2. 广西桂垦牧业有限公司, 南宁 530022
, CAI Xiaodian1, LIN Qing1, ZHONG Zhanming1, YE Haoqiang1, WEI Chen1, XU Zhiting1, WU Xibo2, SI Jinglei2, ZHANG Zhe1, LI Jiaqi1
2. Guangxi Guiken Animal Husbandry Co. LTD., Nanning 530022, China
生长性状(如眼肌面积、背膘厚等)直接反映生产效率，是衡量猪场经济效益的重要指标之一[1]。一方面，部分生长性状测定成本较高，难以获得大量的表型数据；另一方面，生长性状多为数量性状，遗传结构较为复杂[2]，仅通过表型选育难以达到预期效果。故生产上常通过挖掘与生长性状相关的遗传标记，实现对该类性状的改良。
随着测序技术及基因组学技术的发展，将复杂表型与基因组遗传标记进行关联成为可能。全基因组关联分析(genome wide association study, GWAS)将基因组遗传标记，如单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，与复杂表型进行统计学检验，鉴定影响性状的遗传变异及候选基因[3-4]。随着测序成本的降低，在畜禽领域开展GWAS相关研究逐渐增多[5]。例如，石丽丹等[6]对大白猪乳头数性状进行GWAS分析，研究检测到多个与该性状显著相关的基因区间。胡斌等[7]基于藏猪芯片测序数据，对相应群体的出生重性状进行GWAS分析，确定相关候选基因，为后续针对该性状的选育奠定基础。然而，GWAS分析效果决定于标记解释表型变异的大小，而表型变异受等位基因效应大小和频率影响。所以，GWAS分析非常容易受到群体数量和标记数目的影响，导致无法检测出与性状显著相关的位点。特别地，对于受微效多基因控制的复杂生长性状，提升样本量以提高对微效多基因效应的检测是十分重要的[8]。当前畜禽领域因企业生产过程中成本和管理等问题，无法对大量个体进行基因分型，故而往往无法满足研究所需的样本量。
加权一步法GWAS(weighted single step GWAS, wssGWAS)能够有效利用无基因型个体信息，结合畜禽的遗传结构，能够有效提高分析效果[9]。该方法已经在畜禽相关领域中得到了应用，如Howard等[10]利用该方法定位了杜洛克猪平均日增重和日采食量相关的基因组区域；Zhang等[11]研究发现了杜洛克猪中与肌内脂肪相关且与背膘厚无关的SNP和基因。
本研究基于大白猪眼肌面积、估计瘦肉率和背膘厚的记录数据，利用wssGWAS方法定位与生长性状相关的候选基因组区域及候选基因，并通过GO功能和KEGG通路富集分析探究候选基因的生物学过程和功能。以期能够初步解析影响生长性状的遗传机制，为生长性状遗传改良提供一定的研究依据，以提升选育效果和经济效益。
1 材料与方法 1.1 数据来源及质控试验动物均来自2009年—2020年间，广西某公司核心育种场，共收集到21 754头大白猪的性能测定记录，包括：校正100 kg眼肌面积(loin muscle area(100 kg), LMA_100)、100 kg时估计瘦肉率(predicted lean meat percentage(100 kg), LEANCUTP_100)和校正100 kg背膘厚(average backfat thickness(100 kg), BFT_100)。以“平均值±3倍标准差”剔除表型记录的异常值，后对相关性状的表型值进行描述性统计，并对4个影响性状的因素(测定场、测定年份、测定季节和性别)进行方差分析，判断其是否作为固定效应纳入后续分析模型中，以上处理均使用R软件[12]进行操作。
该群体有基因型个体共1 259个，利用Illumina Porcine SNP 50k BeadChip芯片进行基因分型，后使用PLINK(v1.90b4.3)[13]对基因型数据进行质控，标准如下：删除个体基因型检出率 < 0.90的个体；删除基因型检出率 < 0.90、最小等位基因频率(minor allele frequency) < 0.01及哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)P值< 1×10-6的SNPs位点。经质控，最终有1 258个个体，42 584个SNPs用于后续分析。
1.2 遗传参数估计模型使用BLUPF90软件[14](AIREMLF90模块)计算LMA_100、LEANCUTP_100和BFT_100的遗传参数。该模块将期望最大化算法(expectation maximization)与平均信息算法(average information)[15]结合，其单性状混合线性模型如下：
| $ y=\boldsymbol{X} b+\boldsymbol{Z} a+e $ |
式中，y为各性状的观测值向量；b为固定效应向量，包含测定场、测定年份、测定季节、性别；a为个体加性遗传效应向量，
