表 1(Table 1)
图 1(Fig. 1)
AGRP基因在山羊组织表达及其对黑色素生成的作用机制
引用本文
陈灿灿, 蒋婧, 孙晓燕, 任航行, 李杰. AGRP基因在山羊组织表达及其对黑色素生成的作用机制[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(4): 1441-1451.
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AGRP基因在山羊组织表达及其对黑色素生成的作用机制
1. 重庆市畜牧科学院, 重庆 402460;
2. 重庆市山羊工程技术研究中心, 重庆 402460
2. 重庆市山羊工程技术研究中心, 重庆 402460
摘要：为了阐明AGRP基因在山羊皮肤表达模式以及对黑色素生成的作用机制。本研究通过qRT-PCR法检测AGRP基因在3只酉州乌羊不同组织和3只板角山羊皮肤组织表达情况。同时，通过体外试验分析不同浓度外源性AGRP蛋白对黑色素细胞影响，利用EdU法检测细胞活力、环磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）试剂盒检测cAMP活性、并检测其对真黑色素含量和黑素生成相关基因黑素皮质素1型受体（melanocortin 1 receptor，MC1R）、酪蛋白酶（tyrosinase，TYR）、酪蛋白酶相关蛋白酶1（tyrosinase related protein 1，TYRP1）、多巴色素互变异构酶（dopachrome tautomerase，DCT）mRNA表达的影响。结果表明，AGRP基因在酉州乌羊组织均有表达，其中在垂体中表达最高，与其他组织相比差异显著（P < 0.05）；板角山羊与酉州乌羊皮肤中AGRP表达量差异极显著（P < 0.05）。添加不同浓度AGRP蛋白对黑色素生成和黑色素细胞增殖影响不显著（P>0.05）；随着AGRP浓度的升高，黑色素生成通路中cAMP活性显著下降（P < 0.05）；200 nmol·L-1 AGRP显著抑制MC1R mRNA表达且促进TYR、TYRP1 mRNA表达（P < 0.05）；添加不同浓度外源性α-MSH均显著（P < 0.05）挽救AGRP对黑色素细胞功能的影响。AGRP基因与酉州乌羊皮表型密切相关，确定AGRP在黑色素生成过程中的生物学功能为深入揭示AGRP对酉州乌羊皮肤黑色素沉积的作用机制奠定基础。
关键词：酉州乌羊 AGRP 基因表达 黑色素细胞
Expression of AGRP Gene in Goat Tissue and Its Action Mechanism on Melanin Production
1. Chongqing Academy of Animal Sciences, Chongqing 402460, China;
2. Chongqing Center for Goat Research, Chongqing 402460, China
2. Chongqing Center for Goat Research, Chongqing 402460, China
Abstract: In order to elucidate the expression pattern of AGRP gene in goat skin and its action mechanism on melanin production. The tissue expression level of AGRP gene in different tissues of Youzhou dark goats and skin tissue of 3 Banjiao goats were detected by qRT-PCR. And the effects of exogenous AGRP protein at different concentrations on melanocytes were analyzed by in vitro experiments. The cell viability was detected by EdU method, and cAMP activity was detected by cyclic adenosine monophosphate kit, as well as its effects on the content of eumelanin and the mRNA expression of melanin-related genes MC1R, TYR, TYRP1 and DCT. This results showed that AGRP gene was expressed in different tissues of Youzhou dark goats and its expression in the pituitary gland was the highest (P < 0.05). Meanwhile, the expression level of AGRP in the skin of Banjiao goat and Youzhou dark goat were significantly different (P < 0.05). The addition of different concentrations of AGRP protein had no significant effect on the melanin production and proliferation of melanocytes (P>0.05). cAMP activity in the melanin production pathway significantly decreased (P < 0.05) with the increasing of AGRP concentration. The 200 nmol·L-1 AGRP significantly inhibited the expression of MC1R mRNA and enhanced the mRNA expression of TYR and TYRP1 (P < 0.05). The addition of exogenous α-MSH at different concentrations could significantly (P < 0.05) salvage the effects of AGRP on function of melanocyte. AGRP gene is closely related to that phenotype of Youzhou dark goat skin. Determining the biological function of AGRP in melanin production can lay the foundation for further revealing the mechanism of AGRP on melanin deposition in skin of Youzhou dark goat.
