2. 湖南农业大学动物科学与技术学院, 长沙 410125;
3. 云南西南农牧集团股份有限公司, 昆明 650217;
4. 石家庄以岭药业股份有限公司, 石家庄 050035
, GONG Chengyan1, NIU Kaimin1, ZHANG Shuo3, TAO Deng3, MA Jun4, WU Xin1, YIN Yulong1, TANG Yulong1
2. College of Animal Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410125, China;
3. Yunnan Southwest Agriculture and Animal Husbandry Group Co. LTD., Kunming 650217, China;
4. Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd., Shijiazhuang 050035, China
中药是我国传统医学中的璀璨珍宝，几千年来为中国人民的健康和中华民族的繁荣立下赫赫之功。近些年因中医药的再次崛起，中药产业迅速发展，每年中药材的消耗量高达数千万吨[1]。产生的中药渣却通常被焚烧或掩埋处理，不仅对环境造成污染，对资源也是一种浪费[2]。中药材一次提取后产生的药渣中仍有残存于植物细胞内部的有效成分，可以通过发酵处理释放这些有效成分从而增强药效[3-6]，而且发酵在降低药渣毒性的同时会产生容易被机体吸收的新活性物质[7-8]。随着我国全面禁止使用抗生素药物作为畜禽饲料添加剂政策开始施行，中草药因其作用效果持久、无残留污染、不易产生耐药性、毒副作用小等特点逐渐展现出其作为绿色无公害饲料添加剂的优势。有研究表明，中药渣开发成动物饲料不仅可以增强动物的免疫功能，代替抗生素的使用，同时可以促进动物生长、改善肉品质[9-13]。在许多畜禽生产和研究中证实，使用中草药添加剂可以有效缓解畜禽应激、增强免疫力、提高生产效率和减少疫病等[14-18]。
以岭药业研发的由连翘、金银花等13种中草药组成的中成药连花清瘟，在抗病毒感染的研究中显示其对流感、COVID-19、带状疱疹、疱疹性咽峡炎、呼吸道合胞病毒感染等较好的临床效果，得出连花清瘟能有效治疗病毒感染性疾病的结论[19]。药效学研究显示，连花清瘟具有广谱抗病毒、抑菌、退热抗炎症和调节免疫功能等作用，具有“清瘟解毒、宣肺泄热”的功能[20]，流行性呼吸道感染患者使用连花清瘟治疗后能快速降低体温，调整身体功能，大量临床试验确切得出连花清瘟能有效消炎、抗菌，抵抗呼吸道感染[21-22]。以岭药业预计在疫情长期影响下，连花清瘟湿药渣年产出量将超过15.45万吨，而将其制做成功能性饲料添加剂或饲料原料可作为减少环境污染、提高资源利用率的一种药渣处理方式。
本试验在体外研究连花清瘟药渣发酵前后提取物对预防猪养殖过程中常见的副嗜血杆菌(HPS)、链球菌二型(SS2)等病原体抑制效果，以评估连花清瘟药渣作为减少猪疫病、增强免疫力、提高生产效率的饲料或饲料添加剂的潜在价值。
1 材料与方法 1.1 药渣、细菌、细胞、病毒和提取物获取连花清瘟药渣由以岭药业提供；SS2毒株ZJ081101[23]和ETEC毒株SEC470[24]由中国科学院亚热带农业生态研究所实验室保存，HPS毒株HS 0165[25]由金梅林教授实验室馈赠；Vero、MARC-145和PK-15三种细胞由中国科学院亚热带农业生态研究所实验室保存；PRV、PCV2和PRRSV三种病毒[26]由湖南农业大学动物医学院王乃东教授馈赠，储存于-80 ℃，用于试验；药渣提取物于中国科学技术大学亚热带农业生态研究所提取。
1.2 连花清瘟药渣发酵条件摸索使用灭菌与未灭菌两种连花清瘟药渣进行发酵条件摸索：分别在30、40、50 ℃下混合10%药渣，4%糖蜜，5%酵母培养副产物，添加0%、0.5%、3.5%、5%、10%、15% 6种不同添加量的复合酶(木聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶)和微生物接种量为106~107 CFU·g-1的黑曲霉菌(An)和枯草芽孢杆菌(KM51)，发酵过程中水分保持在50%~60%，分别处理1、2、4、7 d。对发酵所得样品粗蛋白含量进行测定后与未发酵药渣粗蛋白含量(11.16%±0.38%) 进行比较，挑选出发酵效果最好的条件，以此为基础进行后续发酵方案优化。
1.3 连花清瘟药渣发酵条件优化10%灭菌连花清瘟药渣，4%糖蜜，5%酵母培养副产物混合物选用乳酸菌(SK3494)和酵母菌(SC)作为发酵菌株并添加15%复合酶(木聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶)于30 ℃发酵7 d，按添加顺序分为以下3组：
自然发酵组：未添加菌和酶进行自然发酵7 d；
优化发酵1(4MYL)：酶处理2 d+酵母处理1 d+ 乳酸菌(同时加入4%糖蜜)处理4 d；
优化发酵2(Y4ML)：酶处理2 d+酵母处理1 d(同时加入4%糖蜜)+乳酸菌处理4 d。
1.4 抑菌试验使用肉汤稀释法，培养基使用脑心浸液肉汤培养基(brain-heart infusion broth，BHI)，pH 7.2~7.4。制备连花清瘟药渣水提取物(LHQW-W)与连花清瘟药渣乙醇提取物(LHQW-AL)培养基及菌液接种，取无菌无酶1.5 mL EP管18支，排成两排，除每排第1管加入LHQW-W浓度为12 mg·mL-1的BHI肉汤1.4 mL外，其余每管加入BHI肉汤0.7 mL，然后从第1管中吸取0.7 mL至第2管，混匀后再从第2管吸取0.7 mL至第3管，如此连续倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取0.7 mL弃去，第9管为不含药物的生长对照。第1管至第8管药物浓度分别为12、6、3、1.5、0.75、0.375、0.187 5、0.093 75 mg·mL-1。将第二排第1管加入LHQW-AL浓度为6 mg·mL-1的BHI肉汤1.4 mL，同种方法倍比稀释至第8管，并从第8管中吸取0.7 mL弃去，第9管为不含药物的生长对照。第1管至第8管LHQW-AL浓度分别为6、3、1.5、0.75、0.375、0.1875、0.093 75、0.046 875 mg·mL-1。再取两份无菌无酶1.5 mL EP管18支按上述方法制备培养基。
然后分别在上述每份18支EP管制备好的培养基中接种SS2、HPS、ETEC，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU·mL-1。将阳性对照菌液涂布到BHI培养基平板，37 ℃孵育24 h后观察计数，所有EP管均置普通空气摇床中37 ℃孵育16~20 h。在测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以对照组为参照肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长，即为受试菌的MIC。将上述每支EP管中菌液涂布到BHI培养基平板上，37 ℃孵育24 h，平板内肉眼观察无菌落生长则该药物浓度为受试菌的MBC，将各个平板上菌落计数，以便计算杀菌效率及抑菌效率。
杀菌效率(%)=(阳性初始菌落数－24 h后试验菌落数)/阳性初始菌落数*100(结果负数则记作杀菌效率=0)
抑菌效率(%)=(24 h后阳性菌落数－24 h后试验菌落数)/24 h后阳性菌落数*100%(结果负数则记作抑菌效率=0)
