2. 西北民族大学生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心, 兰州 730030;
3. 西北民族大学生命科学与工程学院, 兰州 730010;
4. 中国农业科学院兰州兽医研究所, 兰州 730046
, PU Feiyang1,2,3, FENG Xili1,2,3, WANG Mengzhu1,2,3, ZHAO Zeyang1,2,3, ZHANG Derong1,2, MA Zhongren1,2, ZHOU Jianhua1,2,4
2. Gansu Tech Innovation Center of Animal Cell, Biomedical Research Center, Northwest Minzu University, Lanzhou 730030, China;
3. College of Life Science and Engineering, Northwest Minzu University, Lanzhou 730010, China;
4. Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China
牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)主要感染牛，孕期母畜感染BVDV可引起新生动物持续性感染(persistent infection, PI)，产生免疫耐受[1]。PI动物血清抗体呈阴性但终身向外排毒，是BVDV最重要的传染源。BVDV是单股正链RNA病毒，属于黄病毒科、瘟病毒属。根据BVDV基因遗传多样性以及抗原差异分析可将其分三大类，即BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3(HoBi-like virus)[2-3]。2018年，国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)基于瘟病毒属病毒的遗传和抗原相关性及其宿主趋向性对该属病毒重新进行分类与命名[4](表 1)。规范后BVDV不同种类病毒分别命名为瘟病毒A(Pestivirus A)、瘟病毒B(Pestivirus B) 和瘟病毒H(Pestivirus H)，但是该分类法还未广泛使用。目前，BVDV-1基因型含有至少22个亚型(a~v)[5]，BVDV-2和BVDV-3基因型分4个亚型(a~d)[6]。笔者团队在分析不同基因型BVDV在瘟病毒属病毒中的遗传特性时发现，BVDV-1与BVDV-2在同义密码子使用模式方面存在显著遗传差异，并且BVDV-1在同义密码子使用模式上的遗传多样性强于BVDV-2[7]，这也从同义密码子使用模式的水平上体现出BVDV基因亚型繁多且复杂。
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表 1 黄病毒科瘟病毒属病毒 Table 1 Viruses of the genus Pestivirus, family Flaviviridae |
1980年，中国首现BVDV疫情。近年来，研究人员检测发现，我国西部17个牛场中14个牛场有BVDV阳性牛[8]。此外，BVDV宿主的范围也在不断扩大，涉及到猪、羊、骆驼和鹿等动物[9]。BVDV的遗传多样性对疫情防控工作造成很大困难，对牛养殖业甚至全国养殖业乃至生物制品行业都产生消极影响。结合当前生产实际，BVDV疫情危害最严重的其实是生物制品行业。2020年初新冠肺炎疫情爆发，新病原肆虐全球，开发针对新型冠状病毒的疫苗刻不容缓。疫苗生产离不开优质牛血清，而BVDV感染往往会导致血清污染，因此相关科研人员与养殖人员对BVDV更加重视，防控和清除BVDV迫在眉睫。在此，本文综述BVDV基因组编码蛋白的一些免疫学特性以及目前BVDV疫苗的研究进展，以期为针对BVDV抗原特性来设计经济、方便、安全、有效、免疫效果好、保护时间长的新型疫苗提供一些参考。
1 BVDV基因组结构及其特征BVDV基因组由一条约12.3 kb的单股正链RNA组成，有一个开放阅读框(open reading frame, ORF)，两侧是非翻译区域5′UTR和3′UTR。BVDV的5′UTR包含一个内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site, IRES)，参与不依赖帽子结构的翻译起始过程，与其同科病毒丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)的IRES元件介导的翻译起始机制相似[10]。BVDV 3′UTR端保守的茎环通过与宿主细胞内的microRNA互作(例如let-7和miR-17家族成员)能够调控病毒的复制、翻译效率以及毒力[11]。BVDV的ORF编码的多聚蛋白可被病毒和宿主细胞的蛋白酶切割为具有活性的蛋白产物(包括4种结构蛋白和8种非结构蛋白)，顺序依次为N端自体蛋白酶(Npro)、衣壳蛋白(C)、3种囊膜蛋白(Erns, E1和E2)、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B(图 1)。Sangewar等[12]在结构蛋白Erns、E1和E2中发现8个能够诱导II型干扰素(Interferon, IFN)产生的BVDV特异性CD8+ T细胞表位，还有20个CD8+ T细胞表位散布于非结构蛋白Npro、NS2/3、NS4A/B以及NS5A/B。这一研究为开发基于CD8+ T细胞表位的BVDV新型疫苗奠定基础，或将实现接种疫苗能刺激机体同时产生高水平的体液免疫和细胞免疫反应，提高疫苗免疫保护效果。
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图 1 BVDV基因组结构示意图 Fig. 1 The schematic diagram of BVDV genome structure |
Npro是BVDV ORF编码的第一个蛋白，由约160个氨基酸组成，为亲水性的外膜蛋白，具有高度的保守性及蛋白酶水解活性[13]。Npro可通过N端功能结构域的完整性来拮抗I型IFN的抗病毒免疫效应，从而协助BVDV逃避宿主的免疫监控，导致宿主对BVDV感染的免疫耐受和持续感染。S100A9分子是危险相关分子模式(danger associated molecular patterns，DAMPs)家族中的重要成员，研究人员发现，BVDV Npro拮抗S100A9分子，影响其对TLR4/MyD88信号通路的激活，最终造成机体I型IFN产生减少[14]。作为BVDV ORF编码的第一个蛋白，只有Npro正确地从多聚蛋白上自我催化切割，病毒其他蛋白才能发挥各自功能；再结合Npro的免疫抑制特性，将其作为抗BVDV药物研发的主要靶点不失为一个可行的方案。
2.2 核心蛋白具有免疫原性核心蛋白(C蛋白)编码基因位于BVDV ORF的505~810位核苷酸区域，大小14 ku左右。C蛋白负责包装病毒RNA，二者相互结合然后被内质网膜来源的膜结构包裹形成衣壳，对BVDV基因组起保护作用[15]。PIAS4负调控I型IFN的转录，可通过抑制转录因子(如IRF3、IRF7和TRIF等)调控免疫应答从而维持BVDV有效感染。研究人员证实，BVDV C蛋白与PIAS4结合可以加强其抑制抗病毒因子表达的作用，促进病毒RNA的积累，从而增强病毒的复制和增殖[16]。Elahi等[17]将表达BVDV C蛋白的重组腺病毒免疫小鼠，发现能产生高水平的体液免疫和细胞免疫反应，表明C蛋白具有免疫原性。Chen等[18]发现一个位于BVDV C蛋白的具有免疫原性的B细胞表位，并将其命名为P3-BVDV 1/2，通过序列分析，发现该表位在多种瘟病毒中高度保守。因此，BVDV C蛋白有潜质成为疫苗候选抗原，可作为疫苗开发的靶点。
