, WANG Xiangguo, LI Junmei, ZHI Feijie, FANG Jiaoyang, ZHENG Weifang, CHEN Jialu, JIN Yaping, WANG Aihua
布鲁氏菌(Brucella)是革兰阴性、兼性胞内寄生菌，能够引起人和多种动物发生布鲁氏菌病(brucellosis)。布病是一种影响家畜和人类广泛传播的人畜共患病，给世界很多地区带来巨大的经济损失和公共卫生安全问题[1]。布鲁氏菌的主要宿主包括羊、牛、猪、狗、骆驼以及沙漠林鼠。人类感染布病通常是因为接触了已感染的动物或者是污染的动物产品[2]。在自然宿主，布鲁氏菌可以穿透生殖黏膜、呼吸道、消化道和结膜；在人类，布鲁氏菌大多数共同的进入位点是消化道和呼吸道[2]。布鲁氏菌一旦破坏了黏膜屏障，就进入局部淋巴结并且扩散于全身[2]。在宿主体内，布鲁氏菌可在巨噬细胞内生存并大量增殖[3]。动物感染后，主要表现幼畜关节肿胀，公畜不育和孕畜流产[4]。由于目前人类尚缺乏疫苗，动物疫苗对人畜存在残余毒力，因此，充分阐明布鲁氏菌的致病机制对于研发新的防控措施具有重要意义。
布鲁氏菌IV型分泌系统(type IV secretion system，T4SS)是一种在调控胞内生存和操纵宿主免疫应答中起重要作用的关键毒力因子，其毒力发挥主要是依靠所分泌的效应蛋白[5-6]。VceC是T4SS的效应分子和主要毒力因子之一，且最早进入宿主细胞。结构域分析揭示VceC C端的20个氨基酸是其转运进入宿主细胞的必须肽段，而其N端形成的一个疏水跨膜区域为其定位到内质网和在内质网的摄动所必须[7]。免疫共沉淀-质谱分析(IP-MS)研究表明内质网伴侣蛋白Bip/Grp78会结合到VceC的脯氨酸富集区域。这个脯氨酸富集区域是VceC唯一的特征区域[8]。
内质网应激及其诱导的未折叠蛋白反应(UPR)是一种细胞自我保护反应[9-10]。UPR通路包含需激醇酶1(IRE1)，RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(PERK)和激活转录因子(ATF6)3条通路[9, 11]。有研究表明在UPR 3条信号通路中，IRE1在调节细胞命运上起关键作用，它可直接连接于未折叠蛋白上[12]。当细胞处于静息状态时，IRE1、PERK、ATF6和伴侣分子葡萄糖调节蛋白GRP78结合，一旦有体内外刺激时，细胞发生应激，GRP78与IRE1、PERK、ATF6分离，IRE1、PERK和ATF6通路激活以维持内质网稳态[13-14]。作者前期研究显示，内质网应激参与了布鲁氏菌在细胞内存活的调节，但VceC是否通过影响UPR对靶细胞发挥细胞毒性作用仍然不清楚。山羊胚胎滋养层细胞(GTC)分泌的孕酮对维持整个妊娠过程顺利进行具有重要作用[15-16]。研究表明，滋养层细胞也是布鲁氏菌的靶细胞[17]。布鲁氏菌感染怀孕母畜会导致其流产，但是具体的机制仍不清楚。
本文以GTC为研究对象，构建布鲁氏菌VceC真核表达载体，研究VceC对GTC细胞UPR及分泌性腺激素的影响，为揭示布鲁氏菌VceC在布鲁氏菌感染滋养层细胞及其引致感染动物流产的机制提供依据，对全面认识布鲁氏菌的致病机制具有重要价值。
1 材料与方法 1.1 菌株、质粒、细胞系与主要试剂布鲁氏菌疫苗S2株，新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生产，批号为2012011，4 ℃保存；pEGFP-C1载体、293T细胞均为农业部动物生物技术重点实验室保存；山羊滋养层细胞系由西北农林科技大学动物医学院童德文教授惠赠；感受态DH5α、细菌基因组提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒和质粒小提中量试剂盒均购自天根生物工程有限公司，BspE Ⅰ和Pst Ⅰ限制性内切酶购自TaKaRa公司，pMD19T-Simple载体购自宝生物工程有限公司，TurboFect转染试剂购自美国Thermo公司，全蛋白提取试剂盒和BCA蛋白测定试剂盒购自凯基生物公司，ELC发光液购自美国伯乐公司，β-actin抗体购自天津三箭生物公司，GRP78、CHOP抗体和IRE1抗体购自SANTA公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠/兔IgG抗体和HRP标记的兔抗羊IgG抗体购自中杉金桥公司，SYBR® Premix Ex TaqTM II试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司，cDNA合成试剂盒购自Abcam公司，Triton X-100购自上海索莱宝，ELISA检测试剂盒购自大连TaKaRa公司。
