2. 扬州大学兽医学院, 扬州 225009;
3. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009
2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China;
3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
镉(cadmium，Cd)是一种稀有金属，由于其很好的延展性和耐腐蚀性，被广泛用于金属防腐、核工业、电子工业等领域[1]。研究发现，单质Cd没有毒性，但其化合物具有毒性和腐蚀性。随着工业的发展，工业三废的排放日益加重镉污染。而Cd已被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌物质，过量接触镉会导致肾、肺、肝、骨骼、大脑和生殖系统等的损伤[2]。Cd在进入动物体内后，在肝和肾等器官内积聚，破坏蛋白酶系统。此外，Cd在一定程度上会造成骨骼的病变，因为Cd会影响肠道内钙、磷和小分子蛋白质的吸收[3]，长期Cd暴露是骨量流失、骨质疏松的主要原因[4]。长期的Cd暴露还会直接影响成骨细胞和破骨细胞活性，破坏旧骨吸收和新骨形成的平衡[5]。本课题组前期研究发现，Cd通过下调P2X7/PI3K/AKT信号通路，加剧成骨细胞和破骨细胞的分化[6]。Cd通过上调胞内ROS水平，激活大鼠原代成骨细胞中Caspase、MAPK[7]和线粒体p53信号[8]通路，引起成骨细胞凋亡。
金色酰胺醇酯(aurantiamide acetate，AA)也称枸杞酰胺，分子式为C27H28N2O4，是地骨皮提取物的主要成分之一。地骨皮为茄科植物枸杞或宁夏枸杞的干燥根皮，是我国应用历史悠久的药食同源中药材，具有丰富的药理活性，包括抗氧化、抗炎和神经营养活性[9]。枸杞酰胺来源广泛，存在于曲霉属真菌青霉菌[10]和铁线莲[11]、柑橘[12]、芝麻[13]、云南花椒[14]、辣木根[15]、黑藜芦[16]等多种植物中。随着研究的深入，枸杞酰胺的药用价值逐渐被挖掘。研究发现，从豆科植物中提取得到的枸杞酰胺对于乙酰胆碱酯酶有很好的抑制作用，对于阿尔兹海默症的治疗和预防有一定积极作用[17]。从铁线莲中提取得到的枸杞酰胺，可以通过抑制自噬通量在体外和体内抑制恶性胶质瘤的生长[18]。大量研究表明，枸杞酰胺在抗炎、抗菌等方面都有很好的研究价值。枸杞酰胺的抗炎作用源于其调节核因子κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的能力，导致NO和TNF-α产生以及一氧化氮合成酶(iNOS)和环氧化酶2(COX-2)表达的剂量呈依赖性抑制[19]。对于AA是否能够缓解Cd中毒引起的成骨细胞损伤尚未见报道，其中的保护机制也尚不明确。
本研究选择大鼠成骨细胞系ROS1728为体外试验模型。因本课题组前期试验已对AA的预处理时间及浓度进行了筛选。故本次试验使用5 μg·mL-1枸杞酰胺预处理3 h，添加20 μg·mL-1的CdCl2处理6 h后，利用流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP/Δψm)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)，高内涵细胞成像系统分析细胞线粒体纹理指数，Western blot法检测Bcl-2和Bax蛋白表达量，探讨AA在Cd致成骨细胞凋亡中的保护效应。
1 材料与方法 1.1 主要试剂枸杞酰胺，HPLC检测纯度≥98%，购自上海源叶生物科技有限公司，氯化镉(CdCl2·2.5H2O)购自上海苏麓化学试剂有限公司，胎牛血清购自美国GEMINI公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，线粒体膜电位检测试剂盒、活性氧检测试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒、Hoechst 33342染色液、Mito-Tracker Red CMCRos购自碧云天生物技术公司。β-actin(3700)单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司，Bax、Bcl-2单克隆抗体购自Abcam公司。
1.2 主要仪器二氧化碳培养箱、超低温冰箱(Thermo，USA)；LSR Fortessa型流式细胞仪(BD，USA)；电泳仪(Bio-Rad，USA)；5810R型冷冻离心机(Eppendorf，Germany)；高内涵分析系统(PerlinElmer，USA)。
1.3 大鼠成骨细胞系培养与处理试验所用大鼠成骨细胞系ROS1728购自上海复旦大学细胞中心。
取出冻存的ROS1728大鼠成骨细胞，于37 ℃水浴锅中迅速融化，轻柔地将细胞悬液转至无菌离心管中，1 000 r·min-1离心5 min，弃去冻存液，加入含有1%谷氨酰胺、1%青链霉素和10% FBS的DMEN培养基，接种至25 cm2的细胞培养瓶中，置于5% CO2，37 ℃培养箱进行培养，隔日传代。
细胞处理：含5 μg·mL-1枸杞酰胺的无血清DMEM培养基预处理3 h后，添加含有CdCl2的DMEM培养基，使得最终孔内Cd处理浓度为20 μg·mL-1，处理6 h。试验分组：Control、Cd、AA和AA+Cd组。
