2. 渭南市动物疫病预防控制中心, 渭南 714000;
3. 渭南市动物卫生工作站, 渭南 714000;
4. 渭南市农产品质量安全检验检测中心, 渭南 714000;
5. 渭南市农业技术推广中心, 渭南 714000;
6. 黄骅市农业农村局, 黄骅 061100;
7. 天津市农业科学院畜牧兽医研究所, 天津 300112;
8. 杨凌职业技术学院, 杨凌 712100
, WEI Wei2, PEI Dangshuai3, ZHANG Fenque4, DUAN Yu5, GUO Yongfeng6, JIANG Yue1, XIA Shuli7, HAN Jing7, HOU Jinxing8, AN Xiaopeng1
2. Weinan Animal Disease Prevention and Control Center, Weinan 714000, China;
3. Weinan Animal Health Workstation, Weinan 714000, China;
4. Weinan Agricultural Product Quality and Safety Inspection and Testing Center, Weinan 714000, China;
5. Weinan Agricultural Technology Promotion Center, Weinan 714000, China;
6. Huanghua Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Huanghua 061100, China;
7. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Tianjin Academy of Agriculture Sciences, Tianjin 300112, China;
8. Yangling Vocational Technical College, Yangling 712100, China
羊奶营养价值丰富，营养比例与人母乳相近，富含人体所需的乳糖、脂肪、蛋白质、微量元素及功能性营养素[1-4]。羊奶中酪蛋白占所有蛋白质的近80%，富含A2型β-酪蛋白，不仅有丰富的必需氨基酸(如亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸等)为人体提供营养，而且拥有更低的免疫原性[5-6]，不会刺激HMC-1细胞释放组胺和TNF-α，可以作为牛奶蛋白的优质替代品[7-9]。而除了羊奶蛋白的营养价值外，羊奶也比牛奶含有更多中链甘油三酯和更小的脂肪颗粒[10]。研究表明，这些脂质使羊奶更好消化[11-12]，并且有促进大脑发育和提高人体免疫力的潜力[13-15]。因此，如何调控提高羊奶产量及羊奶成分逐渐成为研究热点。
乳汁由哺乳动物的乳腺上皮细胞合成，因此，乳腺的泌乳能力很大程度上取决于有功能的乳腺上皮细胞的数量和效率。乳腺上皮细胞的增殖和凋亡受到多个重要功能基因的共同调控。PDCD4是一种肿瘤抑制基因，1995年在小鼠体内被发现，在调控细胞周期与细胞凋亡过程中发挥着重要作用[16-17]，PDCD4通过与真核翻译起始因子eIF4A结合抑制RNA解旋酶活性，从而阻碍mRNA甲基化脱帽过程和蛋白质翻译，进而促进细胞凋亡[18-19]。Li等[20]报道，SKP2通过抑制乳腺癌中PDCD4表达促进细胞增殖、抑制细胞凋亡并增强对DNA损伤的反应。以上研究均表明，PDCD4抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。此外还有研究表明，在脂多糖刺激的巨噬细胞中，miR-21可以靶向PDCD4通过TLR4和NF-κB通路调节脂质积聚[21]。然而，该基因在乳腺发育及泌乳方面的作用研究较少。
本课题组前期研究表明，miR-21-5p在奶山羊泌乳前期及泌乳高峰期差异表达，生物信息学网站预测到PDCD4为miR-21-5p的潜在靶基因，因此本研究干扰PDCD4及构建PDCD4过表达载体后检测了其对于乳腺上皮细胞增殖、凋亡及PI3K/mTOR/S6K和ERK/Bcl-2/Bax信号通路相关基因表达的影响，为进一步阐释PDCD4调控奶山羊乳腺发育及泌乳的分子机理提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 样品采集 本试验所用奶山羊来自西北农林科技大学北校区附近关中奶山羊养殖场，乳腺组织采集自1只2岁龄的健康泌乳母羊，将乳腺组织用生理盐水冲洗3次，置于含有双抗的PBS溶液中迅速带回细胞间，尽量去除脂肪组织、结缔组织后，将乳腺组织块剪成1 mm3大小，用组织块培养法培养乳腺上皮细胞(GMECs)。
1.1.2 主要试剂 反转录试剂盒、荧光定量试剂盒、pMD19-T Vector、RNAiso Plus均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒、DH5α感受态细胞均购自天根生化科技有限公司；氨苄青霉素溶液AMP购自Solarbio公司。Opti-MEMⅠ、胰蛋白酶、胎牛血清、双抗(青霉素，链霉素)、DMEM/F12培养基、DPBS和谷氨酰胺均为Gibco产品。
