溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的两种主要形式之一，其发病机制尚不清楚，通常认为与遗传、环境、免疫系统紊乱、肠道菌群失调等因素密切相关[1]。常见症状包括腹泻、直肠出血、里急后重和腹痛[2-3]。目前，临床上通常使用抗生素、止血剂、吸附剂等治疗犬UC，但多数情况下基本无效[4]。最近有研究表明，黏膜愈合是UC的理想治疗目标[5]，但常用的UC治疗的药物不能直接诱导黏膜愈合[6]。因此，开发新的安全有效的UC用药仍然是目前需要解决的问题。
增益素是一种具有免疫增强作用的生物活性物质，是从α-溶血性链球菌培养液中提取的α-甘露聚糖肽类物质[7]。西安泰乐星科技有限公司在原有“多抗甲素”(polyactin A，PAA)的基础上，利用太空搭载技术对其进行菌种诱变和选育后，使其生物活性提高了3倍~5倍，具有保护修复黏膜上皮细胞、调节肠道菌群、调节免疫功能等作用[8-9]。王虹雅等[10]研究表明，增益素能够促进雏鸡的生长发育和免疫器官发育，增强抗体应答能力。袁进升等[11]研究显示，预饲增益素可促进鸡传染性法氏囊病病毒感染鸡的T淋巴细胞活化。此外，在人医临床上还有研究表明，甘露聚糖肽干预治疗UC能够改善患者的临床症状，降低结直肠黏膜病变、减少黏膜糜烂、溃疡、水肿等体征[12]。目前，对增益素的研究主要集中在其对畜禽免疫功能调节和免疫器官发育的影响，尚未有研究探索其对UC犬的影响。因此，本试验以UC造模犬为研究对象，探究饲粮添加增益素对UC犬免疫功能、肠道屏障和肠道菌群的影响，为临床使用增益素辅助治疗UC提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料与主要仪器及试剂试验用基础饲粮、含0.1%和0.2%增益素的饲粮均购于北京宇顺智霖技术开发有限责任公司。番泻叶购于毫州市伯乐美生物科技有限公司，酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒均购于江苏酶免实业有限公司。
1.2 试验动物与分组将24只10~11月龄的比格犬(由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供)随机分为4组，分别为对照组、模型组、低剂量组和高剂量组，每组6只犬。试验开始前所有犬先饲喂基础饲粮10 d，将预饲期结束后的第1天定义为试验第0天，试验周期为50 d。试验期间所有犬单笼饲养，自由饮水，对照组和模型组每日早晚分别饲喂基础饲粮300 g，低剂量组和高剂量组在基础饲粮中添加1 000和2 000 mg·kg-1增益素，基础饲粮组成及营养成分见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient Level of experimental dog diet (air-dried basis) |
1.3.1 番泻叶提取液制备 按文献[13]提供的方法，取番泻叶300 g浸泡于2 L蒸馏水中，静置4 h后，置于电磁炉上加热至沸腾，之后改为小火保持微微沸腾30 min，待药液冷却后使用双层纱布过滤，保留药液，再次加蒸馏水浸没药渣，重复上述煎煮过程，合并两次过滤后的药液，用小火浓缩至300 mL，即得1 g·mL-1的番泻叶提取液，置于4 ℃冰箱备用。
1.3.2 冰醋酸造模 所有犬在造模前饲喂2 mL·kg-1的番泻叶提取液，清洁肠道，并禁食不禁水24 h后，试验第0天按文献[14]提供的方法，模型组、低剂量组和高剂量组犬使用聚乙烯导管插入直肠20 cm处，缓慢灌入7%的冰醋酸(2 mL·kg-1，纯度≥99.5%)，保持头低尾高姿势15 s后，用50 mL生理盐水将冰醋酸冲洗排出，对照组直肠灌注相应剂量的生理盐水作为空白对照。
1.4 内窥镜检查造模24 h后及试验第49天各组随机选取1只犬进行内窥镜检查，将试验犬使用丙泊酚进行诱导麻醉后，异氟烷吸入麻醉，用电子内窥镜观察结肠黏膜是否出现溃疡、溃烂和出血等，并使用活体取样钳对犬结肠病变部位进行取样，置于10%甲醛中固定。
1.5 样本采集试验第49天，在早上饲喂前经前肢头静脉采集所有犬的血液，将5 mL血液置于促凝管中静置20~25 min后于3 000 r·min-1离心15 min，分离血清于-20 ℃保存。同时，无菌采集犬新鲜粪便(15 min内)放置于无菌粪便采集管中，样品采集完后置于-20 ℃保存。
1.6 指标测定1.6.1 临床症状观察及腹泻率测定 试验期间每日早晨定时观察并记录各组试验犬精神状态、粪便性状及腹泻情况，计算腹泻率。
