2. 西南大学动物科学技术学院, 重庆 400715;
3. 草食动物科学重庆市重点实验室, 重庆 400715
2. College of Animal Science and Technology, Southwest University, Chongqing, 400715, China;
3. Chongqing Key Laboratory of Herbivore Science, Chongqing 400715, China
提高动物生产性能是获得更大经济效益的重要手段，而哺乳动物子宫内自然杀伤细胞(uterine natural killer, uNK)对于动物生产性能影响的研究越来越重视，该细胞是哺乳动物妊娠早期胎盘蜕膜中数量最多的免疫细胞，占子宫白细胞总数的70%以上[1]，目前，已证实其具有宫内抗感染的作用，同时在滋养层细胞侵袭、胎盘发育、血管重建以及调节子宫内免疫耐受等方面也具有重要的作用[2]。螺旋动脉重构是胚胎植入与胎盘的关键步骤之一，丁培阳等[3]发现uNK通过分泌血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGF-C)促进螺旋动脉的形成，发挥对胎盘早期发育的调控作用。Rajagopalan[4]发现uNK细胞通过分泌γ干扰素(interfern-γ, IFN-γ)和转化生长因子-1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)等细胞因子促进滋养层细胞侵袭和螺旋动脉的重塑，为胎盘的发育形成提供必要的前提条件。
前期的研究发现去甲基化酶(ten eleven translocation，TET)家族在胚胎发育过程中参与调控并发挥重要作用。TET是一种双加氧酶，能催化5-甲基胞嘧啶为5-羟甲基胞嘧啶，包含TET1、TET2和TET3三个成员[5]，其中，TET1在调控胚胎发育过程中的报道较多，Khoueiry等[6]发现Jmjd8是外胚层TET1活性的直接靶点，在外胚层细胞中，TET1通过羟甲基化去甲基化基因启动子，维持端粒的稳定性，而在TET1缺失的情况下，基因表达失调会导致胚胎缺陷。Yamaguchi等[7]发现TET1敲除雄性和野生型雌性小鼠交配的后代表现出包括胎盘、胎儿和出生后的生长缺陷，以及早期胚胎死亡率升高的现象。此后，Rakoczy等[8]、Jafarpour等[9]、谭强等[10]相继发现妊娠期间人、小鼠、羊等胎盘中TET1的表达动态与uNK细胞数量变化趋势非常相似，鉴于此作者推断TET1极有可能调控uNK细胞。为验证这一推论，本试验通过RNA干扰技术下调uNK细胞中TET1基因的表达量，并对uNK细胞的增殖以及主要细胞因子的转录情况进行研究。
1 材料与方法 1.1 实验动物及处理成年雌、雄昆明小鼠(10~12周龄，体重25 g左右)购自重庆国家生物产业基地实验动物中心，随机按雌、雄各1只于下午17:00混于笼中，次日08:00观察阴道栓，检测到阴道栓时记为妊娠0.5 d，小鼠养殖环境无特殊致病原，温度20~26 ℃，湿度40%~70%，自由采食。
1.2 主要试剂链霉亲和素Dynabeads M-280磁珠购自Thermo Fisher(货号11205D)；白细胞介素15(IL-15)购自重庆叶脉生物技术有限公司，CCK-8检测试剂盒购自江苏艾迪生生物科技有限公司(货号ADS1030)，胶原酶Ⅰ、胎牛血清、5%青链霉素、1640培养基、红细胞裂解液和小鼠淋巴细胞分离液等均购自上海生工生物工程有限公司；SYBR荧光定量扩增试剂购自北京全式金公司，小鼠TET1基因干扰序列及干扰慢病毒的包被由上海吉满生物科技有限公司构建；试验所涉及荧光定量PCR扩增用引物均在北京华大基因重庆分公司合成。
1.3 小鼠uNK细胞的分离与培养无菌采集妊娠9~12 d小鼠子宫，Hanks液清洗去除血渍及脂肪，剪至0.1 mm3左右以胶原酶37 ℃ 100 r·min-1于恒温摇床中消化1 h，后用200目尼龙网过滤，滤液1 000 r·min-1离心15 min，细胞沉淀加5倍红细胞裂解液颠倒混匀10 min，1 000 r·min-1离心10 min去除上清，细胞沉淀以Hanks液重悬并1∶1叠于小鼠淋巴细胞分离液中，1 500 r·min-1离心15 min，小心吸取中间细胞层。用PBST洗涤细胞3次，后加入适量PBS进行重悬后，台盼蓝染色计数，调整细胞数目。吸取50 μL磁珠并用PBST洗涤过磁力架(Thermo Fisher, 12321D) 3次，PBS重悬，加入DBA(终浓度10~20 μg·mL-1) 室温孵育包被30 min，PBST洗涤3次，以细胞与磁珠数量3∶1的量混合，4 ℃孵育15 min。过磁力架吸出废液保留，用0.1 mol·L-1 N-乙酰葡萄糖溶液洗脱磁珠细胞后再次筛选废液，两次得到的细胞悬液经形态鉴定后计数，调整数目，接入含10%胎牛血清和5%青链霉素的1640培养基中，添加IL-15(终浓度10 ng·mL-1)，置于37 ℃、5% CO2培养箱。
