∶7 500)室温2 h。
1.3.5 双荧光素酶报告基因的构建和检测 利用预测软件Bibiserv2 (http://regrna2.mbc.nc-tu.edu.tw/detection.html)与miRBase(http://www.mirbase.org/search.shtm)预测LRTN4RL1-AS与miRNA-27a-3p结合位点,设计PGL3-LRTN4RL1-AS-野生型、PGL3-LRTN4RL1-AS-突变型分别设计引物插入Kpn I和Hind III两个酶切位点,使用TK作为内参,PGL3-LRTN4RL1-AS-野生型、PGL3-LRTN4RL1-AS-突变型转染的量为500 ng·mL-1,TK的转染量为50 ng·mL-1,miRNA-27a-3p mimics、NC转染量为50 nmol·mL-1转染于293A细胞后24 h后收样,按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行检测。
1.3.6 数据统计与分析 试验均设置3个生物学重复,所有数据结果使用SPSS Statistics 22.0软件独立样本T检验进行显著性分析,数据以“平均值±标准差”来表示,P < 0.05表示差异显著,P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 lncRNA-LRTN4RL1-AS的筛选以及核质分离利用测序得到的LRTN4RL1-AS序列放入UCSC和NCBI数据库进行比对,发现LRTN4RL1-AS位于牛第19号染色体上,由LRTN4RL1基因所在DNA链的反义链转录而来,含有3个外显子(图 1A)。通过CPC(coding potential calculator,http://cpc.gao-lab.org/programs/run_cpc.jsp)和CPAT(coding potential assessment tool,http://lilab.research.bcm.edu/cpat/) 两个软件预测转录本的编码能力,结果表明,LRTN4RL1-AS序列不具有编码蛋白质的能力(图 1B)。利用牛乳腺上皮细胞进行核质分离试验,确定LRTN4RL1-AS的亚细胞定位,结果显示,LRTN4RL1-AS主要分布于细胞质(图 1C)。
将siRNA和NC分别转染进BMECs细胞中,处理后48 h检测干扰效率,发现siRNA-600与siRNA-642的LRTN4RL1-AS均显著低于NC组(P < 0.05,图 2A),siRNA-642的干扰效率达60%满足后续的试验要求。干扰LRTN4RL1-AS后甘油三酯的含量也显著低于对照组(P < 0.05, 图 2B),脂滴形成的数量明显减少(图 2C)。同时,干扰LRTN4RL1-AS显著下调脂质合成关键基因CEBPα(P < 0.01)、CEBPβ(P < 0.01) 和PPARγ表达(P < 0.05,图 2D、E),而脂质分解基因HSL则显著上调(P < 0.05, 图 2D);PPARγ基因WB试验结果和定量结果一致(图 2F)。结果表明, 干扰LRTN4RL1-AS抑制奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成。
通过软件(Bibiserv2)预测发现,LRTN4RL1-AS与miR-27a-3p具有两个结合位点(图 3A),且发现干扰LRTN4RL1-AS后miR-27a-3p表达显著上调(P < 0.05,图 3B),表明lncRNA-LRTN4RL1-AS与miR-27a-3p可能存在靶向结合关系。构建野生型与突变型pGL3-LRTN4RL1-AS载体并与mimics- miR-27a-3p共同转染进乳腺上皮细胞,发现LRTN4RL1-AS野生型组(LRTN4RL1-AS WT+mimics- miR-27a-3p)荧光素酶活性显著低于突变型组(LRTN4RL1-AS MT+mimics- miR-27a-3p)(P < 0.01,图 3C)。以上结果表明,LRTN4RL1-AS与miR-27a-3p存在靶向结合的关系。
利用mimics-miR-27a-3p和NC转染BMECs,发现mimics-miR-27a-3p组的miR-27a-3p表达量极显著高于NC组(P < 0.01,图 4A)。mimics处理后乳腺上皮细胞脂滴的数量明显减少(图 4C),甘油三酯的含量显著低于对照组(P < 0.05,图 4B),同时显著下调成脂关键基因CEBPα、CEBPβ、ACACA和PPARγ表达(P < 0.01,图 4D、E、F),而脂质分解基因HSL表达则显著上调(P < 0.01,图 4D)。