上式中，H矩阵[16]的逆矩阵构建公式如下：
| $ \boldsymbol{H}^{-1}=\boldsymbol{A}^{-1}+\left[\begin{array}{cc} 0 & 0 \\ 0 & \boldsymbol{G}_w^{-1}-\boldsymbol{A}_{22}^{-1} \end{array}\right] $ |
式中，A－1为分子亲缘关系矩阵的逆矩阵；
上式中，G矩阵的公式为：
| $ \boldsymbol{G}=\frac{\boldsymbol{Z D Z}^{\prime}}{\sum_{i=1}^N 2 p_i\left(1-p_i\right)} $ |
式中，Z为基因组亲缘关系矩阵的中心阵；D为SNP方差的权重矩阵；N为SNP的数目；pi为第i个SNP的最小等位基因频率。
1.3 加权一步法全基因组关联分析wssGWAS基于一步法基因组最佳无偏估计(single-step genomic best linear unbiased prediction)，通过构建亲缘关系矩阵和基因组关系矩阵的混合矩阵，计算出基因组估计育种值(genomic estimated breeding values, GEBVs)。随后基于标记效应模型和混合线性模型之间的联系，将GEBVs转化为标记效应[9]。本研究主要通过BLUPF90[14]软件的BLUPF90模块和postGSf90模块[19]进行计算。
SNP效应计算步骤如下：
1.设定初始迭代次数n=1，则D(n)= I，G(n)=λZD(n)Z′，
2.构建H矩阵，计算
3.计算SNP的效应，则
4.计算SNP的权重，用以下一次迭代，则
5.对SNP权重进行归一化，以保证总体的遗传方差不变，则
6.令n=n+1，重复上述步骤，即G(n+1)=λZD(n+1)Z′；
式中，I为单位矩阵，Z为基因组亲缘关系矩阵的中心阵；D为SNP方差的权重矩阵；N为SNP的数目；pi为第i个SNP的最小等位基因频率；A－1为分子亲缘关系矩阵的逆矩阵；
参照Wang等[21]和Marques等[22]的研究，本研究中LMA_100和LEANCUTP_100采用迭代2次的结果，BFT_100采用迭代3次的结果，并以0.4 Mb为滑动窗口[23]，通过以下公式计算出每个窗口的遗传方差：
| $ \frac{Var\left(a_i\right)}{\sigma_a^2} \times 100 \%=\frac{Var\left(\sum_{j=1}^M \boldsymbol{Z}_j g_j\right)}{\sigma_a^2} \times 100 \%, $ |
式中，ai为i个区域的遗传力；
根据Zhuang等[24]和Gao等[25]的研究，本研究以窗口解释遗传方差比例达1%为阈值线，确定候选数量性状基因座(quantitative trait locus, QTL)区域，并利用R语言biomaRt包对QTL进行基因注释。为进一步了解候选基因的生物学功能，使用DAVID(database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/)数据库[26-27]对候选基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。
2 结果 2.1 表型数据描述性统计表型数据的描述性统计如表 1所示，对表型数据进行质控后，LMA_100、LEANCUTP_100和BFT_100均值分别为35.80 cm2、54.15%和10.15 mm，其中LMA_100和BFT_100变异系数较大，LEANCUTP_100变异系数较小。
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表 1 3种性状的描述性统计和方差组分估计结果 Table 1 Descriptive statistics and variance component estimation results of 3 traits |
本研究依据BLUPF90的AIREMLF90算法模块，使用混合线性模型估计相关性状的遗传参数，结果如表 1所示。LMA_100遗传力为0.450 6±0.017 3，LEANCUTP_100遗传力为0.496 8±0.017 4，BFT_100遗传力为0.475 8±0.017 2，均为中高遗传力性状。同时，由表 2可知，LMA_100和LEANCUTP_100的遗传相关高达0.881 1±0.003 2，表型相关为0.598 3±0.005 4；LMA_100和BFT_100的遗传相关为-0.031 4±0.006 8，表型相关为0.041 8±0.006 0；LEANCUTP_100和BFT_100的遗传相关为-0.504 2±0.005 9，表型相关为-0.469 1±0.006 0。