1.4 小鼠TET1重组干扰质粒的构建与鉴定针对小鼠TET1基因序列，设计3个RNA干扰靶点序列，根据基因序列分别设计并合成shRNA寡聚单链DNA(上海生工合成)，序列见表 1。将合成的3个寡聚单链DNA退火成双链，分别插入到shRNA载体GM-19167 RNAi载体(图 1，上海吉满生物科技有限公司)中，构建shRNA重组质粒，并转化至感受态细胞DH5α，经测序比对，确定干扰载体构建成功后保存备用。
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表 1 干扰靶点、shRNA寡聚单链DNA序列及扩增引物序列 Table 1 Interference targets, shRNA oligomeric single stranded DNA sequences and primer sequences |
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图 1 GM-19167 RNAi载体信息 Fig. 1 Information of the RNAi vector GM-19167 |
提取构建成功的重组干扰质粒和慢病毒包装质粒，紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260 nm/A280 nm为1.8~2.0。而后将已经长好的293T细胞分盘，以合适的比例传代到10 cm培养皿中，当细胞长到70%~80%时准备转染。取无菌的1.5 mL EP管进行转染，体系为DMEM 1 mL，质粒10 μg，Lenti-HG Mix 10 μL(10 μg)，HG transgene reagent 60 μg，混匀后室温放置15~20 min，均匀滴加到提前换过液的293T细胞培养皿中，置于CO2培养箱中培养；转染10~12 h后均匀滴加100×Enhancing buffer促进转染，100 μL·皿-1；转染18~20 h后小心吸掉细胞培养液，然后加15 mL新鲜的细胞培养基继续培养；48 h后，吸取细胞上清液于50 mL离心管，于4 ℃ 4 500 g离心5 min，上清液用0.22 μm滤器过滤后转移到新的离心管中，最后将滤液分批转移到浓缩装置中，4 ℃ 4 500 g离心10 min，滤器上层中的液体即为病毒浓缩液，包装好的慢病毒保存于-80 ℃。
1.6 慢病毒滴度的测定将293T细胞培养至对数生长期，按照每孔2×105细胞接种12孔板，37 ℃培养过夜，转染时细胞长至20%~30%的融合密度；利用DMEM(不含血清)细胞培养基梯度稀释慢病毒(1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5·mL-1)，加入每孔细胞中，放入37 ℃的细胞培养箱中培养；第5天观察细胞状态及荧光情况，细胞密度高于80%抽提RNA，利用RT-qPCR比较对照组标准曲线和试验组的Ct值差异判断滴度值，其计算方法：滴度(TU·mL-1)=[平均每基因组慢病毒整合拷贝数×感染时细胞的数目×病毒的稀释倍数×1 000]/加入稀释病毒的体积数。其中，目的基因WPRE和内参基因GAPDH的检测引物序列见表 1。
1.7 慢病毒感染小鼠uNK细胞小鼠uNK细胞吸去培养皿上清，按慢病毒与细胞数的比值10~200缓慢加入慢病毒，补齐培养基，48 h后开始观察荧光的细胞数量，待视野中70%~80%为带红色荧光时，收集细胞提取总RNA，以β-actin为内参，利用RT-qPCR方法检测目的基因TET1的表达情况。其中，内参β-actin和目的基因TET1的引物序列见表 1，检测结果以2－△△Ct比较其表达差异。
1.8 CCK-8检测小鼠uNK细胞增殖情况慢病毒转染确定TET1基因表达下调后，将1×104个细胞移至96孔板，设uNK细胞组、慢病毒干扰组和慢病毒空载体对照3个组，每组5个重复，36 h后按照CCK-8试剂盒说明书进行uNK细胞增殖的检测。具体每孔加入10 μL CCK-8，作用4 h后吸取细胞上清液于检测波长450 nm、参比波长630 nm测定其吸光度，根据试剂盒说明书计算各组细胞增殖生长情况。
1.9 RT-qPCR检测小鼠uNK细胞IFN-γ、VEGF-C和TGF-β1的相对表达量转染后168 h的uNK细胞和未转染的uNK细胞(对照)，分别提取其RNA，反转录后利用荧光定量PCR的方法对3种细胞因子(IFN-γ、VEGF-C和TGF-β1)的mRNA表达水平进行检测，检测条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s(收集荧光)，共45个循环；以β-actin为内参，3种细胞因子的检测引物参见表 1，检测结果以2－ΔΔCt比较其表达差异。
