, ZHU Qiuxiang, GAO Zhicheng, JIA Kun, WANG Jingyu, JI Jinzhao, LIANG Wuying, MO Ruiwen, LI Shoujun
近些年，猫作为伴侣动物，为人们提供情感慰藉而深受喜爱，但随之而来的健康问题逐渐引起人们的重视。其中，应激由于发生频率高，破坏人猫关系，影响诊疗，成为困扰宠主和兽医的难题之一。Dorland医学辞典对应激的定义是来自躯体、精神或情绪，内部或外部，任何不良刺激的生物学反应的总和[1]。其中，急性应激由几分钟到几个小时的刺激引发[2]。刺激的形式复杂多样，如噪音、运输、诊疗、换粮、环境突变、饥渴、同类竞争压力等[3]。应激会抑制猫食欲[4]，使其出现躲藏和强迫行为、表现更强的攻击性[5]。应激还会导致猫消化道和泌尿系统问题[6]，甚至死亡。
应激会使多种动物生理指标如体温、呼吸、心率、血液常规指标、血液生化指标、热休克蛋白-70(HSP-70)、五羟色胺(5-HT)，炎性因子如IL-1β等[7]，激素如皮质醇(COR)等[8]，氧化应激指标如超氧化物歧化酶(SOD)等[9]，行为学指标如猫应激评分(CSS)[10-12]发生变化，但在猫体内上述指标如何变化及其特异性强弱尚待进一步探究。诊断标志物的研究缺失导致临床上尚无统一的猫应激诊疗标准，故目前诊断猫应激只能通过主诉或兽医主观判断，继以对症治疗，往往效果不佳。且国内外文献中尚未见猫急性应激模型建立方法的报道。因此本研究拟通过使用不同的刺激方式，构建猫急性应激模型，筛选猫急性应激诊断标志物，完善猫急性应激定义标准，为后续猫应激机制研究提供建模手段和数据基础，同时为临床诊疗提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验动物饲养及分组选取18只年龄在6月龄~3岁的猫，雌雄不限，品种为布偶猫、英国短毛猫和家猫，平均体重为(3.70 ± 0.76) kg。实验猫均已完成免疫程序，定期驱虫，体况健康，无用药史，未绝育，未处于疫苗接种或驱虫期、孕期等特殊阶段。将猫随机分为对照组，应激组A和应激组B，每组6只。实验动物于华南农业大学兽医学院饲养房(广州)独立笼具单笼饲养(70 cm×50 cm×60 cm)，通风、光照良好，环境按时清洁和消毒。饲粮为全价全期猫粮，每日定时定量饲喂，自由饮水。实验动物饲养在同一环境下14 d后开始试验。所有的试验设计均经过华南农业大学伦理委员会审查批准(2022A023)。
1.2 主要仪器设备训练项圈(电击源和振动源)购自誉丰公司，DK04多功能播放器购自先科公司，SL720分贝检测仪购自MESTEK公司，BC-5000VET全自动血细胞分析仪和BS-240全自动湿式生化分析仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，TD4A-WS台式离心机购自常州市润华电器有限公司，PH-030A恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司，Multiskan FC酶标仪购自赛默飞世尔科技有限公司，移液枪购自德国艾本德股份公司，MED-U333超低温冰箱购自日本三洋公司。
1.3 急性应激模型建立方法刺激前所有猫禁食6 h，不限制饮水。应激组A采用电击-噪音-振动复合应激，电击强度为12 V，2 mA，噪音为网络源下载的犬吠音频，音量范围为80~120 dB。对实验猫颈部内侧剃毛后安装训练项圈，使项圈探头与颈部皮肤紧密接触，电击和振动均由项圈完成。噪音播放器放置于猫笼正上方，猫位于笼内。对猫持续施加30 min的刺激，每分钟由两次10 s的电击、7 s振动、8 s噪音和25 s休息组成，刺激种类的先后顺序随机且不断改变，结束后评估CSS，测定体温、呼吸频率、心率。再将猫放回笼内，观察恢复时间，30 min后立即采血。应激组B采用束缚应激，用保定绳将猫四肢固定于猫笼顶面的四角，呈四肢伸展的俯卧、悬空状态，持续1 h。结束后评估CSS，测定体温、呼吸频率、心率，然后采血。将猫放回笼内，观察恢复时间。对照组不做应激处理，其余操作同应激组。
1.4 测定指标及方法1.4.1 基础生理指标测定 测定每只猫的体温、呼吸频率、心率。
1.4.2 CSS评估及恢复时间的测定 评估实验猫的CSS，评分标准见表 1[11]。评分者为试验设计者以外的3人，最终得分取平均值。评分前评分者需在笼前站立10 min使猫适应前者的存在[10]。恢复时间为刺激后CSS恢复至刺激前得分所需要的时间。观察并记录应激组猫恢复的时间。