Key words:
Youzhou dark goat AGRP gene expression melanocyte
黑色素是一种生物多聚体，广泛存在于动植物及微生物中。动物的毛发、皮肤和眼睛的颜色均由黑色素的相对数量、性质和分布所决定。黑色素细胞不仅负责在黑素体内合成黑色素，而且负责把黑素体运输到周围的表皮细胞(角质细胞)[1]。哺乳动物和鸟类的黑色素细胞会产生两种化学性质显著不同的黑色素：真黑色素(eumelanin)和伪黑色素(pheomelanin)。真黑色素为黑色或棕色的含氮大分子，是包括5，6-双羟基吲哚(5，6-dihydroxindole，DHI)和5，6-双羟基吲哚-2-羧基酸(5，6-dihydroxyindole-2-carboylicacid，DHICA)来源的高度异源的多聚体，主要存在于家畜的黑/棕色被毛中；而家畜的黄色或红棕色被毛则富含由苯丙噻嗪(benzothiazlile)等含硫大分子组成的伪黑色素。它们均由一个限速酪氨酸激酶(TYR)在黑色素细胞中合成[2]。
目前发现的参与黑色素形成的主要信号传导通路有3种(腺苷酸环化酶/cAMP、蛋白激酶C和酪氨酸激酶信号通路)。其中腺苷酸环化酶/cAMP信号通路被认为在黑色素生成过程中起关键作用[3-4]，它通过细胞外配体(α-MSH或ASIP)与相应受体(MC1R)结合，调节胞内第二信使cAMP的水平而引起级联反应。Agouti相关蛋白(agouti-related protein，AGRP)与刺豚鼠信号蛋白(agouti，ASIP)是大小与结构相似的同源蛋白[5-6]。在皮肤中，ASIP蛋白拮抗黑素细胞激素α(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)对MC1R有刺激作用，从而调控真/伪黑色素的生物合成，决定真黑色素与伪黑色素合成的数量与比率。研究发现，AGRP基因能取代或协同ASIP基因，影响黑素细胞激素α(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)与MC1R的结合[7]。但在哺乳动物中，AGRP作为一种摄食神经肽，通过拮抗α-MSH与之竞争性结合MC3R、MC4R受体，引起多食和肥胖症的发生[8-11]，它是否对哺乳动物尤其是山羊皮毛着色产生影响目前尚未见相关文献报道。酉州乌羊是我国珍贵的地方特色遗传资源，该羊全身皮肤及可视粘膜均为乌色，其乌皮表型被认为是一类罕见的纤维色素增生现象。
本研究首先检测AGRP基因在乌皮与非乌色山羊皮肤中的表达模式及其在酉州乌羊不同组织中的表达情况；其次，在体外条件下分析不同浓度外源性AGRP蛋白对黑色素细胞的黑色素含量、细胞cAMP活性与黑色素生成相关基因(MC1R、TYR、TYRP1、DCT等)表达的影响，以及添加α-MSH对AGRP的生黑素挽救作用效果的影响，进一步从细胞水平上解析AGRP对黑色素生成的作用和机制。本研究将为深入揭示AGRP对酉州乌羊皮肤黑色素沉积的作用机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 样品采集、RNA提取及反转录在重庆市酉阳县酉州乌羊保种场分别采集3只成年酉州乌羊的大脑、下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、腿肌、皮肤、睾丸组织以及3只成年板角山羊的皮肤组织，迅速装入冻存管中，放入液氮中暂时保存，带回实验室-80 ℃冰箱长期保存。组织和细胞RNA提取按照TRIzol(Invitrogen, 美国)操作手册进行，利用Nano Drop 2000超微量分光光度计测定各组织RNA浓度和纯度，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，将28S和18S条带的亮度比例为2∶1的总RNA参考Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, 德国)说明书反转录成cDNA，保存至-20 ℃冰箱备用。
1.2 引物设计以山羊MC1R、TYR、TYRP1和DCT基因的mRNA序列为模板设计引物(表 1)，引物由上海生工生物技术公司合成。
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表 1 引物序列 Table 1 Primers seuqence |
利用Universal SYBR Green Master(Roche, 德国)试剂盒对基因进行实时定量PCR扩增。反应体系：模板cDNA 1 μL，正、反向引物各0.2 μL，预混液5 μL，双蒸水3.6 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个样品做3次重复。基因定量采用2-ΔΔCt法计算其相对表达丰度。