1.10 统计学分析及作图软件采用SPSS 23.0统计学软件进行统计分析，数据采用“均数±标准误(x±sx)”表示，方差检验采用单因素ANOVA方差分析，以P < 0.05为显著性判断标准；利用GraphPad prim软件绘制图片。
2 结果 2.1 慢病毒滴度的测定针对3个靶点的干扰序列经测序比对，发现重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致，干扰载体构建成功。滴度测定釆用梯度稀释病毒，分别感染293T细胞，通过荧光定量PCR方法对内参基因GAPDH和目的基因WPRE进行检测，换算得出3个重组干扰质粒包被慢病毒(shRNA1、shRNA2、shRNA3)的滴度分别为1.09×109、1.11×109和1.13×109 TU·mL-1。
2.2 慢病毒转染及TET1基因表达结果对比3个慢病毒转染96 h效果(图 2a~c)，shRNA2转染效率较高，后续试验均使用该毒。转染168 h后，视野中80%以上uNK细胞带有荧光(图 2d)，说明慢病毒已成功转染uNK细胞。收集细胞进行荧光定量检测TET1基因mRNA转录水平显著低于空载体和uNK细胞对照组(P < 0.05)(图 3)，表明在RNA干扰下TET1基因表达显著下调。
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a、b、c分别为shRNA1、shRNA2和shRNA3转染后96 h；d为shRNA2转染168 h a, b, c were 96 hours after shRNA1, shRNA2 and shRNA3 transfection, respectively; d was 168 hours after shRNA2 transfection 图 2 慢病毒转染uNK细胞(100×) Fig. 2 Lentivirus transfected uNK cells(100×) |
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ns表示二者差异不显著(P＞0.05)，**表示差异显著(P < 0.05) ns means no significant difference between the groups(P > 0.05);** means significant difference between the groups(P < 0.05) 图 3 慢病毒转染后TET1基因表达结果 Fig. 3 Expression of TET1 gene after lentivirus transfection |
转染成功36 h后，CCk8法测定uNK细胞组、慢病毒干扰组和慢病毒空载体对照组细胞增殖情况，结果如图 4所示，发现3个组之间差异不显著(P>0.05)，说明干扰TET1基因的表达不会对uNK细胞的增殖造成影响。
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ns表示二者差异不显著(P＞0.05) ns means no significant difference between the groups(P > 0.05) 图 4 病毒转染后uNK细胞增殖情况 Fig. 4 Proliferation of uNK cells after lentivirus transfection |
慢病毒转染成功36 h后，与未转染的uNK细胞对照组相比，IFN-γ和VEGF-C两种细胞因子的表达量均显著下降(P < 0.05)，而TGF-β1的表达显著上升(P < 0.01)(图 5)。
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Control.未转染uNK细胞对照；TET1 down.转染慢病毒的uNK细胞。**表示差异显著(P < 0.05)，***表示差异极显著(P < 0.01) Control. Untransfected uNK cells; TET1 down. Lentivirus transfected uNK cells. ** means significant difference between the groups(P < 0.05);*** means extremely significant difference between the groups(P < 0.01) 图 5 慢病毒转染后细胞因子IFN-γ、VEGF-C和TGF-β1的表达情况 Fig. 5 Expression of IFN-γ, VEGF-C and TGF-β1 after lentivirus transfection |