使用同种方法挑选同浓度原药渣和3种发酵药渣的乙醇提取物和水提取物进行抑菌试验，挑选原药渣提取物最小抑菌浓度作为对照组，其中SS2使用0.187 5 mg·mL－1乙醇提取物和1.5 mg·mL－1水提取物、HPS使用0.046 875 mg·mL－1乙醇提取物和0.75 mg·mL－1水提取物；ETEC使用6 mg·mL－1乙醇提取物和6 mg·mL－1水提取物。最后计算其抑菌和杀菌效率。
1.5 细胞毒性试验将处于指数生长期、生长状态良好的宿主细胞，消化并稀释浓度至1×105个·mL－1，每孔100 μL接种于96孔细胞培养板中，培养24 h，待其长成单层细胞，弃掉培养液。中药提取液用2%血清D-MEM维持液按2倍比稀释6个浓度梯度(12、6、3、1.5、0.75和0.375 mg·mL－1)，依次接种于长满宿主细胞的96孔板中，设3个重复孔、空白对照孔及细胞对照孔，于病毒培养箱中培养并观察细胞病变情况，72 h后用CCK-8法检测细胞毒性，用全自动分光光度计在检测波长(A450)和参比波长(A600)下读数。最终吸光度计算为A450-A600。阴性对照的吸光度设为100%细胞存活率，
处理细胞存活率(%)=[(A450-A600)处理细胞/(A450-A600)阴性对照]×100。
1.6 病毒滴度测定使用96孔细胞培养板，将处于指数生长期、生长状态良好的Vero，PK-15，MARC-145细胞，消化并稀释浓度至1×105个·mL－1，每块96孔板各孔分别接种100 μL细胞，培养24 h，待其长成单层细胞，弃掉培养液。将PRV、PCV2、PRRSV病毒液使用2%血清D-MEM维持液作10倍系列稀释，稀释倍数分别为101、102、103、104、105、106、107，每个稀释度100 μL，分别接种铺满Vero，PK-15，MARC-145细胞的96孔板，并做8个重复，放入37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养72 h，Vero，MARC-145细胞通过观察各孔细胞病变情况并记录，计算各稀释倍数细胞培养的死亡百分比并按照Reed-Muench计算病毒滴度。PK-15细胞置于－80 ℃冰箱反复冻融3次收集上清液通过PCR检测接种各稀释倍数稀释液所处理孔中PCV2是否呈阳性；计算各稀释倍数孔中阳性孔的百分比并按照Reed-Muench计算病毒滴度[27]，即计算经过提取物处理和未经过提取物处理细胞的上清液中PRV，PRRSV病毒的TCID50 [28]。
计算公式:
距离比例=(高于50%的阳性百分比-50)/(高于50%的阳性比-低于50%的阳性百分比)；
lgTCID50=高于50%的阳性百分比的对数+距离比例*稀释系数的对数；
1.7 病毒复制抑制试验在3个独立的试验中，评价0.375 mg·mL-1 LHQW-W、自然发酵组药渣水提取物(LHQW-W1)、4MYL水提取物(LHQW-W2)、Y4ML水提取物(LHQW-W3)、LHQW-AL、自然发酵组药渣乙醇提取物(LHQW-AL1)、4MYL乙醇提取物(LHQW-AL2)、Y4ML乙醇提取物(LHQW-AL3) 和0.75 mg·mL-1 LHQW-W、LHQW-AL对PRV、PCV2、PRRSV的抗病毒活性。采用24孔板分别培养24 h的Vero，PK-15，MARC-145单层细胞(500.000个·孔-1)，在孔中分别加入“1.6”中100 TCID50/100 μL的PRV稀释液100 μL感染Vero细胞; 用100 TCID50/100 μL的PCV2稀释液100 μL感染PK-15细胞；100 TCID50/100 μL的PRRSV稀释液100 μL感染MARC-145细胞。感染1 h后吸出稀释液，用D-MEM清洗单层细胞，分别加入不同浓度LHQW-W、LHQW-AL。在未经处理的感染细胞中，用D-MEM代替接种液。24 h后在显微镜下观察细胞形态后再将24孔板放置于－80 ℃冰箱反复冻融3次，收集所有经过提取物处理和未经过提取物处理细胞的上清液，用于之后的病毒核酸检测与定量。
按“1.6”中滴度测定方法将所有经过提取物处理和未经过提取物处理细胞的上清液使用2%血清D-MEM维持液作10倍系列稀释，按上述病毒滴度测定方法计算不同提取物处理后细胞上清液中病毒滴度。
1.8 病毒核酸的检测与定量收集“1.7”中24孔板细胞培养上清。病毒基因组的提取按照TaKaRa病毒核酸纯化试剂盒的操作说明书进行，从收集上清液和保存的已知病毒滴度的病毒液中提取病毒的DNA和RNA。
以提取的病毒RNA为模版，按照TaKaRa逆转录试剂盒的说明书操作，进行反转录，反应体系: PrimeScript RT Master Mix 2 μL，RNA 2 μL，DDW 6 μL。反应条件: 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保温，并将获得的cDNA放置－20 ℃保存备用。
使用绝对定量，将已知拷贝数的PRV、PCV2原液DNA和PRRSV反转录的原液cDNA依次10倍倍比稀释，配制成10-1~10-9的稀释液，共9个梯度，每个梯度设3个重复，作为模板按照TaKaRa染料法荧光定量试剂盒说明书的反应体系配制反应液进行荧光定量PCR反应得到标准曲线，计算出用病毒特异性引物将全部样品PRV、PCV2的DNA与PRRSV反转录得到的cDNA模板以及稀释好的标准品进行荧光定量PCR反应，得出各个样品Cq值算得基因拷贝数。
1.9 数据分析药物浓度对数换算后，细胞毒性和抗病毒活性测定数据用非线性曲线拟合程序进行分析。对剂量-反应曲线进行非线性回归分析，检验其优度。根据拟合的剂量-反应曲线，选择对各细胞生长抑制率＜20%的药物浓度做为LHQW-W，LHQW-AL的非细胞毒性浓度，用于后续试验。表中常规物质含量、生长性能等数据以“均值±标准差”表示，结果使用SPSS软件中单因素方差分析(ANOVA) 进行统计分析，采用Tukey检验后处理检验(P < 0.05表示差异显著)。
2 结果 2.1 药渣发酵条件摸索后的粗蛋白含量结果由表 2和表 3可知，发酵方案不同，发酵前、后粗蛋白含量也不同。其中灭菌药渣在30 ℃，添加5%、10%、15%的复合酶发酵1、4、7 d时粗蛋白含量均显著高于未发酵药渣(P＜0.05)；在40 ℃，添加5%的复合酶发酵1 d粗蛋白含量均显著高于未发酵药渣(P＜0.05)，而当复合酶添加量增加到15%时，发酵1、2、7 d粗蛋白含量均显著高于未发酵药渣(P＜0.05)；在50 ℃，添加10%的复合酶发酵1、2 d时粗蛋白含量显著高于未发酵药渣(P＜0.05)，发酵7 d时粗蛋白含量有所提高但并不显著(P＞0.05)，而添加15%的复合酶时，发酵1、2、7 d粗蛋白含量均显著高于未发酵药渣(P＜0.05)。未灭菌药渣在40 ℃，添加0.5%复合酶发酵1、2、4 d会使粗蛋白含量显著降低(P＜0.05)，当发酵进行到7 d时，粗蛋白含量降低但不显著；在50 ℃，添加0.5%复合酶发酵1 d会使粗蛋白含量显著降低(P＜0.05)，当发酵进行到2、4、7 d时，与未发酵药渣粗蛋白含量基本一致；使用KM51在40 ℃与室温(RT)下对未灭菌药渣发酵，粗蛋白含量均显著低于未发酵药渣(P＜0.05)；在RT下添加3.5%的复合酶并加入An对未灭菌药渣进行发酵，粗蛋白含量均显著低于未发酵药渣(P＜0.05)。摸索后得出连花清瘟药渣灭菌后添加4%糖蜜，5%酵母培养副产物，15%复合酶于30 ℃保持50%~60%水分发酵7 d是最佳发酵条件，并在此基础上添加发酵菌株进行优化发酵。