1.2 VceC基因真核表达载体pEGFP-C1-VceC的构建1.2.1 模板制备 取布鲁氏菌S2接种于胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基中，在37 ℃、220 r·min-1摇床培养48 h后，于80 ℃水浴灭活30 min，按照细菌基因组提取试剂盒使用说明进行布鲁氏菌基因组的提取，于-20 ℃保存备用。本文中涉及活菌操作均在P2实验室进行。
1.2.2 引物设计及VceC的PCR扩增 参考NCBI中布鲁氏菌T4SS的效应蛋白VceC基因序列，根据Primer 5.0软件设计特异性引物，且设计的上下游引物分别加上BspE Ⅰ和Pst Ⅰ限制性内切酶位点，见表 1。引物由上海生物工程有限公司合成。
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表 1 PCR引物序列 Table 1 PCR Primer sequence |
将VceC引物按使用说明稀释成10 μmol·L-1浓度，以提取的布鲁氏菌基因组为模板，进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照PCR试剂盒说明书进行。将PCR产物用1 %浓度的琼脂糖凝胶鉴定正确后，按照DNA纯化回收试剂盒使用说明进行胶回收。
1.2.3 VceC与pMD19T-Simple载体连接及产物鉴定 对“1.2.2”中PCR产物加A，反应体系：10×Buffer 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、rTaq酶0.5 μL、PCR产物30 μL、超纯水7.5 μL，反应程序：72 ℃ 30 min。PCR产物加A后，按照DNA纯化回收试剂盒使用说明进行回收。然后在微量离心管中加入0.5 μL的pMD19T-Simple载体和4.5 μL的PCR加A回收产物，按照pMD19T-Simple载体使用说明操作进行连接。按照感受态DH5α使用说明进行转化扩增培养，挑取单克隆，摇菌，14 h后按照质粒小提中量试剂盒使用说明提取质粒，用BspE Ⅰ和Pst Ⅰ限制性内切酶进行双酶切，1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测。将酶切鉴定正确的pMD19T-Simpl-VceC连接产物送上海生物工程有限公司测序。
1.2.4 VceC与pEGFP-C1载体连接及产物鉴定 将测序正确的pMD19T-Simple-VceC和pEGFP-C1载体用BspE Ⅰ和Pst Ⅰ限制性内切酶进行双酶切，之后用10×Loading Buffer终止反应，1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测并进行DNA回收。将回收的目的片段与线性化真核表达载体按照pEGFP-C1载体使用说明进行连接，转化感受态DH5α并扩增培养，14 h后按照质粒小提中量试剂盒使用说明提取质粒，对提取的pEGFP-C1-VceC质粒进行双酶切鉴定，部分连接产物用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测鉴定，部分送上海生物工程有限公司进行测序。
1.2.5 VceC蛋白表达鉴定 待293细胞长满六孔板的80%~90%时，按照转染试剂TurboFect使用说明，分别加入2 000、2 500、3 000 ng 3种浓度的pEGFP-C1和pEGFP-C1-VceC质粒进行转染。转染24 h后收集细胞样，按照凯基全蛋白提取试剂盒操作提取蛋白，测定蛋白浓度。在蛋白管中加入20 μL Loading Buffer，煮沸10 min，进行SDS-PAGE电泳，用转膜仪将凝胶中的蛋白转印到PVDF膜上，用脱脂奶粉将PVDF膜室温摇床摇晃封闭1 h，TBST洗涤，加入GFP一抗(小鼠抗GFP单克隆抗体)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，加入HRP标记的二抗(HRP标山羊抗小鼠IgG抗体)，摇床摇晃孵育1 h，TBST洗涤，用ECL发光液曝光，在凝胶成像系统观察并保存图片。