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表 1 猫应激评分表 Table 1 The table of cat stress score |
1.4.3 血液采集与血液指标测定 采集猫5 mL全血，取0.5 mL加入乙二胺四乙酸二钠抗凝管中，使血液充分抗凝，再进行血常规检测。再取1 mL加入分离胶血清生化采血管中，以3 000 r·min-1离心10 min，取血清进行全项湿式生化检测。血常规分析测定：白细胞(WBC)数目、淋巴细胞(LYM)数目、中性粒细胞(NEUT)数目、红细胞(RBC)数目及血红蛋白(HGB)浓度；血生化分析测定：葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)含量及肌酸激酶(CK)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、淀粉酶(AMY)活性。
将剩余3.5 mL全血分离血清后置于-80 ℃超低温冰箱保存。ELISA法测定血清TNF-α、IL-1β、IL-10、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、COR、肾上腺素(EPI)、5-HT浓度，试剂盒购自江苏酶免实业有限公司；ELISA法测定血清HSP-70浓度，试剂盒购自武汉赛培生物科技有限公司；微量法测定血清氧化应激指标：SOD、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量，试剂盒购自江苏艾迪生生物科技有限公司。所有ELISA试剂盒均为猫特异性试剂盒。检测时均严格按照试剂盒说明书操作。
1.5 数据分析利用GraphPad Prism 7软件处理分析本试验获得的所有数据结果并作图，使用SPSS 22.0统计学软件，采用独立样本T检验进行显著性分析。结果采用“平均值±标准差(x±s)”表示，P>0.05差异不显著，P < 0.05差异显著，P < 0.01差异极显著。
2 结果 2.1 基本生理指标的变化由表 2可知，应激组A和应激组B的体温和呼吸频率相较于对照组均极显著升高(P < 0.01)，心率无显著差异(P>0.05)。且应激组A和应激组B的体温、呼吸和心率均超出正常范围。
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表 2 基本生理指标分析表(x±s，n=6) Table 2 Analysis table of basic physiological indexes(x±s, n=6) |
应激组A和应激组B的CSS相较于对照组均极显著升高(P < 0.01)。应激组B的恢复时间长于应激组A(图 1)。
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A.CSS；B.恢复时间。ns表示与对照组对比无显著性差异(P>0.05)，*表示差异显著(P < 0.05)，**表示差异极显著(P < 0.01)。下图同 A.Cat stress score; B.Recovery time. ns means no significant difference compared with the control group (P>0.05), * means significant difference compared with control group (P < 0.05), ** means extremely significant difference compared with control group (P < 0.01). The same as below 图 1 猫应激评分(CSS)及恢复时间 Fig. 1 Stress score and recovery time of cats |
2.3.1 血常规指标的变化 由表 3可知，相较于对照组，应激组A的WBC、LYM和NEUT数目无显著差异(P>0.05)，RBC数目和HGB浓度显著降低(P < 0.05)。但应激组A的5项指标均处于正常范围内。相较于对照组，应激组B的WBC、RBC数目和HGB浓度显著升高(P < 0.05)，NEUT数目极显著升高(P < 0.01)，LYM数目无显著差异(P>0.05)。且应激组B的WBC、NEUT和RBC数目超出正常范围。