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表 1 用于3种病毒实时定量PCR的引物 Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR of the three viruses |
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表 2 连花清瘟药渣灭菌发酵粗蛋白含量 Table 2 Crude protein content of sterilized fermented residue of Lianhua Qingwen |
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表 3 连花清瘟药渣未灭菌发酵粗蛋白含量 Table 3 Crude protein content of unsterilized fermented residue of Lianhua Qingwen |
由表 4可知，原药渣、自然发酵、4MYL和Y4ML四组之间干物质、粗蛋白和粗脂肪水平均有显著差异(P＜0.05)。干物质的差异可能因发酵时添加水和糖蜜等物质导致。与原药渣相比其余三组粗灰分含量均显著降低(P＜0.05)，可能是发酵过程中微生物利用无机盐所致。自然发酵与原药渣相比粗纤维含量降低不显著(P＞0.05)。4MYL和Y4ML两组处理区别是添加糖蜜时间，4MYL糖蜜和酵母菌同时在发酵第3天添加，Y4ML糖蜜和乳酸菌同时在发酵第4天添加，4MYL和Y4ML两组的粗纤维含量显著降低(P＜0.05)，分别降低了2.905%和3.052%。说明在使用这两种方式发酵时极有可能减少了药渣中抗营养物质，如果胶、木质素及单宁等的含量，释放处于植物细胞内部的有效成分，在一定程度上提升了药渣的营养价值。4MYL和Y4ML两组分别比原药渣粗蛋白含量增加2.051%和2.489%，粗脂肪含量增加4.97%和4.637%，可知第3天同时添加糖蜜和酵母菌比第4天同时添加糖蜜和乳酸菌粗脂肪含量增加量显著增加，而粗蛋白含量增加量显著降低，可以按照需求通过改变添加时间进行精准发酵。
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表 4 不同发酵前后药渣常规营养水平 Table 4 Conventional nutrient levels of residues before and after different fermentation |
2.3.1 原药渣提取物体外抗菌活性 由图 1、图 2可知，LHQW-AL和LHQW-W两种提取物对SS2和HPS都表现出呈剂量依赖性显著的杀菌和抑菌效果，对ETEC无效果。LHQW-AL对SS2的MIC、MBC均为0.375 mg·mL-1，对HPS的MIC、MBC均为0.093 75 mg·mL-1。LHQW-W对SS2和HPS的MIC分别为6和3 mg·mL-1，MBC分别为12和6 mg·mL-1。从整体上看乙醇提取物抑菌杀菌的效果要高于水提取物，两种提取物均对副猪嗜血杆菌有更好的效果。可以得出连花清瘟药渣残留了一定的活性成分，在体外对感染肺部相关细菌有显著的抑菌和杀菌效果，但对ETEC没有抑菌和杀菌效果。
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柱上“*”、“***”表示各浓度处理与最高浓度组存在显著差异(P < 0.05)，ns表示没有显著差异。下同 "*" and "***" marked on the column indicate significant difference compared with the highest concentration group (P < 0.05), "ns" means there is no significant difference. The same as below 图 1 不同浓度LHQW-AL对3种常见病原菌的抑制效果 Fig. 1 Inhibition effects of different concentrations of LHQW-AL on three common pathogens |
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图 2 不同浓度LHQW-W对3种常见病原菌的抑制效果 Fig. 2 Inhibition effects of different concentrations of LHQW-W on three common pathogens |
2.3.2 发酵药渣提取物体外抗菌活性变化 通过原药渣提取物体外抗菌活性试验挑选出各致病菌最适对比试验抑菌浓度(SS2使用0.187 5 mg·mL-1乙醇提取物和1.5 mg·mL-1水提取物、HPS使用0.046 875 mg·mL-1乙醇提取物和0.75 mg·mL-1水提取物；ETEC使用6 mg·mL-1乙醇提取物和6 mg·mL-1水提取物)，由图 3、图 4可知，发酵之后三种发酵药渣提取物抗菌活性与原药渣提取物发生明显变化，ZRFJ、4MYL和Y4ML的乙醇提取物抑SS2和杀SS2活性显著提高(P < 0.05)，ZRFJ、4MYL和Y4ML水提取物抑SS2活性显著提高(P < 0.05)，ZRFJ水提取物杀SS2活性无显著变化，4MYL和Y4ML水提取物杀SS2活性显著提高(P < 0.05)；ZRFJ乙醇提取物抑HPS活性显著降低(P < 0.05)，杀HPS活性无显著变化，4MYL和Y4ML的乙醇提取物抑HPS和杀HPS活性显著提高(P < 0.05)，ZRFJ、4MYL和Y4ML的水提取物抑HPS活性显著降低(P < 0.05)，在0.75 mg·mL-1时失去抑HPS活性，杀HPS活性无显著变化；ZRFJ乙醇提取物产生显著抑ETEC活性(P < 0.05)，4MYL和Y4ML乙醇提取物和水提取物均产生显著抑ETEC和杀ETEC活性(P < 0.05)。通过微生物发酵对中药中活性成分产生显著影响，本研究通过体外试验发现连花清瘟药渣通过发酵能有效增强抗菌活性，发酵可能生成了新活性成分产生了抗ETEC活性。
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YYZ、ZRFJ、4MYL、Y4ML分别为原药渣、自然发酵、优化发酵1、优化发酵2四种药渣；图中“*、**、***”用于表示发酵后提取物与原药渣提取物抑菌效率是否存在显著差异 YYZ, ZRFJ, 4MYL and Y4ML are residues, natural fermentation, optimized fermentation 1 and optimized fermentation 2 respectively; The "*, **, ***" in the figure is used to indicate whether there is a significant difference in antibacterial efficiency between the extract after fermentation and the extract of technical drug residue 图 3 同浓度连花清瘟原药渣及3种发酵药渣乙醇提取物对3种常见病原菌的抑制效果 Fig. 3 Inhibition effects of the same concentration of Lianhua Qingwen residue and three kinds of fermented residue ethanol extract on three common pathogens |