1.2 方法1.2.1 乳腺上皮细胞培养及转染 乳腺上皮细胞在培养液中培养，配方为DMEM培养基，10%的胎牛血清，5 mg·mL-1胰岛素，100 U·mL-1链霉素和100 U·mL-1青霉素。环境条件为37 ℃，5% CO2。在细胞培养至70%~80%时进行转染，将miR-21-5p mimics、NC、miR-21-5p inhibitors、inhibitor NC(上海吉玛)转染进乳腺上皮细胞，细胞培养箱中培养24 h后进行后续试验。
1.2.2 双荧光素酶活性检测试验 扩增得到包含miR-21-5p结合位点的PDCD4基因序列(引物序列为F: CACTCGAGTGAGGGTGTAAAGGAGGGACA；R: ATGCGGCCGCAACAGCAGCAGCCAACATGG，引物由生工生物工程公司合成)，将扩增片段插入psiCHECK-2载体的XhoⅠ和NotⅠ两个酶切位点之间，构建野生型PDCD4载体(psiCHECK-2+PDCD4-WT)，并使用突变试剂盒构建突变型载体(psiCHECK-2+PDCD4-MU)。将psiCHECK-2+PDCD4-WT或(psiCHECK-2+PDCD4-MU)质粒分别用miR-21-5p模拟物或抑制剂共转染到GMECs中。继续培养24 h，用双荧光荧光素酶系统(Promega，美国)检测结果。每个试验进行3次重复。
1.2.3 PDCD4过表达载体构建及干扰小RNA合成 根据NCBI中山羊PDCD4序列(XM_018041277.1)，设计PDCD4 CDS区特异性引物(F: CTTAAGCTTATGGATGTAGAAAATGAGCAGATACTG；R: AGACTCGAGTCAGTAGCT-CTCTGGTTTAAGACG，引物由生工生物工程公司合成)，扩增CDS区全长，并插入到pcDNA3.1载体中，得到PDCD4过表达载体。干扰小RNA由吉玛公司合成，si-PDCD4序列为F: GCGGAAAUGCUAAGAGAUUTT; R: AAUCUCUUAGCAUUUCCGCTT。
1.2.4 RT-qPCR TRIzol方法提取乳腺上皮细胞总RNA，使用反转录试剂盒(TaKaRa)反转录得到cDNA，通过Primer 5.0设计定量引物，以β-actin为内参进行实时定量试验，实时定量引物见表 1。
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表 1 实时定量PCR引物序列 Table 1 Primers sequence for RT-qPCR |
1.2.5 Western blot 转染48 h后，向细胞中加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液(Biotek，北京，中国)，裂解30 min后，离心10 min后取上清即为总蛋白，然后加入蛋白上样缓冲液，98 ℃加热10 min得到蛋白上样液。取30 μg上样至SDS-PAGE蛋白胶孔中进行电泳，然后将蛋白转移到PVDF膜上，分别孵育一抗和二抗。使用β-actin作为内参，并使用ECL发光液使蛋白条带成像。每个指标的Western blot试验重复3次以得到可信结果。
1.2.6 细胞活力及增殖检测 采用CCK-8法检测GMECs细胞活力，将GMECs均匀地铺在96孔板中，每个试验组设置3个重复，转染24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中孵育4 h，检测450 nm处的吸光度值。
采用EdU试验检测GMECs增殖情况，将GMECs均匀铺在96孔板中，每个试验组设置3个重复，转染24 h后按照购买的BeyoClick EdU-488细胞增殖检测试剂盒(碧云天，上海)说明书进行EdU检测。
1.2.7 细胞凋亡检测 转染24 h后，用胰酶消化收集细胞，然后用PBS缓冲液清洗以去除细胞沉淀中的EDTA，然后按照凋亡检测试剂盒(七海复泰生物科技有限公司，上海)中的说明书进行操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.2.8 ELISA检测 本试验采用ELISA酶联免疫吸附试验测定乳腺上皮细胞中β-酪蛋白、甘油三酯(TG)的含量。测定方法参照试剂盒提供的说明书进行，转染24 h后，收集细胞培养液于2 mL离心管，12 000 r·min-1离心20 min，吸取上清液为待测样品。使用前将板条室温平衡20 min，标准孔中加入不同浓度的标准品50 μL，待测样品孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL，每个样品孔设置3个重复。之后按照说明书分别加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体、底物A、底物B、终止液，然后在450 nm波长处测定各孔的吸光度值。
