畜牧兽医学报  2023, Vol. 54 Issue (3): 1341-1346. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2023.03.044    PDF    
引用本文
卢碧凯, 袁秀芳, 徐丽华, 余斌, 苏菲, 叶十一, 陈怡洁, 蒋利明, 张晖, 李军星. 胸膜肺炎放线杆菌分离株血清型的PCR鉴定和Apx毒素基因检测[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(3): 1341-1346.  
LU Bikai, YUAN Xiufang, XU Lihua, YU Bin, SU Fei, YE Shiyi, CHEN Yijie, JIANG Liming, ZHANG Hui, LI Junxing. Molecular Serotyping and Apx Gene Profile Analysis of Actinobacillus pleuropneumoniae Isolates[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2023, 54(3): 1341-1346.  
胸膜肺炎放线杆菌分离株血清型的PCR鉴定和Apx毒素基因检测
卢碧凯1, 袁秀芳2, 徐丽华2, 余斌2, 苏菲2, 叶十一2, 陈怡洁1,2, 蒋利明3, 张晖1, 李军星2     
1. 佛山科学技术学院生命科学与工程学院, 佛山 528200;
2. 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所, 杭州 310021;
3. 浙江省台州市动物疫病预防控制中心, 台州 317700
收稿日期：2022-06-27
基金项目：浙江省自然科学基金(LY21C180002)；浙江省重点研发计划(2019C02052-3)；台州市农业科技项目
作者简介：卢碧凯(1995-)，男，壮族，广西南宁人，硕士生，主要从事动物疫病防控和兽医公共卫生研究，E-mail: 710817451@qq.com.
通信作者：张晖, 主要从事动物组织学与胚胎学研究, E-mail: zhanghui429@hotmail.com; 李军星, 主要从事猪细菌病的防治研究, E-mail: lijunx@zaas.ac.cn.
摘要：旨在调查胸膜肺炎放线杆菌流行株的血清型及Apx毒素基因携带情况，采用PCR方法对APP分离株进行血清型鉴定和Apx毒素基因检测。结果表明，64个分离株分别被鉴定为2、5、7、8、12、15、19共7个血清型。7个血清型中发现12种不同的Apx毒力因子模式。毒力因子分析结果显示，同一血清型的不同菌株携带的Apx毒素基因存在差异，不同血清型的菌株也可能会携带相同模式的Apx毒素基因。本研究表明，血清8型胸膜肺炎放线杆菌是浙江省的优势血清型，血清19型菌株在国内首次被检测到。血清型与所携带的Apx毒素基因之间不存在必然联系。
关键词：胸膜肺炎放线杆菌    血清分型    Apx    毒力因子    PCR    
Molecular Serotyping and Apx Gene Profile Analysis of Actinobacillus pleuropneumoniae Isolates
LU Bikai1, YUAN Xiufang2, XU Lihua2, YU Bin2, SU Fei2, YE Shiyi2, CHEN Yijie1,2, JIANG Liming3, ZHANG Hui1, LI Junxing2     
1. School of Life Science and Technology, Foshan University, Foshan 528200, China;
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;
3. Taizhou Animal Disease Prevention and Control Center, Taizhou 317700, China
Corresponding author: ZHANG Hui, E-mail: zhanghui429@hotmail.com; LI Junxing, E-mail: lijunx@zaas.ac.cn.
Abstract: The study aimed to investigate the serotypes and Apx toxin genes of Actinobacillus pleuropneumoniae clinical isolates. PCR was used to identify the serotypes and detect the Apx toxin genes of APP isolates. The results showed that 64 isolates were identified as serotypes 2, 5, 7, 8, 12, 15, 19 respectively. A total of 12 different Apx virulence factor patterns were found in 7 serotypes. The results of virulence factor analysis showed that different strains of the same serotype carried different Apx toxin genes, and the strains of different serotypes may also carry the same pattern of Apx toxin genes. A. pleuropneumoniae serotype 8 was the dominant serotype in Zhejiang Province, and serotype 19 was detected for the first time in China. There is no correlation between the Apx toxin gene and the serotype.
Key words: Actinobacillus pleuropneumoniae    serotyping    Apx    virulence factor    PCR    

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)的病原体。APP血清型众多，血清型与不同的病程相关[1]。根据荚膜抗原的差异，APP可分为1~15型[2-3]。Sárközi等[4]、Bossé等[5-6]和Stringer等[7]在无法分型的菌株中发现了血清16~19型。截至目前，APP已知19个血清型。

溶血毒素(Actinbacillus pleuropneumoniae-RTX，Apx)是APP最主要的毒力因子，包括ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣA毒素[8]，它们由相邻的按特定顺序排列的4个基因CABD组成的操纵子调控。ApxⅠ、ApxⅢ操纵子有完整的CABD基因，而ApxⅡ操纵子只有C基因和A基因[9]。不同血清型菌株间的毒力差异是由所携带的Apx毒力因子模式决定的[10]。因此，APP的毒力被认为与血清型密切相关[11]。