| $ \begin{array}{*{20}{c}} {\text{腹泻率(%)=100×累计腹泻动物数/ }}\\ {\text{(试验动物数×试验天数)}} \end{array} $ |
1.6.2 病理切片 将组织从固定液中取出，将组织脱水浸蜡后放入包埋机内进行包埋、切片，随后将石蜡切片脱蜡水洗、HE染色，置于显微镜下镜检，采集图像并分析。
1.6.3 血清炎性细胞因子含量测定 取第49天试验犬血清采用ELISA法检测血清中IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α含量，按照试剂盒说明书进行操作。
1.6.4 血清IgG含量及粪便中SIgA检测 取第49天试验犬血清，采用ELISA法检测血清中IgG含量，称取1.0 g粪便置于15 mL离心管中于室温解冻后，加入9 mL无菌生理盐水，振荡混匀，3 000 r·min-1离心20 min后，分离上清液，采用ELISA法检测粪便中SIgA含量，按照试剂盒说明书进行操作。
1.6.5 肠道功能指标测定 取第49天试验犬血清采用ELISA法检测血清中二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸和LPS含量，按照试剂盒说明书进行操作。
1.6.6 肠道菌群16S rDNA测序 从-20 ℃称取0.25~0.50 g粪便，使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA试剂盒提取犬粪便基因组DNA，并使用酶标仪对提取的核酸进行浓度检测。之后对粪便菌群的16S rRNA基因的V3~V4区进行扩增，使用引物序列：上游引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，25个循环；70 ℃延伸7 min；4 ℃保存。之后对PCR扩增产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，并使用Illumina Novaseq 6000进行测序，将得到的测序质量信息通过质量过滤，双端序列拼接和去除嵌合体后得到最终有效数据，并进行生物信息学分析。
1.7 数据分析使用EXCEL 2019对试验数据进行初步处理后，使用SPSS 21.0软件进行统计分析，采用χ2检验进行各组间腹泻率比较，采用单因素方差分析和LSD法进行血液学相关指标差异性比较。P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著，0.05≤P < 0.1表示有显著性趋势。
2 结果 2.1 试验犬临床观察对照组犬精神状态、饮食正常、无腹泻及便血情况。其余各组试验犬在造模24 h后均出现里急后重、频频回头顾腹、不安、粪便不成形且带血的临床症状。造模后第5天模型组、低剂量组和高剂量组犬食欲及便血情况逐渐改善，整个试验期间3组间腹泻率无显著差异(P>0.05)，但相较于模型组，低剂量组和高剂量组腹泻率有下降趋势(表 2)。
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表 2 增益素对犬腹泻率的影响 Table 2 Effects of new immune regulator (polyactin A) on diarrhea rate in dogs |
造模24 h后模型组、低剂量组和高剂量组犬呈现里急后重、频频回头顾腹、不安、粪便不成形、带血，且内窥镜检查结果显示，这3组犬肠道黏膜充血水肿、有明显溃疡(图 1左)；试验第49天，各组试验犬内窥镜检查结果无明显异常(图 1右)。
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M.模型组；L.低剂量组；H.高剂量组；C. 对照组。下图同 M. Model group; L. Low-dose group; H. High-dose group; C. Control group. The same as below 图 1 造模24 h、试验第49天结肠内窥镜检查结果 Fig. 1 Colon endoscopy results at 24 h after modeling and on day 49 of the trial |
如图 2所示，造模24 h后组织病理学检查结果显示，对照组肠腺排列疏松，伴有淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，未见黏膜溃疡、糜烂；模型组、低剂量组、高剂量组黏膜溃疡、糜烂，黏膜上皮坏死脱落，肠腺坏死，伴有淋巴细胞为主的炎性细胞浸润。如图 3所示，试验第49天组织病理学检查结果显示，与对照组比，模型组中可见黏膜水肿、少量中性粒细胞浸润、结缔组织增生及肠腺数量减少；与模型组比，低、高剂量组中性粒细胞浸润有不同程度的减少，低剂量组仅局部出现少量中性粒细胞浸润，高剂量组呈点状中性粒细胞浸润。