1.3 免疫荧光和Western blot检测质粒转染GTC的蛋白表达1.3.1 免疫荧光检测质粒转染GTC的蛋白表达 在24孔细胞培养板内接种GTC，同时制备细胞爬片，将其分为GTC空白组、pEGFP-C1空载体组和pEGFP-C1-VceC试验组，待细胞长满培养皿的80%~90%时进行pEGFP-C1和pEGFP-C1-VceC质粒转染。转染后24 h，弃掉培养液，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，PBS洗涤；0.1% Triton X-100室温通透，PBS洗涤；滴加GFP的一抗(小鼠抗GFP单克隆抗体)，湿盒内4 ℃孵育；PBS洗涤，滴加荧光二抗[荧光基因(FITC)标记山羊抗小鼠IgG抗体]，湿盒内37 ℃孵育；PBS洗涤，滴加染核试剂DAPI，避光室温孵育；吸干细胞爬片上的液体，用90%甘油固定在载玻片上，激光共聚焦显微镜检测GFP和VceC-GFP融合蛋白表达，同时采集图像。
1.3.2 Western blot检测质粒转染GTC的蛋白表达 如上在6孔细胞培养板内接种GTC，待细胞长满培养皿的80%~90%时进行pEGFP-C1和pEGFP-C1-VceC质粒转染，24 h后，Western blot检测GFP和GFP-VceC融合蛋白表达。
1.4 VceC对GTC内质网应激的标志性分子GRP78和CHOP表达量影响在6孔细胞培养板内接种GTC，分为GTC空白组、pEGFP-C1空载体组和pEGFP-C1-VceC试验组，待细胞长满培养皿的80%~90%时进行pEGFP-C1和pEGFP-C1-VceC质粒转染，转染12和24 h后进行Western blot检测GRP78和CHOP蛋白表达量变化。
1.5 VceC对GTC内质网应激UPR反应相关分子表达影响在24孔细胞培养板内接种GTC，分为GTC空白组、pEGFP-C1空载体组和pEGFP-C1-VceC试验组，待细胞长满培养皿的80%~90%时进行pEGFP-C1和pEGFP-C1-VceC质粒转染，收集转染24 h的细胞，根据Trizol试剂使用说明书操作提取RNA，根据Abcam公司的反转录试剂盒说明进行cDNA的合成。依据所测基因在基因库中mRNA的序列，通过Primer 5和Oligo 6设计IRE1、PERK、ATF6、GAPDH、XBP1和ATF4基因的定量引物，引物序列见表 2。
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表 2 实时定量PCR引物序列 Table 2 The primer sequences for the real-time quantitative PCR |
按照SYBR®Premix Ex TaqTM II Kit使用说明检测各基因在mRNA水平表达情况，所采集的数据结果用2-ΔΔCt进行分析，并用统计学软件SPSS Statistics 17.0分析差异显著性。
1.6 VceC对GTC的UPR通路中IRE1活性影响的检测在6孔细胞培养板内接种GTC，分为GTC空白组、pEGFP-C1空载体组、pEGFP-C1-VceC试验组和阳性对照组即内质网应激激活剂衣霉素(Tm)组，转染pEGFP-C1和pEGFP-C1-VceC，12 h后进行Western blot检测IRE1蛋白表达。
1.7 ELISA检测孕酮和雌激素的表达变化在24孔细胞培养板内接种GTC，分为GTC空白组、pEGFP-C1空载体组和pEGFP-C1-VceC试验组，转染pEGFP-C1和pEGFP-C1-VceC，12和24 h后分别收集细胞上清液，离心过滤，按照ELISA试剂盒(均购自大连TaKaRa公司)使用说明进行孕酮和雌激素检测。
2 结果 2.1 VceC基因真核表达载体pEGFP-C1-VceC的构建2.1.1 布鲁氏菌基因组提取和VceC基因PCR结果 凝胶电泳检测布鲁氏菌基因组提取的结果显示一条明亮的单一条带(图 1)。以提取的布鲁氏菌基因组DNA为模板进行PCR，克隆了VceC蛋白的基因，如图 2所示，在1 000~1 500 bp处显示出一条条带，大小与预期相符。
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M. DNA相对分子质量标准；A~C. 基因组 M. Standard DNA molecules; A-C. Genome 图 1 猪布鲁氏菌S2株基因组 Fig. 1 Brucella suis strain 2 genome |
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M. 4 500 bp DNA相对分子质量标准；A~C. VceC(1 257 bp) M. 4 500 bp DNA marker; A-C. VceC(1 257 bp) 图 2 PCR扩增目的片段VceC Fig. 2 PCR amplification fragment VceC |