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YYZ、ZRFJ、4MYL、Y4ML分别为原药渣、自然发酵、优化发酵1、优化发酵2四种药渣；图中“***”用于表示发酵后提取物与原药渣提取物抑菌效率是否存在显著差异。 YYZ, ZRFJ, 4MYL and Y4ML are residues, natural fermentation, optimized fermentation 1 and optimized fermentation 2 respectively; The "***" in the figure is used to indicate whether there is a significant difference in antibacterial efficiency between the extract after fermentation and the extract of technical drug residue 图 4 同浓度连花清瘟原药渣及3种发酵药渣水提取物对3种常见病原菌的抑制效果 Fig. 4 Inhibition effects of the same concentration of Lianhua Qingwen residue and three kinds of fermented residue water extract on three common pathogens |
使用不同浓度(12、6、3、1.5、0.75和0.375 mg · mL-1) 的LHQW-AL和LHQW-W处理Vero、PK-15和MARC-145三种细胞72 h后，CCK-8法检测细胞毒性，于显微镜下观察细胞形态改变(细胞单层脱落、肉芽形成、胞浆空泡化、细胞伸展变窄、细胞边界变暗)的程度和变化呈剂量依赖性。通过图 5、图 6对LHQW-AL和LHQW-W浓度(12、6、3、1.5、0.75和0.375 mg·mL-1)的两两比较，观察到随着提取物浓度的降低，LHQW-AL对3种细胞毒性均呈剂量依赖性显著降低(P < 0.05)。根据LHQW-AL和LHQW-W对3种细胞的细胞毒性计算细胞存活率，并与药物浓度相比较。LHQW-AL高浓度(12、6、3和1.5 mg·mL-1)处理的Vero、PK-15和MARC-145细胞的存活率分别为13.85%~ 61.35%、17.53%~83.848%和13.57%~56.93%，LHQW-W高浓度(12、6、3和1.5 mg·mL-1) 处理的Vero、PK-15和MARC-145细胞的存活率分别为16.41%~63.37%、14.73%~81.38%和12.74%~ 60.61%。低浓度(0.75和0.375 mg·mL-1) LHQW-AL处理后Vero细胞存活率分别为92.71%、96.82%，PK-15细胞存活率分别为90.93%、94.99%，MARC-145细胞存活率分别为93.98%、97.15%；低浓度(0.75和0.375 mg·mL-1) LHQW-W处理后Vero细胞存活率分别为87.13%和93.16%，PK-15细胞存活率分别为85.97%和95.42%，MARC-145细胞存活率分别为83.95%和95.78%，高浓度的两种提取物中仅有1.5 mg·mL-1对PK-15细胞生长抑制率＜20%，低浓度的两种提取物对三种细胞生长抑制率均＜20%，因此采用低于细胞毒阈值的两种药物浓度0.75和0.375 mg·mL-1进行抗病毒活性试验。
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图 5 不同浓度LHQW-AL处理对Vero、PK-15和MARC-145细胞活率的影响 Fig. 5 Effects of different concentrations of LHQW-AL on the viability of Vero, PK-15 and MARC-145 cells |
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图 6 不同浓度LHQW-W对处理对Vero、PK-15和MARC-145细胞活率的影响 Fig. 6 Effects of different concentrations of LHQW-W on the viability of Vero, PK-15 and MARC-145 cells |
2.5.1 原药渣提取物体外抗病毒活性 通过qPCR得出Cq值后代入公式，求得对照组、LHQW-AL(0.375 mg·mL-1)、LHQW-AL(0. 75 mg·mL-1)、LHQW-W(0.375 mg·mL-1)、LHQW-W(0. 75 mg·mL-1) 中PRV的拷贝数分别是3.584×108、8.206×107、4.844×107、7.344×107、6.086×107copies·10 μL-1；PCV2的拷贝数分别是1.724×108、1.620×108、1.527×108、2.835×108、3.287×108copies·10 μL-1；PRRSV的拷贝数分别是9.163×107、6.662×107、8.485×107、8.696×107、7.376×107copies·10 μL-1。病毒拷贝数以百分数表示，未处理的感染对照组细胞中病毒DNA拷贝数为100%·10 μL-1。将对照组细胞中病毒DNA拷贝数与不同非细胞毒性浓度(0.375、0.75 mg·mL-1)的药物进行比较，并按百分比做图。
通过显微镜下观察细胞形态，无处理对照组细胞内病毒大量增殖，破坏细胞结构，导致细胞大量死亡；LHQW-AL(0.75 mg·mL-1) 处理被PRRSV感染的MARC-145细胞和LHQW-W(0.75 mg·mL-1) 处理被PRV感染的Vero细胞，发生明显病变细胞数量少，有较少细胞发生病变且细胞无死亡大大减少；其他处理组细胞病变有所缓解，细胞死亡数量相比无处理组有所减少。由图 7可知与未经处理的感染细胞相比，0.375 mg·mL-1的LHQW-AL可使PCV2、PRV和PRRSV基因比率分别减少52.363%(P＜0.05)、54.773%(P＜0.05)和27.340%(P＜0.05)，0.75 mg·mL-1的LHQW-AL可分别减少71.903%(P＜0.05)、57.353%(P＜0.05)和7.366%(P＞0.05)，而0.375 mg·mL-1的LHQW-W可使PCV2、PRV和PRRSV基因比率分别减少57.356%(P＜0.05)、20.928%(P＜0.05)和5.056%(P＞0.05)，0.75 mg·mL-1的LHQW-W可分别减少64.710%(P＜0.05)、8.300%(P＞0.05)和19.475%(P＜0.05)高浓度LHQW-AL(0.75 mg·mL-1)处理PRRSV感染的MARC-145细胞中病毒基因拷贝数高于低浓度LHQW-AL(0.375 mg·mL-1)处理PRRSV感染的MARC-145细胞中病毒基因拷贝数，结合细胞形态猜测高浓度LHQW-AL有效保护了被PRRSV感染的MARC-145细胞，使其基本保持正常生长，LHQW-AL虽能抑制病毒增殖却无法完全杀死病毒，导致病毒持续感染正常细胞进行增殖，而低浓度LHQW-AL处理的MARC-145细胞死亡数量较大，能被继续感染正常细胞较少，病毒增殖活动减弱，因此高浓度LHQW-AL处理组上清液中病毒基因比率升高。同样推测高浓度LHQW-W(0.75 mg·mL-1) 处理PRV感染的Vero细胞中病毒基因拷贝数高于低浓度LHQW-W(0.375 mg·mL-1)处理PRV感染的Vero细胞的原因与上述原因一致。可以得出LHQW-AL和LHQW-W均能能有效抑制感染病毒增殖。