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表 2 3种性状的表型相关和遗传相关 Table 2 Phenotypic correlation and genetic correlation of 3 traits |
本研究以0.4 Mb大小为滑动窗口，以解释遗传方差比例超过1%为阈值线，选择影响性状的关联窗口，结果如图 1所示。LMA_100在1、2、4、6、9、10、11、16、17、18号染色体上存在显著区域共10个，且这些区域共解释了15.074%的遗传变异，其中16号染色体上的区域解释了最高的3.333%的遗传变异(表 3)；LEANCUTP_100共有8个显著区域，分别存在于2、4、6、10、11、12、16、17号染色体上，最高的区域解释了6.335%的遗传变异且这些区域共解释了16.034%的遗传变异(表 3)；BFT_100在1、2、3、4、5、6、7、12、13、18号染色体上共定位到12个显著区域，最高的区域解释了2.808%的遗传变异且这些区域共解释了16.614%的遗传变异(表 3)。对以上区域进行注释，LMA_100相关的QTL区域共注释到36个基因，LEANCUTP_100相关的QTL区域共注释到29个基因，BFT_100相关的QTL区域共注释到41个基因。
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图 1 3种性状的曼哈顿图 Fig. 1 Manhattan map of 3 traits |
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表 3 3种性状显著的QTL区域和候选基因 Table 3 Significant QTL regions and candidate genes for 3 traits |
利用DAVID数据库对候选基因进行GO功能和KEGG通路富集分析，并以“P < 0.05”为筛选标准提取显著结果，得到的结果如表 4所示。其中，LMA_100性状主要涉及微管成核(GO: 0007020, P=0.024 89)、肽交联(GO: 0018149, P=0.033 63)、微管(GO: 0005874, P=0.003 00)、纺锤极(GO: 0000922, P=0.006 83)、蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶活性(GO: 0003810, P=0.013 46)、γ-微管蛋白结合(GO: 0043015, P=0.041 48)等GO功能。同时在KEGG通路上富集到了1项条目，主要与EB病毒(Epstein-Barr virus)(ssc05169, P=0.031 40)的感染有关。
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表 4 3种性状候选基因富集分析结果 Table 4 Enrichment analysis results of candidate genes for 3 traits |
LEANCUTP_100在GO功能富集分析未富集到显著的条目，在KEGG通路上富集到2项条目，其中一项与LMA_100相同(ssc05169, P=0.022 08)，另一项与丝裂原活化蛋白激酶信号通路(ssc04010, P=0.040 28)有关。
BFT_100在GO功能富集分析上，共富集到10个条目，主要包括，平滑信号通路(GO: 0007224, P=0.005 27)、巨噬细胞细胞因子的正调控(GO: 0060907, P=0.012 86)、NLRP3炎症小体复合物组装的正调控(GO: 1900227, P=0.012 86)、活性氧生物合成过程的正调控(GO: 1903428, P=0.016 50)、NF-kappaB转录因子活性的正调节(GO: 0051092, P=0.019 58)、轴心的组装(GO: 0035082, P=0.032 74)、toll-like受体信号通路(GO: 0002224, P=0.038 10)、游离钙离子释放到胞质溶胶的过程(GO: 0051209, P=0.041 65)、质膜的构成(GO: 0005887, P=0.049 77)、同种蛋白质结合(GO: 0042802, P=0.009 14)等。除此之外，在KEGG通路上富集到1项条目(ssc04066, P=0.016 06)，主要与HIF-1信号通路有关。
3 讨论 3.1 大白猪生长性状遗传力估计本研究中，大白猪LMA_100的遗传力为0.450 6± 0.017 3，属于中高遗传力。在张广杰[28]的研究中，大白猪LMA_100的遗传力为0.269±0.072。黄叶[29]估计大白猪LMA_100的遗传力为0.297±0.073，两者均低于本研究的结果。本研究所得LEANCUTP_100的遗传力为0.496 8±0.017 4，属于中高遗传力。在黄叶[29]的研究中，大白猪LEANCUTP_100的遗传力为0.412±0.078，与本研究相近。本研究所得BFT_100的遗传力为0.475 8±0.017 2，属于中高遗传力，与贺婕妤等[30]的研究结果(遗传力为0.408±0.084)相近。
