2. 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室, 扬州 225009
2. Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou 225009, China
奶牛产后由于病原微生物进入子宫，导致感染和子宫炎症，患有子宫炎症的奶牛常出现如弓背和心率异常等疼痛反应[1]，且炎性反应期间，机体释放内源性阿片肽(endogenous opioid peptides，EOP)并与周围神经末梢上的阿片受体结合从而抵消炎性疼痛[2]。甲硫脑啡肽(Met-enkephalin，MENK) 作为一种内源性阿片肽，是由前脑啡肽(preproenkephalin，PENK)衍生而来的脑啡肽的一种，参与调控细胞增殖，在生殖系统中也存在MENK及其受体[3-4]。
与MENK相作用的受体包括μ阿片受体(MOR)、δ阿片受体(DOR)、κ阿片受体(KOR)和阿片生长因子受体(opioid growth factor receptor，OGFr)[5]。其中MENK主要与MOR和DOR相互作用[6]。DOR属于G蛋白偶联受体，可以与Gi/Go蛋白结合以调节神经系统中各种反应，如感知疼痛、焦虑、呼吸抑制、细胞增殖和神经元分化等[7]。MOR也属于G蛋白偶联受体，参与调节热性痛觉、行动过缓和呼吸抑制等功能，并调控细胞增殖和血管生成[8-9]。阿片受体拮抗剂可以竞争性抑制阿片受体激动剂与阿片受体结合，其中纳洛酮(naloxone，Nx)是一种非选择性阿片受体拮抗剂，能竞争性地与阿片受体结合[10]。Nx具有两种立体异构体，即(-)和(+)对映异构体，已经证明，纳洛酮的两种异构体都可以抑制炎症因子的释放，具有潜在的抗炎作用，并且可以调控细胞增殖[11-13]。ICI 154129能特异性阻断DOR，并可以有效阻断MENK的作用[14-15]。CTAP是一种特异性MOR抑制剂，能阻断MENK对细胞的作用[16]。
大肠杆菌是导致反刍动物产后子宫感染的主要病原微生物之一，其主要通过脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)发挥致病作用。产后子宫内膜上皮脱落，基质层暴露于致病菌之中[17]。本实验室的前期研究表明，MENK可促进LPS作用下的奶牛子宫内膜基质细胞(bovine endometrial stromal cell，BESC)增殖[17]，但其具体的作用机制尚无报道。本研究利用Nx、ICI 154129和CTAP这些阿片受体拮抗剂，旨在阐明MENK对BESC增殖作用的潜在作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料原代BESC由扬州大学兽医学院外科实验室分离培养保存。DMEM/F12培养基、II型胶原酶、L-谷氨酰胺、表皮生长因子、LPS(L6529)均为美国Sigma公司的产品。胎牛血清购自中国Lonsera公司。胰蛋白酶是美国Amresco公司的产品。MENK(ENKP-006)购自中国中肽生化有限公司。纳洛酮、δ受体拮抗剂(ICI 154129)、μ受体拮抗剂(CTAP)均购自美国Tocris公司。CCK-8试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、BCA法蛋白浓度测试试剂盒均为碧云天公司产品。TRIzol试剂购自天根公司。预混式的两步法RT-qPCR试剂试剂盒，高灵敏性染料法定量PCR检测试剂盒均购自中国Vazyme Biotech公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜为德国Millipore公司产品。RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂均购自中国Applygen公司。高敏性ECL化学发光检测试剂盒购自中国CLINX公司。家兔抗c-Myc抗体(#5605)、家兔抗cyclinD1抗体(#2978)、家兔抗p-PI3K抗体(#4228)、家兔抗PI3K抗体(#4292)、家兔抗p-AKT抗体(#4060)、家兔抗AKT抗体(#4691)、家兔抗β-actin抗体(#4970)和山羊抗家兔IgG二抗均为美国Cell Signaling Technology公司产品。家兔抗β-catenin(#ab32572)抗体购自英国Abcam公司。家兔抗GSK-3β(#A2081)抗体购自中国ABcional公司。