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图 2 各组试验犬造模24 h后结肠黏膜组织切片结果(HE染色，23×) Fig. 2 Results of colonic mucosal tissue sections 24 h after modeling in each group of dogs (HE stain, 23×) |
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图 3 各组试验犬第49天结肠黏膜组织切片结果(HE染色，21×) Fig. 3 Results of colonic mucosal tissue section on day 49 in each group of dogs (HE stain, 21×) |
由图 4可知，与对照组比，模型组IL-6含量显著升高(P < 0.05)、IL-10含量极显著降低(P < 0.01)。与模型组比，低剂量组和高剂量组IL-6含量显著降低(P < 0.05)，且高剂量组IL-6含量与模型组差异极显著(P < 0.01)；同样，低剂量组和高剂量组IL-10含量显著高于模型组(P < 0.05)；各组间IL-17、TNF-α含量无显著差异(P>0.05)。表明两个剂量的增益素均可使促炎因子含量减少、抑炎因子含量升高，且添加高剂量增益素组效果较好。
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数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，标注不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)。下图同 Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05), and those with different capital letters mean extremely significant difference (P < 0.01). The same as the following figures 图 4 增益素对犬血清炎性细胞因子的影响 Fig. 4 Effects of new immune regulator (polyactin A) on serum inflammatory cytokines in dogs |
由图 5可知，与对照组比，模型组粪便中SIgA含量无显著差异(P>0.05)；与模型组比，低剂量组、高剂量组粪便中SIgA含量显著升高(P < 0.05)，其中，高剂量组与模型组差异极显著(P < 0.01)；各组间IgG含量无显著性差异(P>0.05)，但低剂量组IgG含量与模型组比有升高趋势(P=0.06)。表明犬粮中添加两个剂量的增益素均可使粪便中SIgA含量升高，且添加高剂量效果较好。
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图 5 增益素对犬血清IgG和粪便中SIgA含量的影响 Fig. 5 Effects of new immune regulator (polyactin A) on serum IgG and feces SIgA levels in dogs |
由图 6可知，与对照组相比，模型组犬血液LPS水平显著升高(P < 0.05)；与模型组比，低剂量组的LPS水平显著降低(P < 0.05)，高剂量组血清DAO含量显著降低(P < 0.05)。各组间的D-乳酸含量无显著性差异(P>0.05)。表明两个剂量的增益素均可改善肠道屏障功能。
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图 6 增益素对犬肠道功能指标的影响 Fig. 6 Effects of new immune regulator (polyactin A) on intestinal barrier function indicators in dogs |
2.7.1 各组试验犬OUT数量和Beta多样性 由图 7可知，各组试验犬OUT数无显著差异(P>0.05)。由图 8可知，与对照组比，模型组肠道微生物组成差异显著(P < 0.05)，低剂量组、高剂量组肠道微生物组成差异极显著(P < 0.01)；与模型组比，低剂量组差异不显著(P>0.05), 高剂量组肠道微生物组成差异极显著(P < 0.01)。结果表明，增益素的使用可以显著改变肠道微生物的组成。