2.3 Erns蛋白在免疫过程中的“两面性”Erns蛋白由约227个氨基酸组成，锚定在BVDV囊膜上。一方面，在黄病毒科的病毒中，只有瘟病毒属病毒的基因组编码Npro蛋白和Erns蛋白，Erns和Npro都参与逃避宿主的IFN反应[19]。研究发现，Erns具有核糖核酸酶活性，可以与核苷酸底物结合，受感染细胞释放的Erns可能通过降解胞外病毒RNA从而干扰免疫反应[20]。另一方面，Erns蛋白含有BVDV主要的抗原表位，并且能够诱发机体产生针对Erns的抗体[21]。Erns中包含一段高度保守结构域，使得其具有作为BVDV基因工程疫苗和免疫诊断的候选抗原的潜力[22]。鉴于BVDV Erns在诱导机体免疫应答方面具有“两面性”，开发涉及Erns的基因工程疫苗应注意既规避其免疫抑制特性又要充分发挥其免疫原性。
2.4 E1蛋白在BVDV入侵环节不可或缺E1蛋白是BVDV病毒颗粒上相对含量最少的囊膜蛋白。在不同种类的瘟病毒中，E1蛋白的分子大小也不相同，约27~33 ku[23]。BVDV E1蛋白有3个糖基化位点，具有单一跨膜区，其C端锚定在病毒囊膜表面，可协助Erns定位。E1与E2通过二硫键形成异源二聚体后可实现BVDV对宿主细胞的侵染，这个过程中，E1蛋白锚定在病毒囊膜上的两个带极性的氨基酸残基对异源二聚体的形成有重要作用[24]。E1半胱氨酸参与E1/E2异源二聚体的形成，大多数瘟病毒的E1含有6个半胱氨酸，蛋白二级结构预测结果显示，E1蛋白C端最后一个半胱氨酸残基(C171)可能参与异源二聚体间二硫键的形成；BVDV E2的晶体结构研究表明，E2蛋白295位的半胱氨酸残基(C295)是E2中唯一的游离半胱氨酸残基，因此研究人员认为，E1中的C171与E2中的C295共同形成异源二聚体[25-27]。然而，Mu等[23]发现，E1的C171序列在瘟病毒属病毒中保守性不强，反而是E1中的C123在E1/E2异源二聚体的形成和E1的寡聚过程中起着关键作用。此外，研究人员分析BVDV E1不同功能结构域发现，E1跨膜锚定域协助其在内质网定位，诱导产生的内质网滞留信号(endoplasmic reticulum retention signal, ER-retention signal)能够刺激外源基因在细胞中表达[28]。设计BVDV基因工程疫苗时或许可借助E1能激发内质网滞留信号并促进外源基因表达的特点来提升目标抗原在细胞中的表达量，进一步提升疫苗免疫效力。
2.5 E2蛋白是激起免疫反应的重要抗原E2蛋白的编码基因长约1 200 bp，虽然BVDV E2基因核酸突变率以及抗原变异程度较高，但其中有3~6个N端糖基化位点和15~17个半胱氨酸残基在所有BVDV毒株中高度保守[29]。笔者团队在分析BVDV-1与BVDV-2 E2基因在核苷酸、同义密码子以及氨基酸使用模式的过程中发现，E2基因倾向于压制CpG二核苷酸的使用，这可能干扰宿主免疫系统对BVDV侵染的免疫监视[30]。E2蛋白通过C端疏水性膜锚定域锚定于病毒的囊膜上；N端伸出于病毒囊膜表面，有多种依赖于蛋白构象的抗原结构域，含有较多的种间共同抗原表位和特异抗原表位，在感染过程中作为主要的中和抗原诱导机体产生免疫反应[31]。深入分析BVDV E2蛋白结构功能域发现其含有两个Ig样远端结构域(域I和域II)和一个具有独特延伸区段的近膜端结构域(域III)[26]。在此基础上，Merwaiss等[32]研究E2结构域Ⅱ中β发夹时发现，人为改变β-发夹基序会削弱E2的功能，并影响BVDV粒子的感染力。基于BVDV E2蛋白在宿主免疫反应中的重要地位，系统研究基因突变对同义密码子使用模式以及蛋白结构域正确形成的影响、合理构建多表位E2抗原，对采用E2蛋白作为核心组件的BVDV基因工程疫苗十分重要。
2.6 其他协助BVDV组装和与宿主免疫反应相关的非结构蛋白BVDV的非结构蛋白在病毒复制与组装以及病毒基因组适应细胞环境的过程中发挥着重要作用。BVDV p7蛋白属于离子孔道蛋白家族，不影响病毒RNA的复制，但可通过改变病毒的通透性参与病毒的组装和释放[33]。研究表明，在BVDV感染过程中SPCS1、VAPA和SEC22B蛋白与p7发生互作，敲除这些蛋白能抑制BVDV复制[34]。阻断p7蛋白的功能可能是抗病毒药物开发的一个靶点。
Walther等[35]研究表明，只有NS2正确折叠，才能催化NS2-3裂解。而BVDV NS2-NS3蛋白的裂解效率直接决定着NS3单体对病毒基因复制的激活程度，影响BVDV的生物学表型，即致细胞病变型BVDV和非致细胞病变型BVDV。NS4A是NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，研究人员发现，NS3/4A串联复合物对激活BVDV RNA复制具有很强的选择性，NS2-3/4A的裂解活性直接影响BVDV等瘟病毒属成员病毒粒子的形成[36-37]。此外，接种改良活疫苗会引起针对BVDV NS2/3蛋白的B细胞免疫反应[38]。Li等[39]通过研究确定了BVDV NS3蛋白潜在的B细胞线性抗原表位。病毒B细胞表位是病毒蛋白的重要抗原元件，也是B细胞或抗体识别病毒蛋白的重要抗原成分，这表明BVDV NS3蛋白也具有开发亚单位疫苗的可能性。
BVDV的NS4B蛋白增加BVDV逃避宿主固有免疫的“战斗力”。Yue等[40]发现，BVDV NS4B过表达可以下调仙台病毒(模式病毒)介导的IFN-β的分泌，进一步分析证实，NS4B蛋白通过与MDA5中的2CARD功能结构域互作来下调RLR介导的IFN-β分泌和表达。研究表明，NS4B还可通过诱导受感染细胞形成自噬小体来提高病毒在宿主体内的复制效率[41]。以往，研究人员主要关注NS4B对病毒基因复制调控的生物学功能，然而最近发现NS4B还直接参与宿主的免疫反应。寨卡病毒(黄病毒科病毒)急性感染期间会产生针对NS4B的血清抗体反应[42]；Bashir等[43]发现接种BVDV减毒活疫苗的奶牛血清中存在NS4B特异性抗体。因此，NS4B可能也是一个具有诊断、免疫和治疗价值的靶点。在登革热病毒(黄病毒科病毒)中已经证实NS4B具有潜在的抗病毒治疗靶点和候选疫苗表位[44-45]，那么NS4B可能也具有制备BVDV亚单位疫苗的潜力。
NS5A是磷酸化的非结构蛋白，研究发现，NS5A能与负责转运调控宿主细胞蛋白及介导NF-kappaB信号通路的NIBP蛋白(NIK-and IKKbeta-binding protein)结合，干扰宿主细胞正常机制进而促进病毒自身蛋白的合成以确保BVDV增殖[46]。NS5B作为BVDV ORF最后一个翻译表达的非结构蛋白可以依赖第283位、285位的精氨酸以及第287位异亮氨酸起到病毒“RNA聚合酶”的作用来帮助病毒基因组复制[47]。基于这一特点，Duan等[48]利用针对NS5B的特异性单链抗体成功遏制BVDV增殖。
3 BVDV相关疫苗的免疫学评价目前，为防控BVDV，欧洲国家通常在不接种疫苗的前提下全面检测和捕杀受感染牛，成效虽然明显，但PI动物仍难以消除[49]。在牛密度大、BVDV流行率高的地区，病毒传播风险大，实施全面检测和扑杀方案的经济成本和时间代价往往更高，因此控制与根除BVDV最优的预防策略是疫苗接种。全世界目前注册BVDV疫苗产品超过120种[50]。截至2021年12月，我国国家兽药基础数据库中有3种灭活疫苗获准注册，分别为由BVDV NM01株(属于BVDV-1)制成的单价疫苗，BVDV NMG株与IBRV LY株制成的二联疫苗和BVDV NM01株和IBRV LN01/08制成的二联疫苗。尚无进口疫苗获准在国内注册。