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表 3 全血血常规指标分析表(x±s，n=6) Table 3 Analysis table of blood routine indexes (x±s, n=6) |
2.3.2 血生化指标的变化 由表 4可知，相较于对照组，应激组A的AST、ALT活性和TC含量显著降低(P < 0.05)，BUN含量显著升高(P < 0.05)，CK活性极显著升高(P < 0.01)，其它指标无显著差异(P>0.05)。且应激组A的CK和AMY活性超出正常范围。相较于对照组，应激组B的CK、AST活性和BUN含量显著升高(P < 0.05)，GLU、TG含量极显著升高(P < 0.01)，其它指标无显著差异(P>0.05)。且CK、AST、AMY活性和GLU含量超出正常范围。
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表 4 血清生化指标分析表(x±s，n=6) Table 4 Analysis table of serum biochemical indexes (x±s, n=6) |
相较于对照组，应激组A的IL-1β浓度显著升高(P < 0.05)，IL-10浓度显著降低(P < 0.05)，TNF-α浓度极显著升高(P < 0.01)；相较于对照组，应激组B的IL-1β浓度极显著升高(P < 0.01)，IL-10浓度极显著降低(P < 0.01)，TNF-α浓度显著升高(P < 0.05)(图 2)。
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图 2 血清炎性因子浓度 Fig. 2 Concentration of serum inflammatory factors |
相较于对照组，应激组A的CRH和ACTH浓度显著升高(P < 0.05)，COR和EPI浓度极显著升高(P < 0.01)；相较于对照组，应激组B的CRH和ACTH浓度极显著升高(P < 0.01)，COR浓度极显著降低(P < 0.01)，EPI浓度显著升高(P < 0.05)(图 3)。
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A.CRH浓度；B.ACTH浓度；C.COR浓度；D.EPI浓度 A. Corticotropin releasing hormone concentration; B. Adrenocorticotropic hormone concentration; C. Cortisol concentration; D. Epinephrine concentration 图 3 血清激素浓度 Fig. 3 Concentration of serum hormones |
相较于对照组，应激组A的SOD、CAT活性和MDA含量无显著差异(P>0.05)，应激组B的MDA含量无显著差异(P>0.05)，SOD活性显著升高(P < 0.05)，CAT活性极显著升高(P < 0.01)(图 4)。
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A.MDA含量；B.SOD活性；C.CAT活性 A. Malondialdehyde content; B. Superoxide dismutase activity; C. Catalase activity 图 4 血清氧化应激指标 Fig. 4 Serum oxidative stress index |
相较于对照组，应激组A的HSP-70浓度无显著差异(P>0.05)，5-HT浓度极显著升高(P < 0.01)；相较于对照组，应激组B的HSP-70和5-HT浓度均极显著升高(P < 0.01)(图 5)。
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A.HSP-70浓度；B.5-HT浓度 A. HSP-70 concentration; B. 5-HT concentration 图 5 HSP-70和5-HT浓度 Fig. 5 Concentration of HSP-70 and 5-HT |