APP血清型间抗原性存在差异，交叉保护力低[12]，不同地区流行的血清型不尽相同[13]。因此，将特定区域一定时间内APP血清型的流行分布情况调查清楚，可及早采取针对性预防措施。为此，本研究调查了近十年来浙江省APP的流行情况，以期为探索有效的防控措施提供支持。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

TaKaRa TaqTM试剂盒、pMDTM19-T Vector Cloning Kit试剂盒(TaKaRa Bio中国有限公司)；蛋白酶K、0.1 mol·L－1 Tris(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2 菌株来源

本研究所用的64株APP分离株均由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所猪病研究室分离鉴定保存。其中，63株是肺分离株，1株是关节分离株。样品主要来自浙江省内猪场，样品信息详见表 1。

表 1 样品信息 Table 1 Sample information
1.3 引物设计

参考Stringer等[14]及Sthitmatee等[15]的血清分型方法及毒素测定方法合成引物，本研究所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 PCR扩增

采用蛋白酶K法提取基因组DNA，对64份样品进行血清分型及毒素测定。使用Taq酶25 μL反应体系进行PCR扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果 2.1 血清分型结果及分析

血清型鉴定结果如图 1所示。64个菌株分属7个血清型，其中，8型24株(占37.5%)；5型11株(占17.19%)；7型9株(占14.06%)；15型8株(占12.5%)；2型、12型、19型各4株(各占6.25%)。

图 1 2012—2021年各血清型菌株的检出数量及血清型分布 Fig. 1 Number of isolates and serovar distribution from 2012 to 2021

由于我国猪群中尚未有关于血清19型菌株感染的报道，为进一步验证本研究中发现的4株分离株为血清19型菌株，将测序结果在NCBI上比对。测序结果与血清19型参考菌株7213384-1(GenBank登录号: MT468887.1)的相似性为99.18%~100.00%，可确定其为血清19型菌株。

各血清型在不同年份的分布如图 1所示，血清5、7、8、15型出现在较多的年份中。血清8型在2018年之后成为浙江省的优势血清型。血清19型出现在2017、2019和2021年，表明19型菌株已在浙江省猪群中持续存在。

2.2 毒素检测结果及分析

在64个分离株中，毒素基因ApxIVA及ApxⅡCA的检出率为100%。ApxⅠBD和ApxⅢBD检出率分别为96.88%和92.19%。而ApxⅢCA和ApxⅠCA的检出率只有和65.63%和28.13%。用毒素基因的扩增结果表示APP的毒力因子模式，所有毒素基因扩增结果均相同的归为同一毒力因子模式，本研究共鉴定出12种不同的毒力因子模式(表 2)。血清5和7型毒力因子模式最为复杂, 分别有3种；血清2型和8型分别有2种；血清12、15、19型都只检测出1种毒力因子模式。其中，血清12型、19型的毒力因子模式跟8型的其中一种毒力因子模式相同。研究结果表明，同一血清型的不同菌株之间会存在不同的毒力因子，不同血清型的菌株也可能会携带相同的毒力因子，血清型与所携带的Apx毒素基因之间不存在必然联系。

表 2 APP分离株的毒力因子模式 Table 2 Virulence gene profiles of Actinobacillus pleuropneumoniae isolates
3 讨论

血清学分型是APP最重要的分类方法。血清1、2、5、7、8型在世界范围多个国家出现频率相对较高，其中，2型是世界范围内多个国家检出率最高的血清型[16-18]。我国学者的研究表明，国内猪场中血清1、3、7型出现的频率最高，其他血清型出现的较少，个别省份地区也有不同的优势血清型[19-20]。

本研究发现血清8型在浙江占主导地位，其次为血清5、7、15型。而在国内其他地区检出率较高的血清1、3型未被检出。此外，血清19型首次在我国猪群中检出。作者发现该血清型菌株最早于2017年就在浙江地区传播，直至2021年仍有流行，因此有必要对该血清型菌株的流行病学及危害进行持续跟踪研究。本研究结果表明，浙江省的APP优势血清型与国内其他地区有明显差异。

在针对APP疫苗的制备过程中，必须包含溶血毒素。把具有相同Apx毒素基因的APP分为一类，或许有可能为研制更有效疫苗提供线索[21]。除所有血清型APP均产生的ApxⅣA外，本研究检出数量最多的毒素基因为ApxⅠBD、ApxⅡCA和ApxⅢBD，因此针对这3个毒素制备的亚单位疫苗可能对浙江省猪传染性胸膜肺炎的防控带来更好的效果。

4 结论

本研究表明胸膜肺炎放线杆菌浙江分离株主要为血清8型，并在国内首次检出血清19型，且菌株的血清型与其携带的Apx毒素种类之间不存在必然联系。

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(编辑   白永平)