1.4 细胞培养黑色素细胞迅速放入37 ℃水浴锅解冻，DMEM +10%胎牛血清(Gibco, 美国)重悬细胞后接种到培养瓶，放入37 ℃的5% CO2培养箱中培养。当黑色素细胞密度达80%~90%进行传代培养。
1.5 添加外源性AGRP和α-MSH蛋白处理黑色素细胞收集对数期生长的黑色素细胞，调整细胞悬液以2×104个·孔-1加入96孔板并以5×105个·孔-1加入6孔板，贴壁培养6 h。然后用添加不同浓度外源性AGRP (Apexbio, 上海)和AGRP +α-MSH (Apexbio, 上海)蛋白培养黑色素细胞48 h，设置空白对照组(以完全培养基代替)，每个浓度和空白组均设3个重复。
1.6 NaOH溶解法检测细胞黑色素含量利用NaOH溶解法对不同处理细胞中黑色素含量进行测定。细胞培养24 h后吸去培养液，用0.25%胰蛋白酶消化，以1 000 r·min-1离心5 min弃上清液，每个处理因素下的细胞加入200 μL含10% 二甲基亚砜(DMSO)的NaOH (1 mol · L-1) 溶液，65 ℃金属浴1 h，完全溶解黑色素颗粒，酶标仪(GENE, 台湾)检测490 nm处吸光度值。
1.7 EdU法检测黑色素细胞增殖按照Cell-light EDU Apollo 567 InVitro Kit(锐博, 广州)操作手册将黑色素细胞按照5×105个·孔-1铺在6孔板中盖玻片上，添加不同浓度外源性AGRP和AGRP +α-MSH蛋白培养黑色素细胞24 h，添加20 μmol · L-1 EdU培养基孵育2 h，PBS清洗1~2次；每孔加入50 μL细胞固定液室温孵育30 min，弃固定液；每孔加入50 μL 2 mg· mL-1甘氨酸，脱色摇床孵育5 min后，弃甘氨酸溶液；每孔加入100 μL PBS，脱色摇床清洗5 min，吸弃PBS；每孔加入0.5% TritonX-100脱色摇床孵育10 min；PBS清洗后进行DNA染色，最后使用抗荧光淬灭封片剂封片，奥林巴斯IX73荧光显微镜拍照，用ImageJ处理细胞图片。
1.8 细胞cAMP活性检测按照Parameter Camp (bio-techne, 中国)试剂盒操作手册检测细胞cAMP活性。
1.9 统计方法数据应用Spss Statistics 20.0软件t-test检验和单因素方差分析方法(ANOVA)进行分析。P < 0.05表示差异显著，具有统计学意义。用软件GraphPad Prism8绘制数据图。
2 结果 2.1 AGRP基因在山羊组织的表达特性分析实时荧光定量结果如图 1所示，AGRP基因在酉州乌羊各组织均有表达，以垂体为对照，AGRP基因在垂体中呈高表达水平，与其他组织相比差异显著(P < 0.05)；在瘤胃、肝、脾、肺、肾和肺等内脏组织中呈低表达水平(P < 0.05)。同时，板角山羊与酉州乌羊皮肤中AGRP表达量差异显著(P < 0.05)。
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相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P < 0.05)，下同 The same letter indicate no significant difference (P>0.05), different letters indicate significant differences(P < 0.05), the same as below 图 1 AGRP在不同组织表达分析 Fig. 1 Expression analysis of AGRP in different tissues |
结果如图 2A所示，添加不同浓度AGRP蛋白对黑色素细胞黑色素生成影响不显著(P>0.05)；如图 2B所示，随着AGRP浓度的升高，黑色素生成通路中cAMP活性显著下降(P < 0.05)，表明AGRP可抑制cAMP活性；此外，如图 2C和图 3所示，随着AGRP浓度升高，黑色素生成和黑色素细胞增殖呈下降趋势，但差异不显著(P>0.05)。
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图 2 不同浓度AGRP对黑色素细胞功能影响 Fig. 2 The effect of different concentrations of AGRP on the function of melanocytes |
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自上而下AGRP浓度依次升高。标尺=50 μm From above to below, the concentration of AGRP increase in sequence. Bar=50 μm 图 3 EdU检测不同浓度AGRP处理后黑色素细胞增殖情况 Fig. 3 EdU detects the proliferation of melanocytes after treatment with different concentrations of AGRP |