3.2 大白猪生长性状加权一步法全基因组关联分析wssGWAS可以有效利用没有基因型数据的个体，大大增加算法分析的数据量，相比较于仅使用基因型数据，更容易发现潜在的与性状关联的QTL区域[9]。本研究利用wssGWAS定位到大白猪10个与LMA_100相关的QTL区域，8个与LEANCUTP_100相关的QTL区域，以及12个与BFT_100相关的QTL区域。经过比较QTL区间的位置可以发现，LEANCUTP_100的8个QTL区域中有7个是与LMA_100重合的。但是，BFT_100和LMA_100之间，以及BFT_100和LEANCUTP_100之间，并没有QTL区域上的重合。这说明，仅针对预测瘦肉率而言，眼肌面积或许可以替代背膘厚在该性状遗传分析过程中的部分作用，故而可以借助于眼肌面积数据去改良预测瘦肉率。此外，考虑到预测瘦肉率通常是由背膘厚和眼肌面积换算得来，这3种性状具有一定的联系，而其他重要经济性状是否具有相似情况还有待研究。
对比其他研究结果，Suwannasing等[31]利用一步法全基因组关联分析定位了大白猪繁殖性状相关的QTL区域。在其他猪种中，Gao等[25]首次定位了与杜洛克猪精液性状相关QTL区域；Ruan等[32]在杜洛克猪中研究了生长性状相关联的QTL区域，研究结果定位到了15个与LEANCUTP_100显著相关的基因座；在BFT_100的研究中，定位了17个显著相关的基因座，并注释到了相关基因，但是与本研究并不相同。综上，本研究结果扩展了大白猪相关性状的研究。
3.3 候选基因注释和富集本研究注释到的基因，富集到了多个相关功能和通路。由GO功能和KEGG的结果可知，LMA_100和LEANCUTP_100的基因，大多与有丝分裂形成中的微管和纺锤体结构，及相关作用蛋白有关。这些结构和蛋白，在细胞有丝分裂过程中提供支撑和着力点，进而间接对个体的生长发育起到一定的影响作用。与BFT_100的关联基因主要和一些生理活动的正调节和信号通路有关。
在LMA_100和LEANCUTP_100的基因注释结果中，部分基因重复出现，如ADAL、CDC25B、AKT3、CD44等，这些基因均在一些研究中被报道过。如Zhang等[33]研究人类脂肪发现，ADAL基因所属的lincRNA可以与两种蛋白hnRNPU和IGF2BP2相互作用，起到调节脂肪细胞分化和脂肪生成的作用。Zhang等[34]通过RNAseq技术对嘉兴黑猪和大白猪的皮下脂肪细胞进行分析，研究mRNA和lncRNA的表征情况，研究中提到CDC25B基因参与调节细胞生长、形态和分化。AKT3基因被发现其与鸡的肌纤维特征有关[35]，同时该基因参与作用甲状腺激素信号通路和胰岛素信号通路，而这两条通路与生长发育具有重要关系[36]。CD44是一种编码多功能跨膜蛋白的基因，在Zhao等[37]对影响猪肉滴水损失的潜在后续基因的研究中也发现了该基因，而滴水损失是重要肉质性状之一。除此之外，还有一些基因也被报道和研究过，例如SPEF1[38-39]基因可以转录翻译一种进化保守的蛋白质，主要活跃于发育中的精子和成熟精子的鞭毛中，具有微管结合和捆绑的功能。Zhao等[40]在瘦肉型猪和脂肪型猪种的胎儿阶段，检测到的与肌肉高度表达相关的基因中均含有MAP1A基因。FGF9基因编码生成一种单链多肽，是成纤维细胞生长因子家族的成员之一，该家族主要作用于骨骼发育、胚胎发育、血管形成等过程，其中FGF9基因对软骨发育和成骨生成起到了重要作用[41-42]。在BFT_100的相关基因中，有一些基因也曾被报道过。如TTC26基因被认为参与精子细胞鞭毛运动相关蛋白的转运过程，且与纤毛高度相关[43]。CFAP410基因在Wang等[44]研究中被认为与软骨分化有关。在Gu等[45]对于多种猪组织管家基因的研究中发现，YWHAZ基因具有很高的表达稳定性，且被视为肌肉型组织正常化的最佳管家基因之一。综合以上的研究，本研究注释的基因相当一部分都和生长发育、肌肉、脂肪和骨骼生成有关，与本研究所分析的性状有一定的关联性。
4 结论综上，本研究利用加权一步法全基因组关联分析定位了与大白猪LMA_100显著相关的QTL区域10个，注释到的候选基因36个；与LEANCUTP_ 100显著相关的QTL区域8个，注释到的候选基因29个；与BFT_100显著相关的QTL区域12个，注释到的候选基因41个。后续的GO功能和KEGG通路富集分析结果表明，部分基因与生长发育、肌肉脂肪和骨骼的生成有关，如ADAL、CDC25B、AKT3、FGF9等。本试验所得结果扩展了大白猪生长性状的相关研究，为今后该品种生长性状的基因组遗传改良提供了重要分子标记，以及为后续育种中相关技术的推进提供了一定的借鉴作用。
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(编辑 郭云雁)