1.4 流式样品制备将ROS1728细胞用胰酶消化，以5×104·mL-1的密度接种于六孔细胞培养板中，培养至80%~90%贴壁时，经过AA和CdCl2单独或联合处理，经过0.25%胰酶消化后收集细胞，用PBS进行洗涤，根据Annexin Ⅴ-PI凋亡试剂盒、JC-1试剂盒、ROS试剂盒说明书进行相应的荧光标记。细胞悬液经200目筛网过滤至5 mL流式管，并在1 h内上机，分别检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、细胞活性氧，每组3个重复，试验重复3次。
参照Annexin V-PI凋亡试剂盒说明书检测细胞凋亡率。加入100 μL Binding Buffer重悬细胞，添加5 μL Annexin V-FITC避光常温孵育15 min，再添加5 μL PI避光常温孵育5 min，最后加入400 μL Binding Buffer终止反应，1 h内完成流式检测分析。
参照JC-1试剂盒的说明书检测线粒体膜电位。加入1 mL的JC-1染色工作液，置于37 ℃摇床孵育30 min。4 ℃，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，细胞用预先配制的染色缓冲溶液洗涤两次后，加入培养基重悬细胞，上机检测。
参照ROS试剂盒的说明书检测细胞内ROS含量。加入1 mL浓度为10 μmol·L-1的DCFH-DA工作液，37 ℃避光孵育30 min，每隔5 min颠倒摇匀细胞悬液。4 ℃，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，无血清培养液漂洗细胞1~2次，培养基重悬细胞后上机检测。
1.5 Western blot检测相关蛋白表达将ROS1728细胞用胰酶消化，以5×106·孔-1的密度接种于六孔细胞培养板中，培养至80%~90%贴壁时，更换含5 μg·mL-1枸杞酰胺的无血清的DMEM培养基。处理3 h后，更换Cd浓度为20 μg·mL-1的DMEM培养基。Cd处理6 h后，收集细胞，用含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞并超声后，4 ℃，12 000 r·min-1离心收集上清蛋白样品，随后BCA法调节蛋白浓度至一致，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(1∶4)，100 ℃加热10 min。将蛋白样品用12%SDS-PAGE胶电泳分离后转印到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭2 h，加入含5% BSA TBST缓冲液配制的一抗(Bcl-2、Bax和β-actin抗体，1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗涤PVDF膜5次(5 min·次-1)，加入HRP标记的二抗(1∶5 000)，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗涤5次(5 min·次-1)。ECL显色，化学发光图像分析仪拍摄照片，Image Lab软件计算灰度值。试验重复3次以上。
1.6 高内涵样品制备将ROS1728细胞用胰酶消化，以1×104·孔-1的密度接种于96孔板中，贴壁后更换含5 μg·mL-1枸杞酰胺的无血清的DMEM培养基，分组如下：Control组、Cd处理组、AA处理组、AA+Cd处理组。每组3个重复，试验重复3次。处理3 h后，弃掉培养基，每孔加入适量Mito Tracker Red染色液，37 ℃避光孵育20 min，使用无菌PBS洗涤3次。加入Cd浓度为20 μg·mL-1的DMEM培养基，使用高内涵细胞成像系统拍摄。
1.7 数据统计分析试验数据采用IBM SPSS Statistics 25软件进行单因素方差分析，结果以“x±s”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 Cd对ROS1728凋亡率的影响及AA的保护作用结果如图 1所示，20 μg·mL-1 CdCl2作用ROS1728细胞6 h后，与对照组相比，Cd处理组细胞凋亡率极显著升高(P < 0.01)，与Cd处理组相比，AA与Cd联合处理组细胞凋亡率极显著下降(P < 0.01)。
|
*. P < 0.05，**. P < 0.01，下同 *. P < 0.05, **. P < 0.01. The same as below 图 1 Cd对ROS1728细胞凋亡率的影响及AA的保护效应 Fig. 1 The effect of Cd on apoptotic rate of ROS1728 cells and protective effect of AA |
如图 2结果显示，作为线粒体膜电位探针，JC-1在线粒体膜电位下降时，JC-1由聚体形式变为单体形式，其荧光由PE红色荧光变为FITC绿色荧光，线粒体膜电位下降越多，单体含量越高。结果分析表明，经浓度为20 μg·mL-1的CdCl2作用后，ROS1728细胞线粒体膜电位与对照组极显著下降(P < 0.01)；与Cd处理组相比，AA与Cd共处理组，AA极显著地抑制了Cd致线粒体膜电位的下降(P < 0.01)。