1.2 试验分组进行如下分组：空白对照组(CON组)，10 μg·mL-1 LPS组(LPS组)，10 μg·mL-1 LPS与1×10-10MENK共处理组(LM组)，LPS、MENK与1×10-10mol·L-1 Nx共处理组(LMN组)、LPS与Nx共处理组(LN组)、LPS、MENK与1×10-10mol·L-1 ICI 154129共处理组(LMI组)、LPS与ICI 154129共处理组(LI组)、LPS、MENK与1×10-10mol·L-1 CTAP共处理组(LMC组)以及LPS与CTAP共处理组(LC组)。
前期研究表明MENK能够促进LPS作用下的BESC细胞增殖，本研究通过加入阿片受体拮抗剂，探索MENK对细胞活性、细胞周期、细胞增殖相关基因血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGFA)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CCN2)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGFB1)、转化生长因子-β3(TGFB3)和Wnt/β-catenin和PI3K/AKT相关通路蛋白的影响机制。
1.3 原代细胞的培养和传代无菌采集健康奶牛子宫后低温带回实验室，用碘伏和75%酒精清洗子宫表面，在超净台内纵向切开子宫，无菌清洗子宫腔，剪去子宫内膜层，暴露肌层，把肌层剪成条状，放入含有5%双抗预冷的PBS中反复洗涤至液体澄清，把条状肌层剪成1 mm3的小块，放入于含有5%双抗预冷的PBS中洗涤至液体澄清。将组织块放入离心管中，1 200 r·min-1 4 ℃离心5 min，沉淀的组织块使用浓度为0.25% 胶原酶37 ℃消化45~60 min，期间每5 min轻摇一次，使消化液与组织块充分接触混合。消化结束后加入预热的37 ℃的DMEM/F12完全培养基重悬，经无菌的40目筛网过滤后收集过滤后的液体，1 200 r·min-1 37 ℃离心5 min收集沉淀，用预热的37 ℃的DMEM/F12完全培养基重悬清洗后再次离心。取沉淀加入DMEM/F12完全培养基悬浮成细胞悬液，将悬液转入细胞瓶中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。12~16 h后更换DMEM/F12完全培养基去除杂质、死细胞和部分上皮细胞。之后每2 d换一次细胞培养液，5~6 d后可获得原代基质细胞。当原代细胞长满瓶底85%以上采用胰蛋白酶消化法进行传代，采用第4~6代BESC进行后续试验。
1.4 CCK-8法检测细胞活性以每孔1×103个细胞的密度将BESC接种到96孔细胞板上；待细胞长至80%以上后，更换为含相应LPS、MENK或阿片受体拮抗剂成分的基础培养基继续培养24 h；PBS洗涤3次，每孔加入10 μL CCK-8和100 μL基础培养基预混液继续孵育2 h后于波长450 nm处检测吸光度。
1.5 流式细胞术检测细胞周期以每孔1×106个细胞的密度将BESC接种到6孔细胞板上；待细胞密度长至80%以上融合时，更换为含相应LPS、MENK或阿片受体拮抗剂成分的基础培养基继续培养24 h；收集细胞于1.5 mL EP管中，置于70%乙醇中4 ℃固定12~24 h；固定好的细胞PBS重悬洗涤后，每管样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37 ℃避光温浴30 min，4 ℃避光存放；检测前用400目筛网过滤，用流式细胞仪于488 nm波长处检测红色荧光信号。
1.6 荧光定量PCR以每孔1×106个细胞的密度将BESC接种到6孔细胞板上；待细胞密度长至80%以上后，更换为含相应LPS、MENK或阿片受体拮抗剂成分的基础培养基继续培养，于3、12、24 h收集细胞。采用TRIzol法提取细胞总RNA，逆转录为cDNA；用荧光定量PCR方法分别检测BESC增殖相关因子VEGFA、CCN2、TGFB1和TGFB3基因表达，引物见表 1。采用2-ΔΔCt法对Ct值进行分析，以ACTB为内参基因，计算基因的相对表达量。