3.1 常规BVDV疫苗常用BVDV疫苗有改良活疫苗(modified live vaccines, MLV)与灭活疫苗两种。MLV往往能诱导高滴度的病毒中和抗体，并提供长时间的保护，因此与需要加强免疫才能获得持续保护的灭活疫苗相比，MLV疫苗效果更好。但是，BVDV庞大的基因亚型毒株群使得MLV与野毒株发生重组致使毒力返强的几率增加。此外，妊娠动物接种活病毒疫苗存在疫苗病毒垂直传播的风险，有时会引起胎儿并发症或导致PI犊牛出生[51]。考虑到MLV存在安全风险，我国现阶段只允许使用灭活疫苗，但其免疫保护期短、缺乏细胞免疫反应以及对BVDV流行毒株保护力不足等问题也无法回避。另外，目前市售疫苗均不能凭借简单血清抗体检测实现区分感染与免疫接种(differentiation of infection from vaccination，DIVA)，阻碍了BVDV的防控与清除工作。为规避现有疫苗的缺点，理想实现具有广泛的有效性、安全性，还能达到DIVA效果的疫苗产品，研究人员大力开发诸如BVDV亚单位疫苗和病毒样颗粒疫苗等新型疫苗。掌握BVDV蛋白在感染过程中应对机体免疫反应的功能特点，能为BVDV疫苗寻找一些关键靶点。
3.2 以BVDV E2蛋白为核心的新型疫苗BVDV E2蛋白是病毒感染诱导机体产生中和抗体的主要靶点，是亚单位疫苗开发重要的候选抗原。Thomas等[52]使用杆状病毒表达系统和哺乳动物细胞表达系统生产E2蛋白，发现前者表达重组蛋白的能力明显强于后者；将不同剂量的两种蛋白制成疫苗免疫牛引起的抗体水平却相当，具有相似的保护作用，可见亚单位疫苗的免疫效果与所用抗原表达系统的类型有很强的相关性。然而，单独使用BVDV E2重组蛋白亚单位疫苗的免疫效果往往不佳，蛋白质或肽可能被机体蛋白酶分解，从而限制其生物利用度并影响递呈。使用佐剂可以增强抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)的激活，产生强烈的抗原特异性免疫反应，能有效提高疫苗保护效力(图 2)。Mody等[53]合成大腔径(约40 nm)中空介孔二氧化硅纳米材料，将其作为BVDV E2蛋白的载体和佐剂免疫小鼠可以产生高滴度的抗体并引起高水平的T细胞介导的免疫反应。BVDV-2 E2蛋白添加一种新型佐剂TriAdj制成疫苗免疫牛后可有效保护牛免受BVDV感染[54]。
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图 2 添加佐剂的亚单位疫苗引发免疫反应的示意图 Fig. 2 Schematic representation of the immune response stimulated by a subunit vaccine with adjuvant |
使用活载体作为E2抗原表达载体所制备的新型疫苗也具有一定的免疫效力。其中，重组疱疹病毒疫苗载体在疫苗开发中具有独特优势，能在宿主体内建立持续性感染，因此能持续性表达异源抗原。2008年，Donofrio等[55-56]首次使用重组4型牛疱疹病毒(bovine hepervirus 4, BoHV-4)作为载体并插入BVDV E2与BoHV-1 D基因，重组病毒接种动物能够产生相应的抗体，并能产生抗BVDV和BoHV-1的血清中和抗体，但该研究未评价其引起的细胞介导的免疫反应。近年，Chowdhury等[57]敲除BoHV-1中可与感染细胞分泌的趋化因子结合的蛋白G构建BoHV-1突变病毒，嵌合BVDV-2 E2和E0-牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte monocyte colony-stimulating factor, GM-CSF)制成亚单位疫苗，免疫犊牛后用BVDV-2强毒刺激，发现该疫苗比商品疫苗(Zoetis Bovi-shield Gold 3 trivalent)更快激起机体产生特异性中和抗体反应和强烈的BVDV-1与BVDV-2交叉保护性T细胞免疫反应。此外，研究人员发现，以乳酸杆菌为BVDV E2重组基因的载体，不但可以刺激小鼠机体产生大量IgG，还显著提高其黏膜中IgA以及II型IFN和白细胞介素-12(interleukin-12, IL-12)的水平[58]，这表明E2蛋白可以借助乳酸杆菌来增强机体T细胞介导的免疫反应，能进一步提升宿主对BVDV侵染产生的免疫保护反应。另外，以干酪乳杆菌W56(Lactobacillus casei strain W56，Lc W56)为载体、霍乱毒素B亚基(cholera toxin B subunit, ctxB)为佐剂并融合表达BVDV E2蛋白的重组乳酸菌疫苗pPG-E2-ctxB/Lc W56在小鼠体内具有免疫原性，能诱导小鼠的黏膜、体液和细胞免疫反应，提供有效的抗BVDV免疫保护[59]。
Cai等[60]在研究BVDV疫苗时发现，以ISA 61 VG为佐剂联合接种E2的DNA疫苗和重组E2蛋白疫苗的效果比单独接种其中一种疫苗的效果好，可刺激机体产生高滴度E2特异性抗体和强烈的细胞免疫应答反应。接种两种疫苗的免疫程序虽复杂，但也可为BVDV疫情防控与免疫程序的设计提供参考。Bellido等[61]揭示出开发BVDV靶向亚单位疫苗的可行性，采用杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system, BEVS)融合表达BVDV E2蛋白与单链抗体APCH，APCH是针对主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子抗原表位的抗体，该疫苗可将E2抗原靶向递呈至MHC-Ⅱ，可在牛体快速、持续诱导BVDV特异性中和抗体反应，能够降低动物接种疫苗的成本。
3.3 BVDV其他蛋白在疫苗研发中“闪亮登场”BVDV进入宿主细胞并引发机体感染离不开病毒蛋白与宿主细胞之间互作，然而任何一项生命活动都需由多种蛋白相互协调完成。随着国内外学者对BVDV研究的深入，越来越多的研究人员在设计疫苗时不局限于单一使用E2蛋白作为抗原，病毒的其他蛋白渐渐登上BVDV亚单位疫苗的“舞台”，并且这有利于开发针对高突变率BVDV的有效疫苗。Wang等[62]设计表达重组Erns-LTB蛋白，辅以MF59为佐剂制备出疫苗，使用小鼠模型评估疫苗效力发现可诱导较高的抗BVDV IgG水平，为BVDV疫苗开发提供新方向。褪黑素(melatonin, MT)已被证明具有抗炎和抗病毒特性，将MT作为佐剂添加至Erns-LTB疫苗中能抑制BVDV感染能力和刺激T细胞免疫应答[63]。在大肠杆菌中融合表达Erns和E2蛋白，利用MF59及CpG-ODN佐剂可以有效刺激免疫系统对融合蛋白的T细胞免疫反应，进而有效预防BVDV对宿主的侵染[64]。Sangewar等[65]通过比对BVDV-1和BVDV-2的基因序列，设计在其中高度保守的包含E2和NS2-3抗原的亚单位疫苗，可以提高疫苗保护效力，并能诱导强烈的BVDV特异性抗体交叉反应，对不同BVDV株具有交叉保护潜力。