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图 7 各组试验犬OUT数 Fig. 7 OUT number of experimental dogs in each group |
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图 8 基于OUT丰度的主坐标分析的各组试验犬肠道菌群组成差异 Fig. 8 Differences in intestinal microflora composition of experimental dogs based on Principal coordinates analysis of OUT abundance |
2.7.2 LEfSe[line discriminant analysis (LDA) effect size]分析 由图 9可知，与对照组、低剂量组、高剂量组比，模型组Lachnospiraceae显著增加；与模型组比，高剂量组Veillonellaceae、Selenomonadales、Turicibacter、Allisonella和Megasphaera显著增加，低剂量组Ruminiclostridium显著增加。
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图 9 增益素对犬肠道菌群差异性的影响(LEfSe分析) Fig. 9 Effect of new immune regulator (polyactin A) on the difference of intestinal microbiota in dogs (LEfSe analysis) |
冰醋酸诱导UC的发病机制主要是质子化形式的酸在细胞内释放出质子导致大量细胞内酸化，造成上皮细胞损伤，但这种上皮损伤是有机酸导致的相对特异性反应，因为在相似的pH下，盐酸并不会引起类似的损伤[15-16]。乙酸可破坏肠道屏障，同时激活环氧合酶和脂氧合酶进而启动结肠的炎症反应[14]。在犬UC模型方面，朱国等[17]采用10%乙酸成功建立犬急性结肠炎，陈丽等[14]分别使用4%、7%和10%乙酸建立犬溃疡性结肠炎，发现7%和10%乙酸均可成功造模，但10%乙酸会导致肠穿孔。综上，本研究中最终选择使用2 mL·kg-1 7%的乙酸进行造模。UC的诊断需要综合考虑临床症状、内窥镜、组织学检查结果。内窥镜检查在评估疾病严重程度方面是必不可少的，结合活检的内窥镜检查是确定UC的唯一方法[2]，UC内窥镜检查常表现为红斑、正常血管模式丧失、呈现颗粒感、质脆、出血和溃疡[18-19]，组织病理学检查结果主要包括隐窝结构紊乱、炎性细胞浸润、上皮变化等。本研究中造模24 h后内窥镜检查结果显示，试验犬肠道黏膜充血水肿、有明显溃疡，组织病理学检查结果显示，犬黏膜溃疡、糜烂，黏膜上皮坏死脱落，肠腺坏死，伴有淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，这与前人研究结果相类似[14, 17]，提示此次试验成功建立犬急性UC模型。对于造模24 h后组织学检查结果中对照组犬出现炎性细胞浸润和肠腺排列疏松考虑是直肠灌注时对肠道产生机械性损伤造成轻微炎症所致。试验第49天各组间内窥镜结果虽无显著差异，但组织病理学检查结果显示，与模型组比，低剂量组和高剂量组炎性细胞浸润减少，提示增益素的使用可缓解UC犬结肠组织病理损伤。
3.2 增益素对犬血清炎性细胞因子和粪便中SIgA的影响虽然目前UC的确切发病机制尚不清楚，但已有大量研究表明，炎性细胞因子在结肠炎的发生、发展过程中起着重要作用，其中，促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡对人体健康状况至关重要[20]，促炎因子IL-6主要通过影响肠上皮细胞的分泌功能来诱导或加重UC[21]。IL-10是一种由造血细胞产生的抗炎细胞因子，在调节肠道内环境稳态中起关键作用[22]。结肠屏障功能受损后可导致出现结肠炎症，诱导大量炎症细胞浸润结肠，这些炎症细胞产生的炎症细胞因子会进一步恶化结肠炎症[23]，此外，炎症细胞因子对肠道通透性也有一定的影响，促炎因子可增加上皮细胞旁通透性、破坏紧密连接蛋白、诱发炎症反应损伤肠道黏膜，抗炎因子能够拮抗促炎因子的作用降低肠道上皮通透性[24-25]。因此抑制促炎因子，增加抗炎因子，调节肠道免疫和肠道菌群被认为是抑制UC的有效途径[26]。为此，成功建立UC模型后，作者研究了增益素对UC犬细胞因子的影响，研究结果显示，两种剂量增益素均能显著降低IL-6含量，增加IL-10含量，这与陈焕玲[27]使用甘露肽聚糖治疗UC的研究结果相似。