不同浓度AGRP对黑色素生成相关基因表达的影响结果如图 4所示，随着AGRP给药浓度升高，MC1R基因表达呈浓度依赖性降低，200和500 nmol·L-1 AGRP可显著抑制MC1R基因表达(P < 0.05)，表明大于200 nmol·L-1浓度AGRP可显著抑制MC1R基因表达；随着AGRP给药浓度升高，除200 nmol·L-1 AGRP处理组TYR表达显著升高(P < 0.05)，其余各处理组差异不显著(P>0.05)；TYRP1基因表达呈浓度依赖性升高，200和500 nmol·L-1 AGRP可显著促进TYRP1基因表达(P < 0.05)；此外，AGRP不同给药浓度可影响DCT基因表达，但是与对照组相比，差异均不显著(P>0.05)。
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图 4 不同浓度AGRP对黑色素生成相关基因表达的影响 Fig. 4 Effects of different concentrations of AGRP on the expression of melanin-related genes |
不同浓度α-MSH挽救AGRP给药对黑色素细胞生物学功能的影响如图 5所示，添加不同浓度α-MSH蛋白均可挽救200 nmol·L-1 AGRP对黑色素生成影响(图 5A)，不同浓度α-MSH均可呈浓度依赖性显著提高黑色素生成(P < 0.05)；随着α-MSH浓度的升高，黑色素生成通路中cAMP活性显著升高(P < 0.05)(图 5B)，表明α-MSH可显著提高cAMP活性，从而挽救AGRP对黑色素细胞cAMP活性的抑制作用；检测不同浓度α-MSH对黑色素细胞增殖的影响，结果如图 5C和图 6所示，随着α-MSH浓度增加，黑色素细胞增殖显著下降(P < 0.05)，以上结果表明α-MSH可显著抑制黑色素细胞增殖并促进细胞分化。
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图 5 不同浓度α-MSH挽救AGRP处理对黑色素细胞功能影响 Fig. 5 The different concentrations of α-MSH rescued the effects of AGRP treatment on the function of melanocytes |
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图 6 EdU检测AGRP和不同浓度α-MSH处理后黑色素细胞增殖情况(标尺=50 μm) Fig. 6 EdU detects the proliferation of melanocytes after treatment with AGRP and different concentrations of α-MSH (Bar=50 μm) |
不同浓度α-MSH挽救AGRP给药对黑色素生成相关基因影响结果如图 7所示，随着α-MSH浓度升高，MC1R表达水平呈浓度依赖性降低，500 nmol·L-1 AGRP可显著抑制MC1R基因表达(P < 0.05)，其余各组与对照组相比差异均不显著(P>0.05)，表明不同浓度α-MSH均可部分挽救200 nmol·L-1 AGRR对MC1R基因的抑制作用；此外，不同浓度α-MSH均可呈浓度依赖性显著提高TYR、TYRP1、DCT基因的表达(P < 0.05)。以上结果显示，α-MSH可显著改善200 nmol·L-1 AGRP对黑色素生成相关基因(TYR、TYRP1、DCT)表达的影响，表明添加不同浓度外源性α-MSH均可显著(P < 0.05)挽救AGRP对黑色素细胞功能的影响。
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图 7 AGRP和不同浓度α-MSH对黑色素生成相关基因表达的影响 Fig. 7 Effects of AGRP and different concentrations of α-MSH on the expression of melanin-related genes |