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A为LHQW-AL处理三种细胞上清液中病毒基因比率；B为LHQW-W处理三种细胞上清液中病毒基因比率；A、B图中标注“***”用于表示各浓度处理与对照组病毒基因比率是否存在显著差异。 A is the ratio of virus gene in the supernatant of the three cells treated by LHQW-AL; B is the ratio of virus gene in the supernatant of the three cells treated by LHQW-W; "***"are marked in figure A and B to indicate whether there is significant difference in virus gene ratio between treatment at each concentration and control group. 图 7 细胞上清液中病毒基因组相对比率 Fig. 7 Relative ratio of viral genomes in cell supernatant |
2.5.2 发酵药渣提取物体外抗病毒活性变化 通过qPCR得出Cq值后代入公式，求得浓度为0.375 mg·mL-1的LHQW-AL组、LHQW-AL1组、0. 75 mg·mL-1 LHQW-AL2组、LHQW-AL3组中PRV的拷贝数分别是8.206×107、2.117×107、3.488×107、3.455×107 copies·10 μL-1；PCV2的拷贝数分别是1.620×108、9.574×107、5.087×107、4.082×107 copies·10 μL-1；PRRSV的拷贝数分别是6.662×107、4.450×107、1.646×107、3.291×107 copies·10 μL-1；浓度为0.375 mg·mL-1的LHQW-W组、LHQW-W1组、0. 75 mg·mL-1 LHQW-W2组、LHQW-W3组中PRV的拷贝数分别是7.344×107、4.818×107、3.834×107、4.142×107 copies·10 μL-1；PCV2的拷贝数分别是2.835×108、9.441×107、8.335×107、8.108×107 copies·10 μL-1；PRRSV的拷贝数分别是8.696×107、10.235×107、4.626×107、4.209×107 copies·10 μL-1病毒拷贝数以百分数表示，“2.5.1”试验中未处理的感染对照组细胞病毒中DNA拷贝数为100%·10 μL-1。将对照组细胞中病毒DNA拷贝数与不同非细胞毒性浓度(0.375、0.75 mg·mL-1)的药物进行比较，并按百分比做图。
探究发酵前后药渣抗病毒活性是否增强，在其他条件相同情况下挑选同浓度(0.375 mg·mL-1)提取物进行对照试验，添加0.375 mg·mL-1的LHQW-AL可使PRV、PCV2和PRRSV的基因比率分别减少至45.227%、47.637%和72.660%；同浓度的LHQW-AL1、LHQW-AL2和LHQW-AL3处理后PRV的基因比率分别为25.779%(P＜0.05)、42.513%(P＞0.05)和42.061%(P＞0.05)；PCV2的基因比率分别为59.070%(P＜0.05)、31.440%(P＜0.05)和25.248%(P＜0.05)PRRSV的基因比率分别为66.848%(P＜0.05)、24.705%(P＜0.05)和49.409%(P＜0.05)。添加0.375 mg·mL-1的LHQW-W可使PRV、PCV2和PRRSV的基因比率分别减少至79.072%、42.644%和94.944%；同浓度的LHQW-W1、LHQW-W2和LHQW-W3处理使PRV的基因比率分别为65.630%(P＞0.05)、52.187%(P＜0.05)和56.141%(P＜00.05)；使PCV2的基因比率分别为33.262%(P＜0.05)、29.424%(P＜0.05)和28.571%(P＜0.05)；使PRRSV的基因比率分别为117.730%(P＜0.05)、53.19%(P＜0.05)和48.421%(P＜0.05)。由图 8可知LHQW-AL2和LHQW-AL3对PCV2和PRRSV的抗病毒活性显著增强，对PRV的抗病毒活性有所增强但不显著；LHQW-W2和LHQW-W3对三种病毒抗病毒活性均显著增强；LHQW-AL1对PRV和PRRSV的抗病毒活性显著提高，对PCV2的抗病毒活性显著降低；LHQW-W1对PRV和PCV2的抗病毒活性显著增强，对PRRSV的抗病毒活性显著降低。
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A为乙醇提取物处理三种细胞上清液中病毒基因比率；B为水提取物处理三种细胞上清液中病毒基因比率；LHQW-AL和LHQW-W分别是原药渣乙醇提取物和水提取物；LHQW-AL1和LHQW-W1分别是自然发酵药渣乙醇提取物和水提取物；LHQW-AL2和LHQW-W2分别是4MYL药渣乙醇提取物和水提取物；LHQW-AL3和LHQW-W3分别是Y4ML药渣乙醇提取物和水提取物；A、B图中“*、**、***”用于表示PRV、PCV2、PRRSV三种病毒试验组与对照组病毒基因比率是否存在显著差异 A is the ratio of virus gene in the supernatant of the three cells treated by ethanol extract; B is the ratio of virus gene in the supernatant of the three cells treated by water extract; LHQW-AL and LHQW-W are ethanol extract and water extract of original pharmaceutical residue respectively. LHQW-AL1 and LHQW-W1 were ethanol extract and water extract from natural fermentation residue, respectively. LHQW-AL2 and LHQW-W2 were ethanol extract and water extract of 4MYL residue, respectively. LHQW-AL3 and LHQW-W3 were ethanol extract and water extract from Y4ML residue, respectively. In figure A and Figure B, "*、**、***"are used to indicate whether there is significant difference in gene ratio between the experimental group and the control group of PRV, PCV2 and PRRSV viruses respectively 图 8 药渣发酵前后提取物抗病毒活性对比 Fig. 8 Comparison of antiviral activity of extracts before and after fermentation |