1.2.9 数据统计学分析 利用SPSS 25.0分析试验数据，并通过T检验和单向方差分析方法分析数据的差异显著性，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
2 结果 2.1 PDCD4与miR-21-5P靶向关系验证通过生物信息学软件及miRNA种子序列与靶基因反向互补配对原则，预测出miR-21-5p靶基因PDCD4，如图 1A所示构建野生型PDCD4载体(psiCHECK-2+PDCD4-WT)及突变型载体(psiCHECK-2+PDCD4-MT)。将miR-21-5p mimics、NC、miR-21-5p inhibitor、inhibitor NC分别与psiCHECK-2+PDCD4-WT和psiCHECK-2+PDCD4-MT共转染到GMECs中，检测荧光素酶活性。结果如图 1B所示，miR-21-5p mimics能显著下调野生型PDCD4载体的双荧光素酶活性，对突变型载体无显著影响。初步验证PDCD4为miR-21-5p的靶基因。
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A.野生型载体与突变型载体设计图。其中红色为miR-21-5p与PDCD4的结合位点，蓝色为该位点突变后的序列。B.双荧光素酶活性检测结果。C.转染miR-21-5p mimics、NC、miR-21-5p inhibitor、NCH后，RT-qPCR检测PDCD4 mRNA表达情况。D.转染miR-21-5p mimics、NC、miR-21-5p inhibitor、NCH后，Western blot检测PDCD4蛋白表达情况(*.P < 0.05；**.P < 0.01，下同) A. Design drawing of wild-type vector and mutant vector. The red nucleotide sequence is the original binding site sequence of PDCD4 and miR-21-5p, and the blue one is the mutation nucleotide sequence of the original binding site of PDCD4 and miR-21-5p. B. The results of double luciferase activity test. C. RT-qPCR detection of PDCD4 mRNA expression after transfection with miR-21-5p mimics, NC, miR-21-5p inhibitor and NCH. D. After transfection of miR-21-5p mimics, NC, miR-21-5p inhibitor and NCH, Western blot detected PDCD4 protein expression(*.P < 0.05;**.P < 0.01, the same as below) 图 1 miR-21-5p对靶基因PDCD4的调控 Fig. 1 miR-21-5p regulated the target gene PDCD4 |
为了进一步验证miR-21-5p对PDCD4的调控作用，将miR-21-5p mimics、NC、miR-21-5p inhibitor、inhibitor NC转染进乳腺上皮细胞中，通过RT-qPCR和Western blot检测PDCD4的mRNA和蛋白表达水平。结果如图 1C、D所示，转染miR-21-5p mimics后，PDCD4在乳腺上皮细胞中mRNA和蛋白表达水平均显著降低。
2.2 PDCD4干扰和过表达载体的构建为了研究miR-21-5p通过靶基因PDCD4对乳腺上皮细胞调控的机理，构建了pc3.1-PDCD4过表达载体，并采用siRNA技术对miR-21-5p的靶基因PDCD4进行干扰，合成PDCD4的siRNA，即si-PDCD4，分别将NC、si-PDCD4、pc3.1、pc3.1-PDCD4转染进乳腺上皮细胞，通过RT-qPCR和Western blot方法检测PDCD4 mRNA及蛋白表达水平。结果表明，干扰PDCD4可以显著抑制PDCD4基因的mRNA及蛋白水平(P＜0.01)(图 2A、C)，而过表达的PDCD4可以显著提高PDCD4的mRNA及蛋白水平(P＜0.01) (图 2B、D)。