AGRP与ASIP是同源的旁分泌信号分子，它们分别通过拮抗黑皮质素受体的信号传导来调节皮肤/毛皮色素沉着、体重和肥胖[12-14]。ASIP能拮抗α-MSH对MC3R和MC4R的刺激作用，从而调控食欲和体重[15]。AGRP作为同一家族基因，MC4R表达的抑制可引起AGRP基因表达升高，从而刺激采食，抑制能量分解代谢，进而促进脂肪沉积[11, 16]。AGRP不同基因型与黑色素表型密切相关，AGRP基因能取代或协同ASIP基因，影响α-MSH与MC1R的结合[9]。ASIP基因是最重要的黑色素调控基因之一[17-18]。在皮肤中ASIP蛋白拮抗α-MSH对MC1R的刺激作用，从而调控真/伪黑色素的生物合成，决定真黑色素与伪黑色素合成的数量与比率。ASIP基因在深色被毛山羊个体中表达量低于白色被毛个体[19-20]，人类皮肤颜色也表现相似的特征[21-23]。在鸟类AGRP基因的表达上调，促进羽毛黑色素细胞中黑色素的合成，导致羽毛颜色变暗[24]。AGRP同样被报道与鸭皮肤毛囊[6]，鸡的骨膜色、皮肤颜色有关[25]。此外，AGRP与河豚背、腹侧皮肤[26]及鲈鱼皮肤[27]的色素调节相关。本研究探究了酉州乌羊乌色皮肤AGRP的表达模式，AGRP基因在白皮表型中的表达量显著高于乌皮表型酉州乌羊。与课题组之前研究确定的ASIP基因在白皮表型中的表达量显著高于乌皮表型酉州乌羊结果相似[28]。AGRP在皮肤组织中的表达暗示AGRP基因很可能与山羊皮肤色素调节功能有关。下丘脑作为机体能量代谢的调节中枢，调控AGRP和阿黑皮素原(proopiomelanocortin，POMC)的表达水平，从而调节能量的摄入和消耗，维持机体能量代谢的稳态，本研究发现，酉州乌羊下丘脑-垂体轴中AGRP基因高表达，这与之前梁正翠等[6, 29]的研究结果一致。说明基因可能在通过下丘脑释放垂体细胞分泌的激素黑色素细胞刺激素，控制黑色素细胞，促进黑色素合成过程中发挥功能。研究证实，肥胖和AGRP神经元过度活跃之间存在相关性[30]，山羊中普遍存在较低生长性能和产肉性能的个体，AGRP基因在肌肉中有表达，这种相对一致的表达量引起与能量代谢有关的差异，这可能与表达量的阈值大小有关，仅表达量达到一定限度时才会引起肥胖等。AGRP基因在酉州乌羊各组织均广泛表达，这种组织间表达特异性说明哺乳动物AGRP基因表达并不仅限于皮肤组织，它的表达部位与不同物(品)种、不同表型密切相关，暗示AGRP基因在在色素沉积过程中发挥重要作用。但AGRP基因表达调控的机制仍需进一步研究。研究结果表明，AGRP与ASIP为高度同源基因，往往表现出相同组织和时空特异性。
黑色素生成是一个复杂的过程，多个基因和信号途径调控黑色素合成并运输到角质细胞的过程。DNA甲基化调节黑色素生成中主要基因的表达，包括TYR、TYRP1、DCT以及黑色素生成过程中旁分泌因子等。当α-MSH与黑色素细胞膜上的MC1R结合时，可激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)，AC催化ATP转变为cAMP，cAMP水平的升高会进一步激活TYR，继而催化黑色素的形成[31]。AGRP与ASIP高度同源，在功能和结构上均与ASIP有相似之处，抑制cAMP的活性和α-MSH的作用。ASIP基因在色素调节和能量平衡以及AGRP能量调节上的作用已得到证实，但关于AGRP对色素调节的作用尚不清楚[6]。研究发现，AGRP通常仅与MC3R和MC4R受体相互作用，而不与皮肤MC1R相互作用[32]。AGRP是否与α-MSH竞争性结合细胞膜上的MC1R受体，进而调节cAMP活性影响黑色素生成？用AGRP处理黑色素细胞抑制cAMP的活性和MC1R表达，通过添加不同浓度α-MSH后挽救AGRP对黑色素细胞cAMP的活性和MC1R表达的影响。α-MSH可以激活黑色素细胞中cAMP活性，促进TYR、TYRP1、DCT等色素相关基因的表达，进而影响黑色素生成。AGRP显著抑制cAMP的活性和MC1R表达，之前文献报道MC1R活性可被AGRP显著抑制[28]，这与本研究结果相一致，表明AGRP可能直接或间接抑制MC1R基因表达，但具体的机制仍不清晰。体外试验分析外源性AGRP和α-MSH蛋白对山羊皮肤黑色素细胞功能的影响，进一步阐明了AGRP对黑色素生成的作用机制，暗示AGRP与ASIP高度同源基因可能会在调控黑色素生成方面均起重要作用。但是AGRP基因是否与ASIP基因一样，在色素调节和能量代谢方面发挥作用，或者AGRP在皮肤中可能可以通过部分代替ASIP起到调控肤色的作用，这些仍需要进一步研究。本研究不仅为深入揭示AGRP对酉州乌羊皮肤黑色素沉积的作用机制奠定基础，还以AGRP为纽带建立起了色素沉积与能量代谢之间的互作路径，为下一步深入研究黑色素生成和能量代谢之间的联系提供理论依据。
4 结论体内试验结果表明，AGRP在酉州乌羊各组织广泛表达，其中在垂体中表达最高；AGRP在板角山羊皮肤中的表达量显著高于酉州乌羊。体外试验表明，添加外源性AGRP可抑制黑色素细胞cAMP活性和MC1R基因表达，添加不同浓度α-MSH均可挽救AGRP对黑色素细胞生物学功能的影响。本研究不仅可为酉州乌羊皮肤黑色素沉积的作用机制提供理论依据，也对人类色素疾病的研究和治疗有重要参考价值。
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(编辑 郭云雁)