1.7 蛋白质印迹法以每孔1×106个细胞的密度将BESC接种到6孔细胞板上；待细胞密度长至80%以上后，更换为含相应LPS、MENK或阿片受体拮抗剂成分的基础培养基继续培养45 min后收集细胞。提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，调整上样量进行SDS-PAGE电泳，转膜；5%脱脂奶粉溶液室温封闭1.5 h；加入配制好的一抗(#5605、#2978、#4228、#4292、#4060、#4691、#4970、#ab32572、#A2081)4 ℃孵育14~18 h，TBST漂洗；加入二抗(山羊抗家兔IgG)室温孵育2 h，TBST漂洗，配置显色发光液，采集图像；采用Clinx Image Analysis进行分析。
1.8 数据分析流式细胞术运用Flowjo7.6进行分析，获得处于各时期细胞周期的细胞相对数量。所有数据运用Dunnett’s检验(SPSS 21.0软件)进行分析，组间比较采用One-way ANOVA进行分析，结果以“x±s”的形式表示。P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
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表 1 扩增基因的引物序列 Table 1 The primer sequences of gene amplified |
如图 1所示，与空白对照组相比，10-6mol·L-1 ICI 154129处理组细胞活力极显著降低(P < 0.01)，其余各处理组细胞活力无显著影响(P>0.05)；与空白对照组相比，10-6mol·L-1 ICI 154129与LPS共处理组细胞活力显著降低(P < 0.05)，其余各处理组细胞活力无显著变化(P>0.05)。
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采用纳洛酮(A)、ICI154129(B)和CTAP(C)分别处理细胞，或LPS与阿片受体拮抗剂处理共处理细胞(D)24 h。与空白对照组相比，*.P < 0.05；**. P < 0.01。下同 The cells were treated with naloxone (A), ICI154129 (B), CTAP (C) or co-treated with LPS and opioid receptor antagonists (D) for 24 h. *. P < 0.05, **. P < 0.01 compared with the control group. The same as follows 图 1 阿片受体拮抗剂对奶牛子宫内膜基质细胞活性的影响 Fig. 1 The effect of opioid receptor antagonist on BESC viability |
如图 2所示。与空白对照组相比，LPS组细胞G1期的相对细胞数升高(P < 0.05)，S期降低(P < 0.01)；与LPS组相比，LM组细胞S期相对细胞数升高(P < 0.05)；与LM组相比，LMN组以及LMI组细胞G1期相对细胞数升高(P < 0.05)，LMN组以及LMC组细胞细胞S期相对细胞数降低(P < 0.05)。
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采用NAL (A)、ICI154129 (B)或CTAP (C)处理细胞24 h，用流式细胞术检测细胞周期。与空白对照组相比，* P < 0.05；** P < 0.01；与LPS组相比，# P < 0.05；## P < 0.01。与LM组相比，+ P < 0.05；++ P < 0.01。下同 The cells were treated with naloxone (A), ICI154129 (B), or CTAP (C) for 24 h. * P < 0.05, ** P < 0.01 compared with group CON; # P < 0.05, ## P < 0.01 compared with group LPS; + P < 0.05, ++ P < 0.01 compared with group LM. The same as follows 图 2 阿片受体拮抗剂对奶牛子宫内膜基质细胞周期的影响 Fig. 2 The effect of opioid receptor antagonist on cell cycle distribution of BESC |