目前，对于猫应激的定义标准不一，王朝好等[13]在猫慢性应激模型的建立中以采食量显著降低为标准，而国外对急性或慢性应激均采用CSS系统。CSS≤3被视为猫可承受并适应外界刺激，而CSS>3被视为超出猫承受范围(即应激)[11, 14]。本研究中，应激组A和应激组B的CSS>3且相较于对照组显著升高，表明猫急性应激模型建立成功。虽然CSS系统是一种标准化且使用广泛的应激行为评估方法，但迄今为止尚未用其他应激指标对其进行验证[15]。此外，年龄、绝育情况等因素也会对评分结果造成影响[16]，存在一定局限性。因此，在统一实验动物基本情况的前提下，仍需要联合其它指标判断动物是否处于应激状态。这种联合判定已在综述中得到认可[17]，故本研究在模型建立后筛选猫急性应激诊断标志物，继而完善猫急性应激定义标准。
应激可激活机体的交感肾上腺髓质(SAM)系统，兴奋交感神经，激动肾上腺素能受体，导致基础生理指标改变[18]。呼吸作为防御机制的一部分，健康猫会通过轻而慢的呼吸来应对刺激[18]；若刺激超过承受范围，呼吸频率则会升高。应激系统敏感性发生改变的猫，对于低强度的重复应激刺激的反应强度减弱，对于高强度的刺激则增强[19]。例如间质性膀胱炎患猫在应激刺激后呼吸加快，而健康猫降低[18]。本研究中应激组A和应激组B的呼吸频率均在刺激后显著升高，可能因为猫无处躲藏，所以没有必要减慢呼吸[16]。同时说明本研究中刺激强度超出了猫可承受的范围，所以呼吸频率大幅升高。猫的心率和体温已被证实在应激时显著升高[20]。本研究中应激组A和应激组B的体温显著升高，而心率无显著差异。这可能与本研究出于模型建立方法的广泛适用性考虑，选用了多个品种的猫，导致个体差异较大有关。而试验数据也初步表明家猫对应激刺激的行为反应和指标变化的幅度最大，英国短毛猫其次，布偶猫最小。综上所述，应激会引起猫心率、体温和呼吸频率升高。
CSS系统从7个维度评价猫应激状态，多年来被广泛使用，是目前定义猫应激的唯一标准[11]。而同样与应激密切相关的糖皮质激素(GCs)则并未形成定义标准。且最新研究发现，随着猫逐渐适应环境刺激，CSS比粪便GCs代谢物恢复更快[10]，这可能表明CSS比GCs更灵敏。本研究中应激组A和应激组B的CSS显著升高。虽然环境慢性应激也会使CSS升高[16]，但升高幅度不及应激组A所采用的急性应激刺激。然而，体内指标改变幅度更大、猫反应更强烈的应激组B只获得了(3.92±0.47)分。这可能是由于长时间的挣扎和行动限制，导致猫解除束缚后处于体力不支的状态，不能像健康猫一样做出及时和机敏的反应。这也侧面反映了CSS系统的局限，以及与更多应激指标联合使用的必要性。
高强度应激事件通常间隔很长时间才会出现，这容易使人们忽略恢复的重要性，但日常生活中的应激事件往往是接踵而至。一般认为，应激恢复是指下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴激素指标回复至基线水平[21]。本研究限于可操作性，未对应激后的血液指标进行连续监测。因此，作者仅以CSS恢复至应激前水平作为评判标准，初步观察不同应激方法的强度和恢复时间的差异。结果正如所预计的一样，束缚应激的强度更大。随着应激强度的增大，猫恢复时间的离散程度增大，这可能与品种差异有关[22]。
血常规指标中各类白细胞参与机体免疫功能的调节，急性应激会引起各类白细胞绝对数量和相对比例的变化[23]。小鼠在急性应激时NEUT、LYM等细胞转运进入血液，应激刺激持续6 min后，NEUT数目在EPI作用下继续升高，其他类型的白细胞数目则在COR的作用下降低[24]。本研究中应激组B的NEUT数目显著增加，应激组A和应激组B的LYM数目与各自COR浓度变化趋势相反，与Dhabhar等[24]得到的COR浓度与LYM数目呈负相关的结论一致。大鼠在慢性不可预知应激刺激下WBC显著升高[25]，本研究中应激组B的WBC也显著升高。然而，由于无法区分炎症效应与应激所致的白细胞升高，WBC被认为是不可靠的应激指标[17]。
血常规指标中RBC和HGB指示造血功能。机体在暴露于应激时需氧量升高，造血机能增强，猫在复合应激源的刺激下RBC数目和HGB浓度显著升高[26]，与本研究中应激组B的结果一致。小鼠在急性足部电击应激下产生了胃肠炎症并出血，导致RBC数目和HGB浓度显著降低[27]，与本研究中应激组A结果一致。所以，RBC数目和HGB浓度无法作为稳定的应激指标。
应激还会引起部分生化指标的改变。应激期间GCs促进肝糖异生，移除细胞表面的葡萄糖转运体[28]。故本研究中应激组B的GLU含量显著升高。CK是肌肉损伤的标志物[29]。由于应激时骨骼肌能量供应不足，造成CK从受损的肌细胞逸出，所以血清CK活性升高。本研究中应激组A和应激组B的CK活性显著升高，与奶牛在热应激中CK活性的变化一致[30]。AMY由SAM系统在应激时产生，有研究将唾液中的AMY作为应激的标志物[31]。本研究中应激组A和应激组B的AMY活性与对照组虽无显著差异，但有升高趋势。综上所述，血生化的各个指标会随应激而变化，但易受动物体况影响，且特异性不强，故只可作为辅助指标。