3.4 BVDV病毒样颗粒疫苗近年来，利用病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)实现外源抗原诱导T细胞和B细胞免疫反应的研究越来越受到关注，尤其是嵌合型VLP疫苗。利用杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system, BEVS)生产BVDV E2与Erns组成的BVDV-VLPs粒子能强烈刺激机体产生包括针对E2蛋白特异性的IgG 1和IgG 2的中和抗体反应，并且通过提升CD3+CD4+和CD3+CD8+的细胞水平来促进II型IFN和IL-4的分泌[29]，这突显出VLP疫苗在BVDV疫苗研发中的优势。Wetzel等[66]以鸭源乙型肝炎病毒表面蛋白形成的类病毒体为骨架，将BVDV E2蛋白N端195个氨基酸嵌合到其表面后能在酵母细胞中高效表达，向降低嵌合VLP疫苗的成本迈进了一步。使用“仿生技术”将聚合纳米颗粒作为抗原载体，并在BVDV E2蛋白上包覆非结构蛋白NS3制成的仿生颗粒疫苗具有病毒中和活性，并能在免疫后检测到机体产生E2和NS3特异性抗体[67]，为疫苗开发提供新的思路和技术。
4 展望自1946年第一例BVDV疫情出现，学界针对BVDV在遗传学、免疫学、细胞生物学以及分子生物学等领域“多点开花”，取得很多成绩。然而，面对BVDV活跃的变异性，现有疫苗的保护效果显得有些力不从心。紧密追踪BVDV流行特点，搞清流行毒株亚型更迭的特征和规律，疫苗才能更加贴近BVDV流行株的特性。此外，除BVDV E2蛋白外，BVDV C、Erns、NS3和NS4B蛋白均具有免疫原性，设计相关抗原时可以综合考虑其高度保守性基因区段以及研究发现的一些B细胞和T细胞表位的氨基酸基序。而其中Erns和NS4B蛋白在遏制宿主免疫反应等方面的研究应进一步加强，使用这些蛋白开发亚单位疫苗时确保全面了解其作为疫苗候选抗原对机体免疫系统潜在的逃避与抑制作用，结合合理的“修饰或改造”方法来有效规避其免疫“负情绪”。充分发挥BVDV蛋白的免疫学特性，才能研制低成本、高效力的亚单位疫苗替代灭活、弱毒疫苗，从而实现BVDV疫苗高效安全的接种。
| [1] |
BENAVIDES B, CASAL J, DIÉGUEZ J F, et al. Development of a quantitative risk assessment of bovine viral diarrhea virus and bovine herpesvirus-1 introduction in dairy cattle herds to improve biosecurity[J]. J Dairy Sci, 2020, 103(7): 6454-6472. DOI:10.3168/jds.2019-17827 |
| [2] |
YEŞILBAIǦ K, ALPAY G, BECHER P. Variability and global distribution of subgenotypes of bovine viral diarrhea virus[J]. Viruses, 2017, 9(6): 128. DOI:10.3390/v9060128 |
| [3] |
BAUERMANN F V, RIDPATH J F. HoBi-like viruses-the typical 'atypical bovine pestivirus'[J]. Anim Health Res Rev, 2015, 16(1): 64-69. DOI:10.1017/S146625231500002X |
| [4] |
KING A M Q, LEFKOWITZ E J, MUSHEGIAN A R, et al. Changes to taxonomy and the international code of virus classification and nomenclature ratified by the international committee on taxonomy of viruses (2018)[J]. Arch Virol, 2018, 163(9): 2601-2631. DOI:10.1007/s00705-018-3847-1 |
| [5] |
OǦUZOǦLU T Ç, KOÇ B T, COŞKUN N, et al. Endless variety for bovine virus diarrhea viruses: new members of a novel subgroup into Pestivirus A from Turkey[J]. Trop Anim Health Prod, 2019, 51(5): 1083-1087. DOI:10.1007/s11250-018-01787-w |
| [6] |
AL-KUBATI A A G, HUSSEN J, KANDEEL M, et al. Recent advances on the bovine viral diarrhea virus molecular pathogenesis, immune response, and vaccines development[J]. Front Vet Sci, 2021, 8: 665128. DOI:10.3389/fvets.2021.665128 |
| [7] |
ZHOU J H, GAO Z L, ZHANG J, et al. Comparative the codon usage between the three main viruses in pestivirus genus and their natural susceptible livestock[J]. Virus Genes, 2012, 44(3): 475-481. DOI:10.1007/s11262-012-0731-z |
| [8] |
杞艳萍. 西部四省(区)BVDV的流行病学调查及分离鉴定[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2021. QI Y P. Epidemiological investigation and identification of BVDV in four western provinces (regions)[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2021. (in Chinese) |
| [9] |
薛飞, 朱远茂, 马磊. 我国牛病毒性腹泻/黏膜病研究进展及防控策略[J]. 中国奶牛, 2016(11): 25-29. XUE F, ZHU Y M, MA L. Research progress and prevention and control strategies of bovine viral diarrhea/mucosal disease in China[J]. China Dairy Cattle, 2016(11): 25-29. DOI:10.19305/j.cnki.11-3009/s.2016.11.007 (in Chinese) |
| [10] |
MA P, MA X X, CHANG Q Y, et al. The effects of nucleotide usage in key nucleotide positions +4 and -3 flanking start codon on translation levels mediated by IRES of hepatitis C virus[J]. Acta Virol, 2018, 62(4): 441-446. DOI:10.4149/av_2018_413 |
| [11] |
KOKKONOS K G, FOSSAT N, NIELSEN L, et al. Evolutionary selection of pestivirus variants with altered or no microRNA dependency[J]. Nucleic Acids Res, 2020, 48(10): 5555-5571. DOI:10.1093/nar/gkaa300 |