DNA甲基化在胚胎发育、造血系统及肿瘤等相关疾病发生过程中起重要作用，而TET1是一种5羟甲基胞嘧啶羟基化酶，能启动DNA去甲基化程序，该酶是一类α-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶，通过调控胚胎干细胞的发育保持其自我更新能力[11]。不仅如此，研究发现TET1还可以通过对Treg细胞的转录因子Foxp3进行调控，保证Treg细胞分化及功能的稳态[12]，从而对机体的先天免疫具有重要影响。鉴于目前对该酶的功能研究主要集中在衰老、癌细胞和胚胎发育等领域，而在免疫相关领域研究相对较少，因此本试验通过构建干扰质粒下调TET1基因的表达，研究其对uNK细胞相关细胞因子的变化。RNA干扰技术在基因功能研究中具有重要的作用，能够避免传统基因敲除对细胞产生致死性影响，本试验中选择了3个干扰位点，并构建了shRNA1、shRNA2和shRNA3 3个干扰质粒，结合转染细胞的效率，发现shRNA2效果最佳，能够显著干扰TET1基因的表达，随后的CCK8检测结果证实降低TET1的表达对uNK细胞的正常增殖不会产生影响，因此该靶点及干扰序列对TET1基因的表达研究具有参考价值。
uNK细胞与外周血中的NK细胞具有显著的差异，类似于未成熟的NK细胞，其杀伤功能下降，分泌能力增强，在哺乳动物妊娠早期子宫蜕膜中数量最多，现有的研究证实uNK细胞不仅在宫内抗感染方面发挥作用，而且在建立子宫内免疫耐受环境、促进胎盘和胎儿发育等过程中也具有重要的调控作用[13]。哺乳动物胎盘紊乱会导致多种不良妊娠结局，如早产、流产和宫内生长受限等[14]，而uNK细胞在参与建立和支持整个妊娠过程中发挥着重要的作用[15]，特别是在妊娠早期，因而本试验以小鼠uNK细胞作为研究对象，观察其与TET1之间是否存在某种联系。
VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，在子宫内对胚胎和胎儿血管的形成和生长起着关键的作用[3]，研究证实VEGF表达于大鼠等多种动物的子宫内膜，参与子宫血管通透性的调节，介导子宫内膜血管变化和血管重建，而uNK细胞常出现于血管周围并且表达VEGF因子在胚胎植入部位发挥促进螺旋动脉改造的作用[16]。本试验对VEGF家族中的重要成员VEGF-C作为靶分子进行检测，发现TET1表达下调后该因子的转录水平也显著下降，说明TET1基因参与调控了VEGF细胞因子的表达。然而目前尚未有将TET1与VEGF相关联的研究报道，但尽管如此，丁培阳等[3]在探讨uNK细胞和VEGF在正常妊娠山羊子宫动态分布规律的时候发现在妊娠早期和中期uNK细胞和VEGF均显著表达，但在妊娠后期二者均急剧下降，二者呈现一定的相关性，推测uNK细胞或许是通过TET1的调控介导了VEGF的表达，这在后续动物试验中需进一步验证。
TGF-β1可由多种免疫细胞(如B、T、树突状细胞等)分泌，能够调节多种细胞的增殖、分化和凋亡。研究表明0.5 ng·mL-1 TGF-β1可以促进催乳素的释放，刺激子宫内膜基质细胞合成基质蛋白，进而使子宫内膜基质细胞发生蜕膜化[17]，同时TGF-β1能够抑制Th1型细胞因子的分泌，而Th1型细胞因子不利于妊娠，因而TGF-β1具有维持妊娠的作用[18]。与许多免疫细胞类似，uNK细胞也可以分泌TGF-β1，研究表明，uNK细胞分泌的TGF-β1可通过调控非编码RNA MEG3借以调控子宫螺旋动脉的重建和血管平滑肌细胞层的分离[19]，二者均是成功妊娠的关键，鉴于此，本试验将TGF-β1作为检测指标，发现TET1基因表达下调后TGF-β1的转录水平显著上升，上述文献已证实TGF-β1分泌量升高对妊娠有利，尽管本试验未能对小鼠敲除TET1后TGF-β1的分泌量进行检测，然而能够说明TET1在妊娠过程中对免疫分子具有调控作用，这一点与Yamaguchi等[7]对TET1的研究是一致的，后续需在妊娠动物中对TET1和TGF-β1的相互关系进行进一步的验证。
IFN-γ属于Th1型细胞因子，在正常妊娠时uNK细胞会分泌适量的IFN-γ以保证螺旋动脉的分化生长，但如果其分泌过量会严重抑制胚胎的着床、发育[20]。值得注意的是，uNK细胞具有大量分泌IFN-γ的潜能，且一般会随着uNK细胞数量的增加而增加，但正常生理条件下子宫内的IFN-γ并不会显著上升，因此调控IFN-γ释放的机制非常值得探索。本试验中通过下调TET1基因的表达可以看到IFN-γ的转录显著下降，说明TET1基因在调控IFN-γ的分泌过程中发挥着作用，但其详细的调控路径尚需进一步发掘。文献检索显示目前尚无有关TET1与uNK细胞中IFN-γ相互关联的资料，但Burleson等[21]在对过敏性气道炎症模型小鼠中发现敲除TET1后会使疾病加重，且可通过直接调节干扰素和芳香烃受体途径抑制尘螨诱导的过敏性气道炎症，说明TET1与机体的细胞因子之间存在联系，因此本试验初步阐释了在mRNA水平TET1与uNK细胞中IFN-γ的关系，但二者在蛋白水平的关联仍需进一步验证。
4 结论干扰TET1基因的表达没有影响uNK细胞的正常生长增殖，但下调IFN-γ和VEGF-C以及上调TGF-β1的转录。
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(编辑 白永平)