2.6.1 病毒滴度测定 通过终点稀释法确定未处理的感染细胞的病毒滴度被认为是1(PRV、PCV2和PRRSV的病毒滴度分别为107.77TCID50/100 μL、106.71 TCID50/100 μL和107.10 TCID50/100 μL)。提取物处理与未处理感染细胞用log10病毒滴度对比作图，则未处理的感染细胞中PRV、PCV2和PRRSV分别为7.77log10TCID50/100 μL、6.71log10TCID50/100 μL和7.10 log10TCID50/100 μL。
图 9可知LHQW-AL在0.375 mg·mL-1和0.75 mg·mL-1时分别使PRV病毒滴度下降38.10%(P＜0.05)和51.27%(P＜0.05)，PCV2病毒滴度下降35.60%(P＜0.05)和36.10%(P＜0.05)，PRRSV病毒滴度下降26.33%(P＜0.05) 和3.2%(P＜0.05)。LHQW-W在0.375 mg·mL-1和0.75 mg·mL-1时分别使PRV病毒滴度下降34.70%(P＜0.05)和56.33%(P＜0.05)，PCV2病毒滴度下降19.70%(P＜0.05)和3.93%(P＜0.05)，PRRSV病毒滴度下降2.167%(P＞0.05)和13.60%(P＜0.05)。可知经过提取物处理后细胞中，除LHQW-W处理后PRRSV病毒滴度下降不显著外，其余处理均表现出病毒滴度显著下降。
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非细胞毒性浓度药渣提取物处理后细胞的病毒滴度以未处理细胞病毒滴度的倍数表示，图中标注“***”用于表示各浓度处理与对照组病毒基因比率是否存在显著差异 Viral titres of cells treated with non-cytotoxic concentrations of residue extracts were expressed as multiples of the viral titres of untreated cells. The "***" in the figure is used to indicate whether there is a significant difference between the virus gene ratio of each concentration treatment and the control grou p 图 9 不同的非细胞毒性浓度处理病毒滴度比较 Fig. 9 Comparison of virus titers in different non cytotoxic concentrations |
非细胞毒性浓度发酵药渣提取物处理后细胞的病毒滴度以同浓度非细胞毒性浓度药渣提取物处理后细胞病毒滴度的倍数表示，通过终点稀释法确定药渣提取物处理后细胞的病毒滴度被认为是1(图 9A中药渣提取物处理后PRV、PCV2和PRRSV的病毒滴度分别为104.81、104.32和105.23TCID50/100 μL，图 9B中药渣提取物处理后PRV、PCV2和PRRSV的病毒滴度分别为105.07、105.39和106.94TCID50/100 μL)。发酵药渣提取物处理与药渣提取物处理细胞用log10病毒滴度对比作图，则图 9A药渣提取物处理的细胞中PRV、PCV2和PRRSV分别为4.81、4.32和5.23 log10TCID50/100 μL，图 9B药渣提取物处理的细胞中PRV、PCV2和PRRSV分别为5.07、和6.94 log10 TCID50/ 100 μL。
由图 10可知经过发酵处理后，与0.375 mg·mL-1未发酵提取物LHQW-AL相比，0.375 mg/mL发酵提取物LHQW-AL1处理细胞后分别使感染细胞上清中PRV、PCV2和PRRSV病毒滴度下降22.90%(P＜0.05)、增加15.46%(P＜0.05)和下降6.63%(P＜0.05)；0.375 mg·mL-1发酵提取物LHQW-AL2处理细胞后分别使感染细胞上清中PRV、PCV2和PRRSV病毒滴度下降11.76%(P＜0.05)、18.03%(P＜0.05)和48.62%(P＜0.05)；0.375 mg·mL-1 LHQW-AL3发酵提取物处理细胞后分别使感染细胞上清中PRV、PCV2和PRRSV病毒滴度下降13.62%(P＜0.05)、25.12%(P＜0.05)和20.63%(P＜0.05)。与0.375 mg·mL-1未发酵提取物LHQW-W相比，0.375 mg·mL-1发酵提取物LHQW-W1处理细胞后分别使感染细胞上清中PRV、PCV2和PRRSV病毒滴度下降8.49%(P＜0.05)、10.44%(P＜0.05)和增加22.50%(P＜0.05)；0.375 mg·mL-1发酵提取物LHQW-W2处理细胞后分别使感染细胞上清中PRV、PCV2和PRRSV病毒滴度下降20.90%(P＜0.05)、20.88%(P＜0.05)和53.81%(P＜0.05)；0.375 mg·mL-1发酵提取物LHQW-W3处理细胞后分别使感染细胞上清中PRV、PCV2和PRRSV病毒滴度下降18.28%(P＜0.05)、22.48%(P＜0.05)和57.72%(P＜0.05)。与未发酵药渣同种提取物相比，除LHQW-AL1处理后PCV2病毒滴度和LHQW-W1处理后PRRSV病毒滴度显著增加外，其余发酵提取物处理均表现出比未发酵药渣同种提取物更显著降低病毒滴度的作用。
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A为LHQW-AL处理三种细胞上清液中病毒滴度；B为LHQW-W处理三种细胞上清液中病毒滴度，A、B图中标注“***”用于表示各浓度处理与对照组病毒基因比率是否存在显著差异 A is the virus titer in the supernatant of the three cells treated with LHQW-AL; B is the virus titer in the supernatant of the three cells treated with LHQW-W; respectively, and the graphs in A and B are marked with "***" is used to indicate whether there is a significant difference in the viral gene ratio between each concentration treatment and the control group 图 10 药渣发酵前后提取物处理病毒滴度比较 Fig. 10 Comparison of virus titers of extracts from drug residues before and after fermentation |