| [12] |
SANGEWAR N, WAGHELA S D, YAO J, et al. Novel potent IFN-γ-inducing CD8+T cell epitopes conserved among diverse bovine viral diarrhea virus strains[J]. J Immunol, 2021, 206(8): 1709-1718. DOI:10.4049/jimmunol.2001424 |
| [13] |
常秋燕, 郭富城, 冶昡青, 等. 牛病毒性腹泻病毒Npro蛋白的原核表达及裂解效率[J]. 江苏农业学报, 2019, 35(5): 1161-1166. CHANG Q Y, GUO F C, YE X Q, et al. Prokaryotic expression and splitting decomposition rate of Npro protein of bovine viral diarrhea virus[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2019, 35(5): 1161-1166. DOI:10.3969/j.issn.1000-4440.2019.05.023 (in Chinese) |
| [14] |
DARWEESH M F, RAJPUT M K S, BRAUN L J, et al. BVDV Npro protein mediates the BVDV induced immunosuppression through interaction with cellular S100A9 protein[J]. Microb Pathog, 2018, 121: 341-349. DOI:10.1016/j.micpath.2018.05.047 |
| [15] |
陈鑫烨. 牛病毒性腹泻病毒抗原表位的筛选及其单克隆抗体的制备[D]. 扬州: 扬州大学, 2020. CHEN X Y. Screening of a BVDV epitope and preparation of monoclonal antibodies[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2020. (in Chinese) |
| [16] |
GONG X W, CHEN Q W, ZHENG F Y. Identification of protein inhibitor of activated STAT 4, a novel host interacting partner that involved in bovine viral diarrhea virus growth[J]. Virol J, 2020, 17(1): 59. DOI:10.1186/s12985-020-01330-0 |
| [17] |
ELAHI S M, SHEN S H, TALBOT B G, et al. Induction of humoral and cellular immune responses against the nucleocapsid of bovine viral diarrhea virus by an adenovirus vector with an inducible promoter[J]. Virology, 1999, 261(1): 1-7. DOI:10.1006/viro.1999.9828 |
| [18] |
CHEN X Y, DING X Y, ZHU L Q, et al. The identification of a B-cell epitope in bovine viral diarrhea virus (BVDV) core protein based on a mimotope obtained from a phage-displayed peptide library[J]. Int J Biol Macromol, 2021, 183: 2376-2386. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2021.06.013 |
| [19] |
GIL L H V G, ANSARI I H, VASSILEV V, et al. The amino-terminal domain of bovine viral diarrhea virus Npro protein is necessary for alpha/beta interferon antagonism[J]. J Virol, 2006, 80(2): 900-911. DOI:10.1128/JVI.80.2.900-911.2006 |
| [20] |
ZVRCHER C, SAUTER K S, SCHWEIZER M. Pestiviral Erns blocks TLR-3-dependent IFN synthesis by LL37 complexed RNA[J]. Vet Microbiol, 2014, 174(3-4): 399-408. DOI:10.1016/j.vetmic.2014.09.028 |
| [21] |
REN X, ZHANG S, GAO X T, et al. Experimental immunization of mice with a recombinant bovine enterovirus vaccine expressing BVDV E0 protein elicits a long-lasting serologic response[J]. Virol J, 2020, 17(1): 88. DOI:10.1186/s12985-020-01338-6 |
| [22] |
GAO Y G, ZHAO X L, ZANG P, et al. Generation of the bovine viral diarrhea virus e0 protein in transgenic astragalus and its immunogenicity in sika deer[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2014, 2014: 372503. |
| [23] |
MU Y, TEWS B A, LUTTERMANN C, et al. Interaction of pestiviral E1 and E2 sequences in dimer formation and intracellular retention[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(14): 7285. DOI:10.3390/ijms22147285 |
| [24] |
RONECKER S, ZIMMER G, HERRLER G, et al. Formation of bovine viral diarrhea virus E1-E2 heterodimers is essential for virus entry and depends on charged residues in the transmembrane domains[J]. J Gen Virol, 2008, 89(Pt 9): 2114-2121. |