如图 3所示，与空白对照组相比，LPS组VEGFA基因表达上调(P < 0.01)；CCN2和TGFB3基因表达下调(P < 0.01)。与LPS组相比，LM组各基因表达上调(P < 0.05)或不变(P>0.05)，LN组CCN2、TGFB1和TGFB3基因表达上调(P < 0.01)，LI组CCN2、TGFB1和TGFB3基因表达下调(P < 0.01)，LC组TGFB1和TGFB3基因表达上调(P < 0.01)；与LM组相比，LMN组以及LMI组细胞CCN2、TGFB1和TGFB3基因表达下调(P < 0.01)，LMC组细胞CCN2基因表达下调(P < 0.01)。
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采用LPS、MENK和NAL(A)、ICI154129(B)或CTAP(C)共处理细胞24 h，荧光定量PCR检测基因表达 The cells were treated with naloxone (A), ICI 154129 (B), or CTAP (C) for 24 h 图 3 阿片受体拮抗剂对奶牛子宫内膜基质细胞增殖相关基因表达的影响 Fig. 3 The effect of opioid receptor antagonist on gene expression of proliferation-related cytokines in BESC |
如图 4所示，与空白对照组相比，LPS组β-catenin、c-Myc、cyclinD1和GSK-3β蛋白表达上调(P < 0.05)；与LPS组相比，LM组β-catenin、c-Myc、cyclinD1和GSK-3β蛋白表达下调(P < 0.05)，LN组c-Myc、cyclinD1和GSK-3β蛋白表达下调(P < 0.05)，LI组细胞β-catenin、c-Myc和GSK-3β蛋白表达下调(P < 0.05)，LC组细胞β-catenin蛋白表达下调(P < 0.05)；与LM组相比，LMN组cyclinD1和GSK-3β蛋白表达上调(P < 0.05)，LMI组细胞β-catenin和GSK-3β蛋白表达上调(P < 0.01)，LMC组细胞cyclinD1蛋白表达上调(P < 0.05)。
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采用LPS、MENK和阿片受体拮抗剂共处理细胞45 min，阿片受体拮抗剂包括NAL(A)、ICI154129(B)或CTAP(C) The cells were cotreated with LPS, MENK, and opioid receptor antagonist for 45 min, the antagonists included naloxone (A), ICI154129 (B), or CTAP (C) 图 4 阿片受体拮抗剂对奶牛子宫内膜基质细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响 Fig. 4 The effect of opioid receptor antagonist on the Wnt/β-catenin pathway in BESC |
如图 5所示，与空白对照组相比，组PI3K和AKT磷酸化水平降低(P < 0.05)；与LPS组相比，LM组AKT磷酸化水平降低(P < 0.05)，PI3K磷酸化水平不变(P>0.05)，LN组AKT磷酸化水平降低(P < 0.05)；与LM组相比，LMN组、LMI组和LPS、MENK和CTAP共处理组AKT磷酸化水平升高(P < 0.05)。
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采用LPS、MENK和阿片受体拮抗剂共处理细胞45 min，阿片受体拮抗剂包括NAL(A)、ICI154129(B)或CTAP(C) The cells were cotreated with LPS, MENK, and opioid receptor antagonist for 45 min, the antagonists included naloxone (A), ICI154129 (B), or CTAP (C) 图 5 阿片受体拮抗剂对奶牛子宫内膜基质细胞PI3K/AKT信号通路的影响 Fig. 5 The effect of opioid receptor antagonist on the PI3K/AKT pathway in BESC |