|
图 2 Cd对ROS1728细胞线粒体膜电位的影响及AA的保护效应 Fig. 2 The effect of Cd on mitochondrial transmembrane potential of ROS1728 cells and protective effect of AA |
荧光染料DCFH-DA荧光强度变化作为检测细胞活性氧水平的最常用方法，当DCFH-DA进入细胞后，被胞内活性氧氧化成有绿色荧光的DCF，活性氧水平越高，绿色荧光越强。结果如图 3所示，与对照组相比，20 μg·mL-1 CdCl2作用ROS1728细胞6 h后，细胞ROS峰向右偏移，即ROS含量极显著升高(P < 0.01)；与Cd处理组相比，AA与Cd共处理组ROS显著降低(P < 0.05)。
|
图 3 Cd对ROS1728细胞ROS的影响及AA的保护效应 Fig. 3 The effect of Cd on ROS in ROS1728 cells and protective effect of AA |
20 μg·mL-1CdCl2作用ROS1728细胞6 h后，与对照组相比，Bax表达量上升，Bcl-2表达量下降，分析灰度值结果显示, Bax/Bcl-2比值极显著升高(P < 0.01)；与Cd处理组相比，AA和Cd联合处理组Bax/Bcl-2比值显著下降(P < 0.05)，结果如图 4。
|
图 4 Cd对ROS1728细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响及AA的保护效应 Fig. 4 The effect of Cd on protein levels of Bcl-2 and Bax in ROS1728 cells and protective effect of AA |
利用Mito Tracker Red荧光染料对细胞线粒体结构进行染色，该染料能与活细胞中的线粒体结合，正常细胞内线粒体结构呈网状分布，而凋亡细胞线粒体染色后会出现固缩，网状结构消失。结果如图 5所示，与对照组相比，20 μg·mL-1 CdCl2作用的0~6 h内，线粒体纹理结构逐渐模糊，荧光强度逐渐升高；与Cd单独处理组相比，AA与Cd联合处理组线粒体网状纹理机构清晰，荧光强度无明显变化。
|
图 5 Cd对ROS1728细胞线粒体纹理结构的影响及AA的保护效应 Fig. 5 The effect of Cd on mitochondrial structure in ROS1728 cells and protective effect of AA |
通过高内涵细胞成像系统Harmony软件分析，经20 μg·mL-1 CdCl2作用的0~6 h后，ROS1728细胞线粒体纹理指数呈时间依赖性下降趋势；与对照组相比，AA单独处理组的线粒体纹理指数基本一致；AA和Cd共处理组的线粒体纹理指数在各时间点均高于Cd单独处理组，与Cd处理组相比，AA与Cd联合处理组线粒体纹理指数高于Cd处理组。结果表明，AA抑制了Cd对ROS1728细胞线粒体纹理结构的损伤作用。
3 讨论Cd作为一种严重危害动物健康和环境污染物，其生物蓄积性强，半衰期较长，生物毒性大，可通过饮水和饮食的方式在动物体内富集，造成多器官的损伤，甚至诱发癌症[20]。骨骼的动态平衡在骨重塑过程中起重要的作用，任何失衡都可能会导致骨骼疾病的发生。成骨细胞的分化程度、更新率和寿命是调控骨重塑的关键因素[21]。骨骼作为Cd的主要靶器官，长期的Cd暴露会导致骨代谢性疾病，如骨质疏松症、骨关节炎和骨软化症[22]等。研究发现，Cd可以抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化，并直接导致骨髓间充质干细胞凋亡。在骨质疏松症的情况下，Cd主要影响破骨细胞的活化，并促进骨吸收。Cd通过导致DNA损伤、线粒体功能障碍和内质网应激，引起成骨细胞发在氧化应激，最终导致成骨细胞凋亡[23]。早期研究认为，Cd通过影响肾，导致维生素D合成受损，从而间接影响骨骼健康。现在越来越多的证据表明，Cd对成骨细胞有直接损伤作用[24]，Cd可以直接降低MC3T3细胞的存活率和骨修复能力。
氧化应激作为骨质疏松的重要诱因，与骨细胞的凋亡密切相关。凋亡作为一种程序性死亡方式，对维持机体稳态至关重要。非正常的凋亡会导致ROS含量升高，进一步加剧细胞凋亡。本试验结果显示，ROS1728细胞在20 μg·mL-1 Cd中暴露6 h后，凋亡率显著升高，胞内ROS含量显著上升，MMP显著下降，线粒体纹理结构变模糊且纹理指数下降，Bax/Bcl-2比值显著增加。Cd暴露后胞内ROS水平升高，酶系统被破坏，过氧化物酶等抗氧化酶含量和活性下降。此外，Cd暴露引起线粒体损伤，导致线粒体电子传递链的变化和线粒体结构完整性被破坏，影响促/抑凋亡的Bcl-2家族蛋白表达，最终破坏胞内氧化还原平衡，导致成骨细胞凋亡。