| [25] |
EL OMARI K, IOURIN O, HARLOS K, et al. Structure of a pestivirus envelope glycoprotein E2 clarifies its role in cell entry[J]. Cell Rep, 2013, 3(1): 30-35. DOI:10.1016/j.celrep.2012.12.001 |
| [26] |
LI Y, WANG J M, KANAI R, et al. Crystal structure of glycoprotein E2 from bovine viral diarrhea virus[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(17): 6805-6810. DOI:10.1073/pnas.1300524110 |
| [27] |
WANG J M, LI Y, MODIS Y. Structural models of the membrane anchors of envelope glycoproteins E1 and E2 from pestiviruses[J]. Virology, 2014, 454-455: 93-101. DOI:10.1016/j.virol.2014.02.015 |
| [28] |
MU Y, RADTKE C, TEWS B A, et al. Characterization of membrane topology and retention signal of pestiviral glycoprotein E1[J]. J Virol, 2021, 95(15): e00521-21. |
| [29] |
WANG Z H, LIU M Y, ZHAO H R, et al. Induction of robust and specific humoral and cellular immune responses by bovine viral diarrhea virus virus-like particles (BVDV-VLPs) engineered with baculovirus expression vector system[J]. Vaccines (Basel), 2021, 9(4): 350. DOI:10.3390/vaccines9040350 |
| [30] |
MA X X, MA P, CHANG Q Y, et al. The analyses of relationships among nucleotide, synonymous codon and amino acid usages for E2 gene of bovine viral diarrhea virus[J]. Gene, 2018, 660: 62-67. DOI:10.1016/j.gene.2018.03.065 |
| [31] |
DONOFRIO G, BOTTARELLI E, SANDRO C, et al. Expression of bovine viral diarrhea virus glycoprotein E2 as a soluble secreted form in a Mammalian cell line[J]. Clin Vaccine Immunol, 2006, 13(6): 698-701. DOI:10.1128/CVI.00071-06 |
| [32] |
MERWAISS F, PASCUAL M J, POMILIO M T, et al. A β-hairpin motif in the envelope protein E2 mediates receptor binding of bovine viral diarrhea virus[J]. Viruses, 2021, 13(6): 1157. DOI:10.3390/v13061157 |
| [33] |
TAUTZ N, TEWS B A, MEYERS G. The molecular biology of pestiviruses[J]. Adv Virus Res, 2015, 93: 47-160. |
| [34] |
郭妍婷. 牛病毒性腹泻病毒离子通道蛋白p7的互作蛋白筛选及功能研究[D]. 乌鲁木齐: 新疆农业大学, 2021. GUO Y T. Screening and functional research of interacting proteins of bovine viral diarrhea virus ion channel protein p7[D]. Urumqi: Xinjiang Agricultural University, 2021. (in Chinese) |
| [35] |
WALTHER T, FELLENBERG J, KLEMENS O, et al. Membrane topology of pestiviral nonstructural protein 2 and determination of the minimal autoprotease domain[J]. J Virol, 2021, 95(11): e00154-21. |
| [36] |
WALTHER T, BRUHN B, ISKEN O, et al. A novel NS3/4A protease dependent cleavage site within pestiviral NS2[J]. J Gen Virol, 2021, 102(10). DOI:10.1099/jgv.0.001666 |
| [37] |
DUBRAU D, SCHWINDT S, KLEMENS O, et al. Determination of critical requirements for classical swine fever virus NS2-3-independent virion formation[J]. J Virol, 2019, 93(18): e00679-19. |
| [38] |
RIDPATH J F. Immunology of BVDV vaccines[J]. Biologicals, 2013, 41(1): 14-19. DOI:10.1016/j.biologicals.2012.07.003 |
| [39] |
LI Y, JIA Y, WEN K, et al. Mapping B-cell linear epitopes of NS3 protein of bovine viral diarrhea virus[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2013, 151(3-4): 331-336. DOI:10.1016/j.vetimm.2012.11.011 |
| [40] |
YUE S, ZHAO T, MA J Z, et al. Bovine viral diarrhea virus NS4B protein interacts with 2CARD of MDA5 domain and negatively regulates the RLR-mediated IFN-β production[J]. Virus Res, 2021, 302: 198471. DOI:10.1016/j.virusres.2021.198471 |