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A.干扰后PDCD4 mRNA表达量；B.过表达后PDCD4 mRNA表达量；C.干扰后PDCD4蛋白表达量；D.过表达后PDCD4蛋白表达量 A. PDCD4 mRNA expression after interference; B. PDCD4 mRNA expression after over-expression; C.PDCD4 protein expression after interference; D. PDCD4 protein expression after over-expression 图 2 PDCD4过表达及干扰效率检测 Fig. 2 Detection of PDCD4 over-expression and interference efficiency |
为了研究PDCD4是否对奶山羊乳腺上皮细胞的增殖有影响，将NC、si-PDCD4、pc3.1、pc3.1-PDCD4转染进乳腺上皮细胞中，通过CCK-8和EdU法检测乳腺上皮细胞增殖的变化情况。CCK-8结果如图 3A、B所示，与pc3.1相比，pc3.1-PDCD4组极显著的降低了细胞活力(P＜0.01); 与NC组相比，si-PDCD4组显著增加了细胞活力(P＜0.01)。EdU结果显示，与pc3.1相比，pc3.1-PDCD4组极显著的抑制了细胞增殖(图 3C、D，P＜0.01)；与NC组相比，si-PDCD4组显著促进了细胞增殖(图 3E、F，P＜0.01), 与CCK-8检测结果一致。
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A.过表达PDCD4后，CCK-8法检测细胞活力；B.干扰PDCD4后，CCK-8检测细胞活力；C.过表达PDCD4后，EdU试验检测细胞增殖情况；D.EdU结果柱状图；E干扰PDCD4后，EdU试验检测细胞增殖情况；F.EdU结果柱状图 A. After overexpression of PDCD4, the cell viability was detected by CCK-8 method; B. After interfering with PDCD4, CCK-8 detected the cell viability; C. After overexpression of PDCD4, the cell proliferation was detected by EdU test; D. Histogram of EdU results; E. After interfering with PDCD4, EdU assay was used to detect cell proliferation; F. EdU result histogram 图 3 PDCD4对GMECs增殖的影响 Fig. 3 Effects of PDCD4 on proliferation of GMECs |
为了研究PDCD4对奶山羊乳腺上皮细胞凋亡的影响，分别将NC、si-PDCD4、pc3.1、pc3.1-PDCD4转染乳腺上皮细胞，采用流式细胞术检测PDCD4基因对乳腺上皮细胞凋亡的影响。结果如图 4显示，与对照组相比，过表达PDCD4后GMECs凋亡水平显著升高(图 4A、B，P＜0.01)，而干扰DPCD4后凋亡水平则显著降低(图 4C、D，P＜0.01)。
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Q1.坏死细胞；Q2.晚期凋亡细胞；Q3.早期凋亡细胞；Q4.正常活细胞 Q1. Dead cells; Q2. Late stage apoptotic cells; Q3. Early apoptotic cells; Q4. Normal living cell 图 4 PDCD4对GMECs凋亡的影响 Fig. 4 Effects of PDCD4 on apoptosis of GMECs |
将NC、si-PDCD4、pc3.1、pc3.1-PDCD4转染进乳腺上皮细胞中，通过ELISA法检测乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的合成情况。如图 5A、C所示，结果表明，抑制PDCD4后β-酪蛋白的浓度显著升高(P＜0.01)，而过表达PDCD4后，乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的浓度显著降低(P＜0.01)。
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图 5 PDCD4对β-酪蛋白和TG合成的影响 Fig. 5 Effects of PDCD4 on synthesis of β-casein and TG |
将NC、si-PDCD4、pc3.1、pc3.1-PDCD4转染进乳腺上皮细胞中，通过ELISA法检测乳腺上皮细胞中TG的合成情况。如图 5B、D所示，结果表明，过表达PDCD4后，乳腺上皮细胞中TG的浓度显著降低(P＜0.01)，而抑制PDCD4后TG的浓度显著升高(P＜0.01)。