我国传统药食同源中药材——地骨皮有多种化学成分，包括生物碱、有机酸其酯、苯丙素、蒽醌等，能凉血除蒸、清肺降火, 具有降血压、降血糖、抑菌抗炎、解热镇痛等疗效[9]。据明代王肯堂《证治准绳》中记载的“清骨散”，以地骨皮入药，可用于治疗骨痨(骨和关节结核)[25]。李玉萍[26]在研究黄芪寄生汤对于肝肾气血亏虚型膝骨关节炎的临床疗效时发现，在中药汤剂中，添加鸡血藤、地龙、地骨皮、川牛膝等药材，能有利于舒筋通络、散瘀止痛。随着科学技术的不断发展和进步，对中草药中生物活性成分的解析不断完善，研究发现，地骨皮里的AA对于大鼠关节炎后足肿胀有明显的缓解作用[11]。从铁线莲中提取得到的AA能够很好地抑制LPS诱导的NO和PGE2水平升高[27]。AA作为抗病毒和抗炎候选药物拥有巨大的潜力。Zhou等[28]研究发现，虎杖根中分离的AA能够有效抑制甲型流感病毒在MDCK细胞中的复制，阻断NF-κB信号通路的激活，降低感染后的细胞中促炎基因的转录水平。目前，有关AA防治骨骼代谢性疾病的机理研究较少，而AA在成骨细胞凋亡过程中的调控机制尚不明确。本研究发现，AA预处理可以有效缓解Cd导致的大鼠成骨细胞ROS1728凋亡率和Bax/Bcl-2比值升高，MMP和纹理指数下降，胞内ROS蓄积。
4 结论AA对于维持成骨细胞氧化还原平衡和线粒体结构完整性具有一定的积极作用，能够抑制Cd导致的成骨细胞ROS1728凋亡。本研究结果将为AA应用于临床预防骨骼代谢性疾病提供理论依据，但其具体作用机理还有待进一步的挖掘和探讨。
| [1] |
黄吉厚. 镉对环境的污染及其对策研究[J]. 辽宁教育学院学报, 2000, 17(5): 29-31. HUANG J H. Studies on environmental pollution of cadmium and its countermeasures[J]. Journal of Shenyang Normal University Educational Science Edition, 2000, 17(5): 29-31. (in Chinese) |
| [2] |
NORDBERG G. Cadmium and human health: a perspective based on recent studies in China[J]. J Trace Elem Exp Med, 2003, 16(4): 307-319. DOI:10.1002/jtra.10039 |
| [3] |
ENGSTRÖM A, SKERVING S, LIDFELDT J, et al. Cadmium-induced bone effect is not mediated via low serum 1, 25-dihydroxy vitamin D[J]. Environ Res, 2009, 109(2): 188-192. DOI:10.1016/j.envres.2008.10.008 |
| [4] |
CHEN X, REN S, ZHU G Y, et al. Emodin suppresses cadmium-induced osteoporosis by inhibiting osteoclast formation[J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2017, 54: 162-168. DOI:10.1016/j.etap.2017.07.007 |
| [5] |
XIE D D, SHENG Z F. Low-level cadmium exposure and bone health[J]. J Bone Miner Res, 2017, 32(2): 419. DOI:10.1002/jbmr.3049 |
| [6] |
MA Y G, RAN D, ZHAO H Y, et al. Cadmium exposure triggers osteoporosis in duck via P2X7/PI3K/AKT-mediated osteoblast and osteoclast differentiation[J]. Sci Total Environ, 2021, 750: 141638. DOI:10.1016/j.scitotenv.2020.141638 |
| [7] |
ZHAO H Y, LIU W, WANG Y, et al. Cadmium induces apoptosis in primary rat osteoblasts through caspase and mitogen-activated protein kinase pathways[J]. J Vet Sci, 2015, 16(3): 297-306. DOI:10.4142/jvs.2015.16.3.297 |
| [8] |
ZHENG J M, ZHUO L L, RAN D, et al. Cadmium induces apoptosis via generating reactive oxygen species to activate mitochondrial p53 pathway in primary rat osteoblasts[J]. Toxicology, 2020, 446: 152611. DOI:10.1016/j.tox.2020.152611 |
| [9] |
马天宇, 王磊, 金铃和, 等. 地骨皮化学成分及生物活性研究[J]. 中国果菜, 2018, 38(5): 9-13. MA T Y, WANG L, JIN L H, et al. Research progress on chemical constituents and biological actions of cortex Lycii[J]. China Fruit & Vegetable, 2018, 38(5): 9-13. (in Chinese) |