| [41] |
SUDA Y, MURAKAMI S, HORIMOTO T. Bovine viral diarrhea virus non-structural protein NS4B induces autophagosomes in bovine kidney cells[J]. Arch Virol, 2019, 164(1): 255-260. DOI:10.1007/s00705-018-4045-x |
| [42] |
LI G Y, ADAM A, LUO H L, et al. An attenuated Zika virus NS4B protein mutant is a potent inducer of antiviral immune responses[J]. npj Vaccines, 2019, 4: 48. DOI:10.1038/s41541-019-0143-3 |
| [43] |
BASHIR S, KOSSAREV A, MARTIN V C, et al. Deciphering the role of bovine viral diarrhea virus non-structural NS4B protein in viral pathogenesis[J]. Vet Sci, 2020, 7(4): 169. DOI:10.3390/vetsci7040169 |
| [44] |
XU J M, XIE X P, YE N, et al. Design, synthesis, and biological evaluation of substituted 4,6-dihydrospiro[[1,2,3]triazolo[4,5-b]pyridine-7,3'-indoline]-2',5(3H)-dione analogues as potent NS4B inhibitors for the treatment of dengue virus infection[J]. J Med Chem, 2019, 62(17): 7941-7960. DOI:10.1021/acs.jmedchem.9b00698 |
| [45] |
ROTH C, CANTAERT T, COLAS C, et al. A modified mRNA vaccine targeting immunodominant NS epitopes protects against dengue virus infection in HLA class I transgenic mice[J]. Front Immunol, 2019, 10: 1424. DOI:10.3389/fimmu.2019.01424 |
| [46] |
ZAHOOR M A, YAMANE D, MOHAMED Y M, et al. Bovine viral diarrhea virus non-structural protein 5A interacts with NIK- and IKKβ-binding protein[J]. J Gen Virol, 2010, 91(Pt 8): 1939-1948. |
| [47] |
CURTI E, JAEGER J. Residues Arg283, Arg285, and Ile287 in the nucleotide binding pocket of bovine viral diarrhea virus NS5B RNA polymerase affect catalysis and fidelity[J]. J Virol, 2013, 87(1): 199-207. DOI:10.1128/JVI.06968-11 |
| [48] |
DUAN H, MA Z Q, XU L L, et al. A novel intracellularly expressed NS5B-specific nanobody suppresses bovine viral diarrhea virus replication[J]. Vet Microbiol, 2020, 240: 108449. DOI:10.1016/j.vetmic.2019.108449 |
| [49] |
SCHWEIZER M, STALDER H, HASLEBACHER A, et al. Eradication of bovine viral diarrhoea (BVD) in cattle in switzerland: lessons taught by the complex biology of the virus[J]. Front Vet Sci, 2021, 8: 702730. DOI:10.3389/fvets.2021.702730 |
| [50] |
HE Y Q, RACZ R, SAYERS S, et al. Updates on the web-based VIOLIN vaccine database and analysis system[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42(D1): D1124-D1132. DOI:10.1093/nar/gkt1133 |
| [51] |
MOENNIG V, BECHER P. Pestivirus control programs: how far have we come and where are we going[J]. Anim Health Res Rev, 2015, 16(1): 83-87. DOI:10.1017/S1466252315000092 |
| [52] |
THOMAS C, YOUNG N J, HEANEY J, et al. Evaluation of efficacy of mammalian and baculovirus expressed E2 subunit vaccine candidates to bovine viral diarrhoea virus[J]. Vaccine, 2009, 27(17): 2387-2393. DOI:10.1016/j.vaccine.2009.02.010 |
| [53] |
MODY K T, MAHONY D, ZHANG J, et al. Silica vesicles as nanocarriers and adjuvants for generating both antibody and T-cell mediated immune resposes to bovine viral diarrhoea virus E2 protein[J]. Biomaterials, 2014, 35(37): 9972-9983. DOI:10.1016/j.biomaterials.2014.08.044 |
| [54] |
SADAT S M A, SNIDER M, GARG R, et al. Local innate responses and protective immunity after intradermal immunization with bovine viral diarrhea virus E2 protein formulated with a combination adjuvant in cattle[J]. Vaccine, 2017, 35(27): 3466-3473. DOI:10.1016/j.vaccine.2017.05.029 |