急性应激会通过诱导炎性因子的改变来调节免疫功能。TNF-α和IL-1β通过参与细胞免疫或体液免疫来发挥促炎的生理作用[32]，而由单核细胞产生的IL-10通过体液免疫来发挥抗炎作用[33]。大鼠在束缚和电击应激刺激后TNF-α和IL-1β浓度显著升高，IL-10浓度显著降低[34]，与本研究结果一致。本研究中炎性因子的变化趋势与血常规结果吻合，所以急性应激首先会使机体产生适应性的免疫反应以保护宿主。
由下丘脑、垂体、肾上腺组成的HPA轴连接了中枢神经系统和内分泌系统。应激促使下丘脑分泌CRH，与垂体前叶上的受体结合，促进ACTH的释放。ACTH与肾上腺皮质上的受体结合，分泌GCs。另一边，应激可激活SAM系统[35]，SNS兴奋释放EPI和去甲肾上腺素。COR是动物体内最重要的GCs，经常被用作应激研究中的标志物[8]。COR调节血糖为机体供能[28]，抑制非必要功能以帮助机体适应挑战。本研究中应激组A和应激组B的CRH、ACTH和EPI的浓度以及应激组A的COR浓度在应激刺激后升高，与Tilbrook等[36]对绵羊施加隔离约束应激结果一致。但应激组B的COR浓度显著降低。以往的研究均表明，ACTH和COR似乎存在紧密耦合[37]，这可能说明该组猫发生了HPA轴紊乱[38]。此外有研究发现，与应激有关的间质性膀胱炎患猫肾上腺体积缩小，且COR对ACTH的应答显著减弱[39]。在试验过程中，并不能排除应激诱发间质性膀胱炎的可能。推测应激组B由于过强的应激诱发HPA轴紊乱，导致COR对ACTH的应答失常，最终呈现显著降低。COR通常在急性心理应激后21~30 min内达到峰值[37]。因此本研究建议，若使用束缚应激建模，可将束缚时间适当缩短，以防HPA轴发生紊乱。还有观点认为，CRH和ACTH属于应激激素，与应激程度有关；而COR是抗应激激素，与动物对应激刺激的适应程度正相关[17, 40]。所以应激组B的COR浓度显著降低可能是由于猫对该刺激缺乏适应能力，无法代偿应激刺激所带来的负面效应。
应激会导致机体产生大量活性氧(ROS)，其负面效应会被机体抗氧化机制所中和。当体内氧化与抗氧化作用失衡，氧化应激就会产生[41]。ROS在SOD和CAT等抗氧化酶和非酶抗氧化剂作用下被转化和清除[42]，MDA是膜脂过氧化的产物。以上都是常用的氧化应激标志物[9]。小鼠在束缚应激刺激后，抗氧化酶活性显著降低，氧化产物含量显著升高[43]。有关猫科动物氧化应激的研究较少，有研究结论与鼠试验结论相反[13, 44]。本研究中应激组A和应激组B的SOD和CAT活性升高，可能是因为损伤超出了非酶抗氧化剂的缓冲范围，所以上调抗氧化酶活性[44]。应激过程中氧化产物蓄积，本研究中应激组A和应激组B的MDA含量相较于对照组虽无显著差异，但有升高趋势。综上所述，急性应激导致猫体内产生了氧化应激损伤。
HSP-70在正常细胞中不表达或表达量很少，应激条件下表达迅速增高。它作为细胞内多种蛋白的分子伴侣参与蛋白质肽链的折叠、伸展、装配和受损蛋白复性，对应激造成的损伤起修复作用，维持蛋白质稳态[45]。山羊的HSP-70基因的表达能准确地反映热应激水平[46]，本研究中应激组A和应激组B的HSP-70浓度也随应激刺激而升高。
5-HT是一种神经递质，参与痛觉、情绪、焦虑、进食行为等方面的调节[47]。色氨酸有两条代谢途径，一是生成5-HT途径，二是犬尿氨酸代谢途径。慢性应激中，GCs和炎性因子诱导的犬尿氨酸途径激活，会导致哺乳动物大脑5-HT浓度降低[48]；而急性应激对哺乳动物脑色氨酸水平具有相反的作用。足部电击引起小鼠5-HT浓度增加，可能是对应激期间机体对5-HT平衡神经元耗竭的适应性反应[49]。束缚应激还会导致大鼠5-HT增加[50]。本研究中应激组A和应激组B的血清5-HT浓度显著升高，表明急性应激下猫代谢色氨酸主要是通过5-HT途径。
4 结论本研究设计的复合应激和束缚应激是能成功建立猫急性应激模型的两种参考方法。体温、心率、呼吸频率、血常规指标、血生化指标、炎性因子、COR、EPI、氧化应激指标、HSP-70、5-HT与猫急性应激密切相关，但容易受到多种因素的影响，可作为辅助指标进行分析。CRH和ACTH特异性高，影响因素少，因此本研究建议猫急性应激的定义标准为应激组CRH、ACTH浓度和CSS显著高于对照组，且应激组CSS>3。
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(编辑 白永平)