| [10] |
YOON C S, KIM D C, LEE D S, et al. Anti-neuroinflammatory effect of aurantiamide acetate from the marine fungus Aspergillus sp. SF-5921: inhibition of NF-κB and MAPK pathways in lipopolysaccharide-induced mouse BV2 microglial cells[J]. Int Immunopharmacol, 2014, 23(2): 568-574. DOI:10.1016/j.intimp.2014.10.006 |
| [11] |
LIU X B, YANG B X, ZHANG L, et al. An in vivo and in vitro assessment of the anti-inflammatory, antinociceptive, and immunomodulatory activities of Clematis terniflora DC. extract, participation of aurantiamide acetate[J]. J Ethnopharmacol, 2015, 169: 287-294. DOI:10.1016/j.jep.2015.04.009 |
| [12] |
BISSIM S M, KENMOGNE S B, LOBE J S, et al. The chemistry and biological activities of Citrus clementina Hort. Ex Tanaka (Rutaceae), a vegetatively propagated species[J]. Nat Prod Res, 2021, 35(22): 4839-4842. DOI:10.1080/14786419.2020.1731740 |
| [13] |
胡永美, 叶文才, 殷志琦, 等. 芝麻花化学成分的研究[J]. 药学学报, 2007, 42(3): 286-291. HU Y M, YE W C, YIN Z Q, et al. Chemical constituents from Flos Sesamum indicum L.[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2007, 42(3): 286-291. DOI:10.3321/j.issn:0513-4870.2007.03.010 (in Chinese) |
| [14] |
DENG Y, DING T T, DENG L L, et al. Active constituents of Zanthoxylum nitidium from Yunnan Province against leukaemia cells in vitro[J]. BMC Chem, 2021, 15(1): 44. DOI:10.1186/s13065-021-00771-0 |
| [15] |
SASHIDHARA K V, ROSAIAH J N, TYAGI E, et al. Rare dipeptide and urea derivatives from roots of Moringa oleifera as potential anti-inflammatory and antinociceptive agents[J]. Eur J Med Chem, 2009, 44(1): 432-436. DOI:10.1016/j.ejmech.2007.12.018 |
| [16] |
赵伟杰. 乌苏里藜芦中橙黄胡椒酰胺的分离鉴定[J]. 中国中药杂志, 1998, 23(1): 41. ZHAO W J. Isolation and structure determination of aurantiamide acetate from Veratrum nigrum L. var. ussuriense Nakai[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 1998, 23(1): 41, 63. (in Chinese) |
| [17] |
ALVES C Q, LIMA L S, DAVID J M, et al. In vitro acetylcholinesterase activity of peptide derivatives isolated from two species of Leguminosae[J]. Pharm Biol, 2013, 51(7): 936-939. DOI:10.3109/13880209.2013.770536 |
| [18] |