| [55] |
DONOFRIO G, SARTORI C, FRANCESCHI V, et al. Double immunization strategy with a BoHV-4-vectorialized secreted chimeric peptide BVDV-E2/BoHV-1-gD[J]. Vaccine, 2008, 26(48): 6031-6042. DOI:10.1016/j.vaccine.2008.09.023 |
| [56] |
DONOFRIO G, FRANCESCHI V, CAPOCEFALO A, et al. Cellular targeting of engineered heterologous antigens is a determinant factor for bovine herpesvirus 4-based vaccine vector development[J]. Clin Vaccine Immunol, 2009, 16(11): 1675-1686. DOI:10.1128/CVI.00224-09 |
| [57] |
CHOWDHURY S I, PANNHORST K, SANGEWAR N, et al. BoHV-1-vectored BVDV-2 subunit vaccine induces BVDV cross-reactive cellular immune responses and protects against BVDV-2 challenge[J]. Vaccines (Basel), 2021, 9(1): 46. DOI:10.3390/vaccines9010046 |
| [58] |
BHUYAN A A, MEMON A M, BHUIYAN A A, et al. The construction of recombinant Lactobacillus casei expressing BVDV E2 protein and its immune response in mice[J]. J Biotechnol, 2018, 270: 51-60. DOI:10.1016/j.jbiotec.2018.01.016 |
| [59] |
JIA S, HUANG X N, LI H, et al. Immunogenicity evaluation of recombinant Lactobacillus casei W56 expressing bovine viral diarrhea virus E2 protein in conjunction with cholera toxin B subunit as an adjuvant[J]. Microb Cell Fact, 2020, 19(1): 186. DOI:10.1186/s12934-020-01449-3 |
| [60] |
CAI D J, SONG Q J, DUAN C, et al. Enhanced immune responses to E2 protein and DNA formulated with ISA 61 VG administered as a DNA prime-protein boost regimen against bovine viral diarrhea virus[J]. Vaccine, 2018, 36(37): 5591-5599. DOI:10.1016/j.vaccine.2018.07.054 |
| [61] |
BELLIDO D, BAZTARRICA J, ROCHA L, et al. A novel MHC-Ⅱ targeted BVDV subunit vaccine induces a neutralizing immunological response in guinea pigs and cattle[J]. Transbound Emerg Dis, 2021, 68(6): 3474-3481. DOI:10.1111/tbed.13952 |
| [62] |
WANG S H, YANG G H, NIE J W, et al. Immunization with recombinant Erns-LTB fusion protein elicits protective immune responses against bovine viral diarrhea virus[J]. Vet Microbiol, 2021, 259: 109084. DOI:10.1016/j.vetmic.2021.109084 |
| [63] |
WANG Y X, YANG G H, ZHANG L L, et al. Melatonin as immune potentiator for enhancing subunit vaccine efficacy against bovine viral diarrhea virus[J]. Vaccines (Basel), 2021, 9(9): 1039. DOI:10.3390/vaccines9091039 |
| [64] |
WANG S H, YANG G H, NIE J W, et al. Recombinant Erns-E2 protein vaccine formulated with MF59 and CPG-ODN promotes T cell immunity against bovine viral diarrhea virus infection[J]. Vaccine, 2020, 38(22): 3881-3891. DOI:10.1016/j.vaccine.2020.03.020 |
| [65] |
SANGEWAR N, HASSAN W, LOKHANDWALA S, et al. Mosaic bovine viral diarrhea virus antigens elicit cross-protective immunity in calves[J]. Front Immunol, 2020, 11: 589537. DOI:10.3389/fimmu.2020.589537 |
| [66] |
WETZEL D, BARBIAN A, JENZELEWSKI V, et al. Bioprocess optimization for purification of chimeric VLP displaying BVDV E2 antigens produced in yeast Hansenula polymorpha[J]. J Biotechnol, 2019, 306: 203-212. DOI:10.1016/j.jbiotec.2019.10.008 |
| [67] |
RⅡTHO V, WALTERS A A, SOMAVARAPU S, et al. Design and evaluation of the immunogenicity and efficacy of a biomimetic particulate formulation of viral antigens[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 13743. DOI:10.1038/s41598-017-13915-x |
(编辑 范子娟)