2.6.2 原药渣提取物体外抗病毒活性 通过qPCR得出Cq值后代入公式，求得对照组、LHQW-AL(0.375 mg/mL)、LHQW-AL(0. 75 mg·mL-1)、LHQW-W(0.375 mg·mL-1)、LHQW-W(0. 75 mg·mL-1) 中PRV的拷贝数分别是3.58×108、8.21× 107、4.84× 107、7.34×107、6.09×107copies·10 μL-1；PCV2的拷贝数分别是1.72×108、1.62×108、1.53×108、2.84×108、3.29×108copies·10 μL-1；PRRSV的拷贝数分别是9.16×107、6.66×107、8.49×107、8.70×107、7.38×107copies·10 μL-1。病毒拷贝数以百分数表示，未处理的感染对照组细胞中病毒DNA拷贝数为100%·10 μL-1。将对照组细胞中病毒DNA拷贝数与不同非细胞毒性浓度(0.375、0.75 mg·mL-1)的药物进行比较，并按百分比做图。
通过显微镜下观察细胞形态，无处理对照组细胞内病毒大量增殖，破坏细胞结构，导致细胞大量死亡；LHQW-AL(0.75 mg·mL-1) 处理被PRRSV感染的MARC-145细胞和LHQW-W(0.75 mg·mL-1) 处理被PRV感染的Vero细胞，发生明显病变细胞数量少，有较少细胞发生病变且细胞无死亡大大减少；其他处理组细胞病变有所缓解，细胞死亡数量相比无处理组有所减少。由图 11可知与未经处理的感染细胞相比，0.375 mg·mL-1的LHQW-AL可使PCV2、PRV和PRRSV基因比率分别减少52.36%(P＜0.05)、54.77%(P＜0.05)和27.34%(P＜0.05)，0.75 mg/mL的LHQW-AL可分别减少71.90%(P＜0.05)、57.35%(P＜0.05)和7.37%(P＞0.05)，而0.375 mg·mL-1的LHQW-W可使PCV2、PRV和PRRSV基因比率分别减少57.36%(P＜0.05)、20.93%(P＜0.05)和5.06%(P＞0.05)，0.75 mg·mL-1的LHQW-W可分别减少64.71%(P＜0.05)、8.30%(P＞0.05)和19.48%(P＜0.05)高浓度LHQW-AL(0.75 mg·mL-1)处理PRRSV感染的MARC-145细胞中病毒基因拷贝数高于低浓度LHQW-AL(0.375 mg·mL-1)处理PRRSV感染的MARC-145细胞中病毒基因拷贝数，结合病毒滴度和细胞形态猜测高浓度LHQW-AL有效保护了被PRRSV感染的MARC-145细胞，使其基本保持正常生长，LHQW-AL虽能抑制病毒增殖却无法完全杀死病毒，导致病毒持续感染正常细胞进行增殖，而低浓度LHQW-AL处理的MARC-145细胞死亡数量较大，能被继续感染正常细胞较少，病毒增殖活动减弱，因此高浓度LHQW-AL处理组上清液中病毒基因比率升高。同样推测高浓度LHQW-W(0.75 mg·mL-1)处理PRV感染的Vero细胞中病毒基因拷贝数高于低浓度LHQW-W (0.375 mg·mL-1)处理PRV感染的Vero细胞的原因与上述原因一致。可以得出LHQW-AL和LHQW-W均能能有效抑制感染病毒增殖。
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A.LHQW-AL处理3种细胞上清液中病毒基因比率；B.LHQW-W处理三种细胞上清液中病毒基因比率；A、B图中标注“***”用于表示各浓度处理与对照组病毒基因比率是否存在显著差异 A. The ratio of virus gene in the supernatant of the three cells treated by LHQW-AL; B. The ratio of virus gene in the supernatant of the three cells treated by LHQW-W; "***"are marked in figure A and B to indicate whether there is significant difference in virus gene ratio between treatment at each concentration and control group 图 11 细胞上清液中病毒基因组相对比率 Fig. 11 Relative ratio of viral genomes in cell supernatant |
2.6.3 发酵药渣提取物体外抗病毒活性变化 通过qPCR得出Cq值后代入公式，求得浓度为0.375 mg·mL-1的LHQW-AL组、LHQW-AL1组、0. 75 mg·mL-1 LHQW-AL2组、LHQW-AL3组中PRV的拷贝数分别是8.21×107、2.12×107、3.49× 107、3.46×107 copies·10 μL-1；PCV2的拷贝数分别是1.62×108、9.58×107、5.09×107、4.08× 107 copies·10 μL-1；PRRSV的拷贝数分别是6.66×107、4.45×107、1.64×107、3.29×107 copies·10 μL-1；浓度为0.375 mg·mL-1的LHQW-W组、LHQW-W1组、0. 75 mg·mL-1 LHQW-W2组、LHQW-W3组中PRV的拷贝数分别是7.34×107、4.82×107、3.83× 107、4.14×107 copies·10 μL-1；PCV2的拷贝数分别是2.84×108、9.44×107、8.34×107、8.11×107 copies·10 μL-1；PRRSV的拷贝数分别是8.70×107、10.24×107、4.63×107、4.21×107 copies·10 μL-1病毒拷贝数以百分数表示，“2.5.1”试验中未处理的感染对照组细胞病毒中DNA拷贝数为100%·10 μL-1。将对照组细胞中病毒DNA拷贝数与不同非细胞毒性浓度(0.375、0.75 mg·mL-1) 的药物进行比较，并按百分比做图。
探究发酵前后药渣抗病毒活性是否增强，在其他条件相同情况下挑选同浓度(0.375 mg·mL-1)提取物进行对照试验，由图 12可以看出添加0.375 mg·mL-1的LHQW-AL可使PRV、PCV2和PRRSV的基因比率分别减少至45.23%、47.64%和72.66%；同浓度的LHQW-AL1、LHQW-AL2和LHQW-AL3处理后PRV的基因比率分别为25.78%(P＜0.05)、42.51%(P＞0.05) 和42.06%(P＞0.05)；PCV2的基因比率分别为59.07%(P＜0.05)、31.44%(P＜0.05)和25.25%(P＜0.05) PRRSV的基因比率分别为66.85%(P＜0.05)、24.71%(P＜0.05)和49.41%(P＜0.05)。添加0.375 mg·mL-1的LHQW-W可使PRV、PCV2和PRRSV的基因比率分别减少至79.07%、42.64%和94.94%；同浓度的LHQW-W1、LHQW-W2和LHQW-W3处理使PRV的基因比率分别为65.60%(P＞0.05)、52.19%(P＜0.05)和56.14%(P＜00.05)；使PCV2的基因比率分别为33.26%(P＜0.05)、29.42%(P＜0.05)和28.57%(P＜0.05)；使PRRSV的基因比率分别为117.73%(P＜0.05)、53.19%(P＜0.05)和48.42%(P＜0.05)。由图 8可知LHQW-AL2和LHQW-AL3对PCV2和PRRSV的抗病毒活性显著增强，对PRV的抗病毒活性有所增强但不显著；LHQW-W2和LHQW-W3对三种病毒抗病毒活性均显著增强；LHQW-AL1对PRV和PRRSV的抗病毒活性显著提高，对PCV2的抗病毒活性显著降低；LHQW-W1对PRV和PCV2的抗病毒活性显著增强，对PRRSV的抗病毒活性显著降低。