YANG Y, ZHANG L H, YANG B X, et al. Aurantiamide acetate suppresses the growth of malignant gliomas in vitro and in vivo by inhibiting autophagic flux[J]. J Cell Mol Med, 2015, 19(5): 1055-1064. DOI:10.1111/jcmm.12498 |
| [19] |
WANG H W, GAO S F, LI J M, et al. Hybrids of aurantiamide acetate and isopropylated genipin as potential anti-inflammatory agents: The design, synthesis, and biological evaluation[J]. Chem Biol Drug Des, 2021, 97(4): 797-808. DOI:10.1111/cbdd.13809 |
| [20] |
余超, 张维蔚, 梁伯衡, 等. 广州市市售普洱茶镉元素残留现状及分布差异[J]. 职业与健康, 2016, 32(9): 1208-1211. YU C, ZHANG W W, LIANG B H, et al. Cadmium residual status in commercially available Pu'er tea and its distribution difference in Guangzhou City[J]. Occupation and Health, 2016, 32(9): 1208-1211. (in Chinese) |
| [21] |
MANOLAGAS S C. Birth and death of bone cells: Basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis[J]. Endocr Rev, 2000, 21(2): 115-137. |
| [22] |
LV Y J, WANG P, HUANG R, et al. Cadmium exposure and osteoporosis: a population-based study and benchmark dose estimation in Southern China[J]. J Bone Miner Res, 2017, 32(10): 1990-2000. |
| [23] |
MA Y G, RAN D, SHI X N, et al. Cadmium toxicity: a role in bone cell function and teeth development[J]. Sci Total Environ, 2021, 769: 144646. |
| [24] |
LIZOTTE J, ABED E, SIGNOR C, et al. Expression of macrophage migration inhibitory factor by osteoblastic cells: protection against cadmium toxicity[J]. Toxicol Lett, 2012, 215(3): 167-173. |
| [25] |
冯居平, 符保军. 中药内外合治骨痨26例[J]. 河南中医学院学报, 2007, 22(4): 71-72. FENG J P, FU B J. 26 cases of bone TB with therapeutical order of Chinese medicine[J]. Journal of Henan University of Chinese Medicine, 2007, 22(4): 71-72. (in Chinese) |
| [26] |
李玉萍. 黄芪寄生汤治疗肝肾气血亏虚型膝骨关节炎的临床体会[J]. 人人健康, 2022(13): 87-89. LI Y P. Clinical experience of Huang Qi Jisheng decoction in the treatment on knee osteoarthritis with Liver-Kidney Qi and blood deficiency type of syndrome[J]. Health for Everyone, 2022(13): 87-89. (in Chinese) |
| [27] |
OZBEN B, ERDOGAN O. The role of inflammation and allergy in acute coronary syndromes[J]. Inflamm Allergy Drug Targets, 2008, 7(3): 136-144. |
| [28] |
ZHOU B X, YANG Z F, FENG Q T, et al. Aurantiamide acetate from baphicacanthus cusia root exhibits anti-inflammatory and anti-viral effects via inhibition of the NF-κB signaling pathway in Influenza A virus-infected cells[J]. J Ethnopharmacol, 2017, 199: 60-67. |
(编辑 白永平)