2.6 PDCD4对PI3K/mTOR/S6K和ERK/Bcl-2/Bax信号通路的影响将NC、si-PDCD4、pc3.1、pc3.1-PDCD4转染进乳腺上皮细胞中，通过Western blot检测PI3K/mTOR/S6K和ERK/Bcl-2/Bax信号通路相关蛋白的表达水平。如图 6所示，结果表明，过表达PDCD4能显著下调p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K、p-ERK/ERK、Bcl-2/β-actin的表达水平、上调Bax/β-actin表达水平(P＜0.05)，而抑制PDCD4表达能显著上调p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K、p-ERK/ERK、Bcl-2/β-actin的表达水平，下调Bax/β-actin表达水平(P＜0.05)。
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A.过表达PDCD4对PI3K/mTOR/S6K和ERK/Bax/Bcl-2信号通路的影响；B.干扰PDCD4对PI3K/mTOR/S6K和ERK/Bax/Bcl-2信号通路的影响 A. The effect of over-expression of PDCD4 on the PI3K/mTOR/S6K and ERK/Bax/Bcl-2 signaling pathways; B. The effect of interfering with PDCD4 on the PI3K/mTOR/S6K and ERK/Bax/Bcl-2 signaling pathways 图 6 PDCD4调控PI3K/mTOR/S6K和ERK/Bax/Bcl-2信号通路 Fig. 6 PDCD4 regulated PI3K/mTOR/S6K and ERK/Bax/Bcl-2 signaling pathways |
奶山羊乳腺是可重复性生长、功能性分化、退化的外分泌器官，主要功能在于泌乳。乳腺上皮细胞的增殖凋亡受到多种基因的共同调控。Shibahara等[22]从小鼠cDNA文库中扩增出PDCD4, 经研究发现PDCD4广泛存在于各种凋亡细胞中，后又被发现在心脏组织中低表达[23]。PDCD4被认为是一种新型的抑癌因子，具有抑制细胞生长、肿瘤侵袭、转移和诱导细胞凋亡的多种功能[24-27]。研究表明，在人和鼠心肌细胞、人骨肉瘤细胞、糖氧剥夺细胞模型中miR-21均靶向PDCD4从而调控细胞凋亡[28-31]。最近一项研究表明，在多囊卵巢综合征模型中CiRS-126靶向miR-21-PDCD4-ROS轴抑制卵巢颗粒细胞的增殖[32]，目前还尚未见有关于miR-21靶向PDCD4调控奶山羊乳腺上皮细胞凋亡以及泌乳的相关报道。本研究首先通过双荧光素酶活性检测初步确定了PDCD4和miR-21-5p的靶向关系，后又通过RT-qPCR和Western blot试验证明miR-21确实可以负调控奶山羊乳腺上皮细胞中PDCD4 mRNA及蛋白水平的表达。
ERK-Bax/Bcl-2是细胞凋亡相关信号通路，其中Bax发挥促凋亡作用，Bcl-2则起到抗凋亡的作用，二者的表达量决定着对细胞凋亡抑制程度的强弱，当Bcl-2蛋白含量高于Bax时细胞凋亡被抑制，反之则促进细胞的凋亡[33-34]。本研究在GMECs中探究PDCD4是否调控ERK-Bax/Bcl-2信号通路，Western blot试验结果表明，过表达PDCD4后Bcl-2蛋白表达量显著下调，Bax蛋白则显著上升，si-PDCD4处理后结果与过表达相反。上述结果表明，过表达PDCD4时促进了奶山羊乳腺上皮细胞的凋亡，这与流式细胞分选试验检测结果相符，而miR-21则可以负调控PDCD4从而部分减轻细胞的凋亡。
已有研究表明，S6K、AKT参与调控PDCD4的磷酸化，从而调控蛋白质翻译和细胞生长[35]，PDCD4蛋白通过EGF激活PI3K-Akt-mTOR-S6k1信号通路磷酸化，并在蛋白酶体系统中被降解[36]。在糖尿病心肌病大鼠模型中miR-21-PDCD4已经被证明可以激活PI3K/mTOR/S6K信号通路[37]，Samant和Sylvester[38]研究表明，β-酪蛋白和TG的合成受到PI3K/mTOR/S6K信号通路的调控，先前的研究也在GMECs中证明了这一点[39-40]。本研究继续探究PDCD4对PI3K/mTOR/S6K信号通路的调控作用，结果表明干扰PDCD4能显著上调PI3K、mTOR、S6K的磷酸化水平，激活PI3K/mTOR/S6K信号通路，进而调控GMECs中TG和β-酪蛋白的分泌，同时ELISA试剂盒检测结果与Western blot结果一致，si-PDCD4可显著促进GMECs中TG和β-酪蛋白的分泌。
4 结论本研究证明了在奶山羊乳腺上皮细胞中PDCD4为miR-21的靶基因，且miR-21能够负调控PDCD4的表达，PDCD4通过激活ERK/Bcl-2/Bax信号通路促进奶山羊乳腺上皮细胞凋亡, si-PDCD4通过激活PI3K/mTOR/S6K信号通路促进GMECs中β-酪蛋白和TG的分泌。
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(编辑 郭云雁)