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A为乙醇提取物处理三种细胞上清液中病毒基因比率；B为水提取物处理三种细胞上清液中病毒基因比率；LHQW-AL和LHQW-W分别是原药渣乙醇提取物和水提取物；LHQW-AL1和LHQW-W1分别是自然发酵药渣乙醇提取物和水提取物；LHQW-AL2和LHQW-W2分别是4MYL药渣乙醇提取物和水提取物；LHQW-AL3和LHQW-W3分别是Y4ML药渣乙醇提取物和水提取物；A、B图中“*、**、***”用于表示PRV、PCV2、PRRSV三种病毒试验组与对照组病毒基因比率是否存在显著差异 A is the ratio of virus gene in the supernatant of the three cells treated by ethanol extract; B is the ratio of virus gene in the supernatant of the three cells treated by water extract; LHQW-AL and LHQW-W are ethanol extract and water extract of original pharmaceutical residue respectively. LHQW-AL1 and LHQW-W1 were ethanol extract and water extract from natural fermentation residue, respectively. LHQW-AL2 and LHQW-W2 were ethanol extract and water extract of 4MYL residue, respectively. LHQW-AL3 and LHQW-W3 were ethanol extract and water extract from Y4ML residue, respectively. In figure A and Figure B, "*、**、***"are used to indicate whether there is significant difference in gene ratio between the experimental group and the control group of PRV, PCV2 and PRRSV viruses respectively 图 12 药渣发酵前后提取物抗病毒活性对比 Fig. 12 Comparison of antiviral activity of extracts before and after fermentation |
中医药是我国传统医学的璀璨珍宝，是我国保障人民健康的重要战略资源[29]。随着我国中医药产业的发展，中药残渣产量逐年增加。据估计，目前我国仅中药企业药材年排放量就达数千万吨(湿重)[1]，产生的中药残渣通常被焚烧或掩埋，不仅造成环境污染，还浪费在资源上。因生产工艺尚不成熟等原因，在经过提取加工后，中药残渣中仍有40%的药效成分，随着我国全面禁止使用抗生素药物作为畜禽饲料添加剂政策开始施行，中草药因其作用效果持久、无残留污染、不易产生耐药性、毒副作用小等特点逐渐展现出其作为绿色无公害饲料添加剂的优势。孙晓燕[30]将茯苓、决明子、枸杞等中药残渣使用微生物发酵技术发酵后制备的无抗饲料添加剂用于养猪能获得更好的生长性能和经济效益。宋玉琴[31]在小鼠、大鼠和家兔饲养中添加人参药渣，发现能有效的提高动物抵抗力，更能改善肉质，并在长期饲喂中发现对动物无毒性。张恬[10]添加黄芪药渣到松辽黑猪饲料中，虽然在生长、胴体及肉质指标方面总体表现差异不显著, 但能有效说明黄芪药渣作为饲料添加剂是安全无害的。陈鑫[32]等人利用白腐菌与产朊假丝酵母的混合菌种对红芪药渣进行固态发酵生产蛋白饲料，利用复合菌固态发酵中药渣, 可降低发酵产物中粗纤维含量, 同时提高真蛋白含量, 为中草药下游产品的开发和应用提供科学依据。
本试验通过研究连花清瘟药渣及其发酵药渣提取物在体外是否能有效抑制引起猪肺炎、脑膜炎和关节炎等炎症的SS2[33]；引起关节炎和纤维素性浆膜炎的HPS[34]和引起幼畜腹泻的ETEC[35]以及引起伪狂犬病的PRV[36]、导致猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory syndrome，PRDC)发病的主要病毒PCV2、PRRSV这些对养猪业发展有着严重危害的病原体，为证明连花清瘟药渣具有开发成饲料原料或中草药下游产品提供科学依据。体外抗菌活性测定试验结果表明，连花清瘟药渣及发酵产物提取物对实验菌株表现出抑制作用，但抑菌活性存在差异，具体表现为同一发酵产物的不同方式提取物对某个致病菌的抑菌效果不同，不同发酵产物的相同方式提取物对某个致病菌的抑菌活性不同，同一提取物对不同菌株的抑菌活性也不同。其中LHQW-AL和LHQW-W对ETEC无抑制效果；对HPS的抑制效果略强于SS2，LHQW-AL对SS2和HPS的MIC均为0.046 875 mg·mL-1，MBC分别为0.375和0.093 75 mg·mL-1。LHQW-W对SS2和HPS的MIC分别为0.375和0.75 mg·mL-1，MBC分别为12和3 mg·mL-1。经自然发酵、4MYL、Y4ML三种发酵方式的发酵药渣产生了新的抑菌活性物质，并对ETEC产生了抑制效果。从体外抑菌效果来看连花清瘟药渣提取物存在有效治疗猪细菌性呼吸道疾病的可能，药渣经过发酵后治疗猪细菌性呼吸道疾病效果可能得到进一步加强，并可能产生治疗由ETEC引起的细菌性腹泻的作用。体外抗病毒活性测定试验结果表明，连花清瘟药渣中残留有抗PRV、PCV2、PRRSV三种病毒的成分，经过发酵处理能加强药渣残留成分的抗病毒能力，对PRV、PCV2、PRRSV三种病毒均有不错的抗病毒活性，发酵前连花清瘟药渣抗PCV2活性最强，高浓度乙醇提取物可使细胞上清液中PCV2基因比率减少71.90%(P＜0.05)、而细胞上清液中PRV和PRRSV分别减少57.35%(P＜0.05)和7.37%(P＞0.05)；从体外抗病毒活性测定试验结果来看，经自然发酵、4MYL和Y4ML三种发酵方案发酵后连花清瘟药渣中活性物质发生显著改变，其中经自然发酵后抗PRV的活性成分显著增多，抗PRRSV的活性成分显著减少，而抗PCV2的各个活性物质含量有所改变；通过4MYL和Y4ML两种发酵方式发酵后，发酵药渣中抗三种病毒的活性成分均显著增多，无论是乙醇提取物还是水提取物均显著减少了细胞上清液中三种病毒的基因比率。
4 结论连花清瘟药渣及其发酵药渣提取物具有不同程度的抗菌抗病毒作用，在体外能有效抑制猪养殖过程中HPS、SS2等常见的致病菌和病毒，具有开发成动物饲料或饲料添加剂的潜力。
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(编辑 范子娟)