SIgA是肠黏膜免疫的主要效应因子，能够中和肠黏膜中的病原体，维持与共生菌群的稳态，在局部感染中发挥重要作用[28-29]。研究表明，UC患者的肠道黏膜SIgA显著低于正常人群，可能是由于肠道黏膜损伤造成肠道通透性增加，肠道内细菌、毒素等抗原成分吸收增加，产生一系列免疫反应与炎症变化，最终导致组织破坏[30]。蒋华英[31]的研究显示，使用甘露聚糖肽治疗反复性呼吸道感染患儿可使其血清中IgA水平升高。此外，刘忠山等[32]也报道了甘露聚糖肽可使头颈部肿瘤患者血清中IgA含量升高。本研究中低剂量组和高剂量组粪便中SIgA含量显著高于模型组，提示增益素的使用可增强UC犬的肠黏膜免疫。以上结果提示，增益素能够通过降低促炎因子浓度、增加抑炎因子和SIgA浓度，对UC引起的肠道损伤起到缓解作用。
3.3 增益素对肠道屏障功能指标的影响肠道屏障由物理屏障、化学屏障、免疫屏障及微生物屏障共同组成，其中，物理屏障是由肠黏膜上皮细胞及其紧密连接等组成的完整的彼此紧密连接的肠道上皮结构。DAO、D-乳酸和LPS是反映肠道屏障完整性的敏感指标。血浆中DAO活性水平被认为与小肠黏膜上皮细胞的成熟和完整性有关[33]，能够反映肠道物理屏障的完整性和受损程度。当肠道屏障受损时，血清DAO水平会上升。本研究结果显示，饲粮中添加0.2%增益素能够使血清中DAO含量降低。哺乳动物自身不产生D-乳酸，正常情况下，血液中的D-乳酸主要来自于肠道，且含量较低，当肠道黏膜屏障受损时，肠道中的D-乳酸可通过受损黏膜进入血液中，使血液中的D-乳酸含量升高[34]。研究结果显示，各组间D-乳酸含量无显著差异，这与曾晓梅等[35]的研究结果不同，其研究结果表明，美沙拉嗪联合甘露聚糖肽治疗后患者D-乳酸水平比单独使用美沙拉嗪组显著降低。这种差异可能与增益素使用方法和研究物种不同有关。LPS是革兰阴性菌的结构成分，可通过激活TLR4从而刺激机体发生免疫反应[36]。在肠道黏膜屏障功能完整时，细菌和LPS难以进入血液循环，当肠道黏膜屏障受损时，血清中LPS浓度会上升。本研究结果显示，添加低剂量的增益素可使犬血清中的LPS含量显著下降，但饲粮中添加高剂量的增益素与模型组无显著差异，这一结果表明，不同剂量增益素作用的效果可能不一样。以上结果提示，增益素能够改善UC犬肠道物理屏障功能。
3.4 增益素对犬肠道菌群的影响肠道微生物在IBD中起着至关重要的作用，可作为IBD新的治疗靶点。因此，作者进一步研究了增益素对UC犬肠道菌群的影响。基于OUT水平的主坐标分析结果显示，冰醋酸造模后，低剂量组、高剂量组与对照组的差异极显著(P < 0.01)，而与低剂量组和高剂量组相比，模型组更加接近对照组，这可能是由于试验周期较长，长期使用增益素导致肠道菌群改变。Lachnospiraceae虽然是短链脂肪酸的主要产生者之一，但是部分Lachnospiraceae的分类群已被证明与肠内外疾病有关[37]，在1型糖尿病、非酒精性脂肪肝和慢性肾病患者中均发现了Lachnospiraceae丰度增加[38-40]。本研究中发现UC犬的Lachnospiraceae丰度显著高于对照组和添加剂组，Guo等[41]在小鼠模型上也报道了类似的情况。与本研究不同的是，Frank等[42]的研究发现UC和克罗恩病患者Lachnospiraceae丰度显著低于正常人群。这提示Lachnospiraceae对于UC患者的作用还需进一步的研究。Megasphaera可通过影响宿主免疫反应调节渗透性腹泻[43]、减轻隐孢子虫感染，是一种免疫介导的腹泻保护机制的潜在生物标志物[44]，Ruminiclostridium是一种严格的厌氧菌，虽然其对宿主生理的影响尚未得到广泛的研究，但是有研究认为其可能对肠脑轴有一定作用[45]。本研究结果显示，饲粮中高剂量增益素可使UC犬中Megasphaera丰度显著增加，低剂量增益素可使UC犬中Ruminiclostridium丰度显著增加，并与对照组无显著差异。以上结果表明，饲粮中添加两种剂量的增益素均可改善UC犬肠道菌群结构，使有益菌丰度增加。
4 结论在本试验条件下，饲喂50 d后，犬粮中添加两种剂量的增益素均可在一定程度上提高急性结肠炎造模犬免疫功能、改善其肠道物理屏障功能及菌群结构，其中，添加2 000 mg·kg-1增益素效果更好，推荐在犬粮中添加2 000 mg·kg-1增益素。
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(编辑 白永平)