MENK主要作用于DOR和MOR[18]。Nx能竞争性地与DOR、MOR和KOR结合[10]。ICI 154129能特异性阻断DOR[14]。CTAP能特异性阻断MOR[19]。采用相同摩尔浓度的Nx、ICI 154129和CTAP可以抑制MENK的作用[20-22]。根据先前结果[17]以及本试验CCK-8结果，采用10-10mol·L-1浓度的阿片受体拮抗剂(Nx、ICI 154129和CTAP)进行后续试验。
MENK通过激活阿片受体发挥作用。阿片受体分为经典阿片受体和非经典阿片受体，经典阿片受体主要包括DOR、MOR和KOR，且均属于G蛋白偶联受体家族，具有调节第二信使的功能。激活这些受体会抑制腺苷酸环化酶以及L型和N型Ca2+通道的活性，参与信号转导和神经调节[23]。非经典阿片受体ζ又被称为阿片生长因子受体(opioid growth factor receptor，OGFr)，OGFr具有一些与经典阿片受体相似的药理学特征，但其分子结构特征与经典阿片受体结构上的相似性不同[5]。因此MENK可能通过经典和非经典阿片受体发挥不同的作用。
奶牛分娩时子宫内膜表面塌陷、上皮层脱落导致基质层暴露，病原微生物与基质细胞直接接触，导致基质层炎症反应[24]。奶牛产后子宫炎症延迟子宫复旧，奶牛产后子宫复旧包括组织修复、子宫内膜再生和消除子宫内的病原体[25-26]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)分别由VEGFA、CCN2和TGFB基因编码，均参与子宫内膜的生长修复，调控细胞增殖。Wnt/β-catenin信号通路参与调控子宫发育和子宫复旧[27]。有研究发现，Wnt/β-catenin通路激活对间充质干细胞增殖具有双向调节作用[28]。LPS可以激活Wnt/β-catenin信号通路，同时加重炎症，阿魏酸作用于LPS诱导的骨关节炎(OA)软骨细胞后，Wnt/β-catenin信号通路被抑制，促进OA软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡[29-30]。PI3K/AKT通路参与调控细胞增殖、迁移和分化及炎症反应，LPS可以诱导小鼠胶质瘤细胞的炎性反应并抑制PI3K/AKT通路，加入LY294002后可以抑制PI3K/AKT通路同时抑制促炎因子的表达[31-32]。金骨莲提取物通过抑制LPS刺激后RAW264.7细胞的PI3K/AKT通路发挥抗炎作用[33]。
有研究发现，MENK在炎症反应与抗炎症反应的平衡调节发挥重要作用，并且通过MOR和DOR调节未成熟肾上腺皮质细胞增殖[34-35]。据报道，MENK能促进外周血淋巴细胞增殖，而Nx和δ阿片受体特异性拮抗剂ICI 174864以剂量依赖性方式抑制这种细胞增殖，这表明MENK通过DOR调节人外周血淋巴细胞增殖[36]。加入Nx处理后，细胞周期被阻滞在G1期，基因表达降低，Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达升高，AKT磷酸化水平升高，说明Nx作为非选择性阿片受体拮抗剂，抑制了MENK与受体的结合，进而抑制MENK对细胞的促增殖和抗炎作用。有研究发现，Nx可以通过受体非依赖性途径促进神经干细胞增殖[13]。同时在炎症方面，Nx能够下调TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞炎性因子，发挥抗炎作用[37]。本试验中，LPS与Nx共处理可上调增殖相关基因表达，降低Wnt/β-catenin通路关键蛋白水平，说明Nx可以促进BESC的增殖，并在一定程度上发挥抑炎作用。目前研究表明，MENK可通过激活DOR和MOR来促进CD8+T细胞的增殖和功能，并且MENK的这种作用可以被逆转[38]。在本试验中，MENK促进LPS作用下BESC的增殖，加入Nx、ICI 154129和CTAP后逆转了MENK的促增殖作用，提示MENK可能通过经典阿片受体DOR和MOR促进细胞增殖。DOR对细胞增殖的影响尚无文献报道。在本试验中，LPS与ICI 154129共处理降低细胞基因表达和Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达，说明ICI 154129可能抑制BESC的增殖。
4 结论本研究表明Nx可以拮抗阿片受体，同时可能通过受体非依赖途径发挥抑炎作用，促进细胞增殖；MENK促进细胞增殖可能是通过DOR和MOR介导的。但ICI 154129对细胞增殖的抑制作用机制尚不明确，值得进一步深入探究。
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(编辑 孟培)