将inhibitors-miR-27a-3p和NC转染BMECs,发现inhibitors-miR-27a-3p组miR- 27a-3p表达量极显著低于对照组(P < 0.01,图 5A),乳腺上皮细胞中脂滴形成数量(图 5C)和甘油三酯的含量显著高于对照组(P < 0.01,图 5B),成脂相关基因CEBPα、CEBPβ、PPARγ、ACACA的表达极显著上调(P < 0.01,图 5D、E、F),而脂质分解基因HSL表达显著下调(P < 0.05,图 5D)。结果表明miR-27a-3p抑制乳腺上皮细胞的乳脂的合成。
在验证lncRNA-LRTN4RL1-AS与miR-27a-3p存在靶向结合基础上研究lncRNA-LRTN4RL1-AS是否通过竞争性结合miR-27a-3p发挥调节作用。结果显示,inhibitor-miR-27a-3p逆转了干扰LRTN4RL1-AS对乳脂合成的抑制作用(P < 0.05,图 6A、B);同时发现,inhibitors-miR-27a-3p也能够逆转si-LRTN4RL1-AS对LRTN4RL1-AS、miR-27a-3p以及成脂关键基因PPARγ的表达(图 6C、D、E、F)。结果表明LRTN4RL1-AS通过与miR-27a-3p结合调控PPARγ表达进而调控奶牛乳腺上皮细胞乳脂的合成。
乳脂肪是牛奶的主要营养成分,可为人类提供营养和能量,因此生产具有足够乳脂肪含量的优质牛奶是健康食品的发展趋势,而挖掘影响乳脂肪合成的功能基因一直是奶牛分子育种中的研究热点。目前已鉴定了大量与乳脂代谢相关的功能基因,此外,随着候选基因筛选策略和比较基因组学研究方法的发展,非编码RNA成为调控乳脂肪合成的一类重要因子,一些非编码RNA被研究证明参与乳脂肪合成调控[26],但相较于miRNA,lncRNA在乳腺上皮细胞乳脂肪合成中的作用及机制研究刚刚起步,Yang等[27]通过对奶牛干奶期和泌乳期乳腺组织进行高通量RNA测序,鉴定出3 746个差异表达的lncRNAs;Mumtaz等[28]对不同产奶量奶牛的乳腺组织测序鉴定出45个差异表达的lncRNAs,但lncRNA功能及作用机制还有待进一步深入研究解析。鉴于此,本研究在前期测序的基础上研究lncRNA-LRTN4RL1-AS对乳腺上皮细胞乳脂合成的作用及其机制。
本研究发现,干扰lncRNA-LRTN4RL1-AS抑制脂滴形成和甘油三酯的积累,同时显著下调了乳脂合成相关基因(CEBPα、CEBPβ和PPARγ)和上调了脂质分解的基因(HSL) 的表达。CCAAT/增强子结合蛋白(CEBP)是乳脂合成过程中的重要转录因子,可以通过激活PPARγ的表达从而调节脂肪细胞的脂滴形成,是脂肪生成过程有丝分裂克隆扩增所必须的基因,在乳脂合成中发挥关键的作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是PPAR家族成员,是脂肪合成的关键调节剂,作为激活剂启动脂肪分化[29-30]。在干扰PPARγ后能够显著降低脂肪细胞分化[31]与甘油三酯含量[32-33],且有研究发现其参与了乳脂的合成调节。激素敏感性脂肪酶(HSL)是最早发现的脂质分解基因,影响脂肪细胞功能,促进甘油二酯水解[34],同时Liu等[35]发现,HSL可以减少脂肪细胞中的脂质形成。表明lncRNA-LRTN4RL1-AS通过正向调控乳脂合成相关基因CEBPα、CEBPβ和PPARγ的表达促进乳脂合成,同时负调控脂质分解基因HSL的表达抑制脂质分解,进而促进乳脂合成。
本试验通过核质分离发现,LRTN4RL1-AS主要位于细胞质中,研究发现LRTN4RL1-AS和miR-27a-3p之间存在靶向结合关系,而前期研究表明位于细胞质中的lncRNA可以作为海绵分子与miRNA竞争性的结合调控靶基因的表达使其发生相应的表型变化[36],表明LRTN4RL1-AS可能通过与miR-27a-3p结合发挥其功能作用。进一步研究发现,miR-27a-3p对乳腺上皮细胞脂滴形成和甘油三酯的积累具有负调控作用,与现有研究结果一致[37-38],而且前期已有研究表明PPARγ是miR-27a-3p的靶基因,miR-27a-3p可以通过靶向PPARγ影响大脑发育[39-40]、耐药性和糖代谢[41-43],特别是已有研究表明miR-27a-3p负调控PPARγ参与奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成[33];此外,本研究证实,inhibitor-miR-27a-3p逆转了干扰LRTN4RL1-AS对乳脂合成的抑制作用,同时降低了干扰LRTN4RL1-AS对PPARγ基因的表达抑制,表明LRTN4RL1-AS通过与miR-27a-3p结合靶向PPARγ调控奶牛乳腺上皮细胞的乳脂合成。
4 结论本研究揭示新的lncRNA-LRTN4RL1-AS通过竞争性结合bta-miR-27a-3p调控PPARγ的表达来调节乳脂合成,为后续深入研究乳腺上皮细胞脂肪合成分子机制提供了理论基础。
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(编辑 郭云雁)