2.1.2 pMD19T-Simple-VceC和pEGFP-C1-VceC酶切鉴定与测序结果 对pMD19T-Simple-VceC连接产物进行酶切鉴定，结果如图 3，在1 000~1 500 bp之间出现明亮单一条带，在接近3 000 bp位置有明亮条带，符合VceC(1 257 bp)和pMD19T-Simple(2 692 bp)的理论大小。对酶切鉴定正确的pMD19T-Simple-VceC测序结果与NCBI中布鲁氏菌VceC基因标准序列通过BLAST比对，结果表明所测序列与NCBI中所示序列相似性达100%，表明布鲁氏菌VceC基因克隆成功。
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A~C. VceC(1 257 bp)；M. 4 500 bp DNA相对分子质量标准 A-C. VceC(1 257 bp); M. 4 500 bp DNA marker 图 3 pMD19T-Simple-VceC连接产物酶切鉴定 Fig. 3 pMD19T-Simple-VceC product enzyme identification |
将pEGFP-C1-VceC连接产物送去上海生物工程有限公司测序，所得测序结果与NCBI上布鲁氏菌VceC基因标准序列比对，显示相似性达100%，说明VceC蛋白的真核表达载体pEGFP-C1-VceC构建成功。
2.2 VceC蛋白表达转染293T细胞确定VceC蛋白是否成功表达时，设置了一定范围内的梯度浓度进行细胞转染，通过Western blot检测绿色荧光蛋白(GFP)和VceC-GFP融合蛋白的表达变化，结果转染pEGFP-C1的细胞在27 ku位置显示条带，为GFP蛋白条带，转染pEGFP-C1-VceC的细胞在73 ku位置显示条带，符合VceC-GFP融合蛋白理论大小，说明蛋白表达成功，且转染质粒2 000 ng时目的蛋白表达量较高(图 4 A、B)。
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A. GFP表达; B. VceC-GFP融合蛋白的表达 A. Expression of GF; B. Expression of VceC-GFP 图 4 GFP和VceC-GFP在质粒不同浓度转染下的表达量 Fig. 4 Expression of GFP and VceC-GFP protein at different concentration of plasmid to transfection |
2.3.1 免疫荧光检测GFP和VceC-GFP表达 pEGFP-C1和pEGFP-C1-VceC质粒转染GTC 24 h后的细胞，免疫荧光结果显示GTC空白组没有绿色荧光，转染质粒的其他组细胞约90%有绿色荧光蛋白表达(图 5)。
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图 5 GFP和VceC-GFP在质粒转染GTC内表达(细胞爬片免疫荧光法) Fig. 5 Expression of GFP and VceC-GFP protein in plasmind-transfected GTCs(Cell immunofluorescence assay) |
2.3.2 Western blot检测GFP和VceC-GFP表达 pEGFP-C1和pEGFP-C1-VceC质粒转染GTC 24 h后，Western blot结果显示GTC空白组在27和73 ku位置均没有显示蛋白条带，pEGFP-C1组在27 ku处显示条带，与GFP理论大小相符合，pEGFP-C1-VceC组在73 ku位置显示条带，与VceC-GFP融合蛋白理论大小相符合(图 6)。
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c24 h. control组24 h；p24 h. pEGFP-C1组24 h；v24 h. pEGFP-C1-VceC组24 h，下同 c24 h. control group 24 h; p24 h. pEGFP-C1 group 24 h; v24 h. pEGFP-C1-VceC group 24 h, the same as below 图 6 GFP和VceC-GFP在质粒转染GTC内表达(Western blot法) Fig. 6 Expression of GFP and VceC-GFP protein in plasmind-transfected GTCs (Western blot assay) |
通过Western blot检测了内质网应激的标志性蛋白GRP78和CHOP表达量的变化，结果显示，转染12 h后，VceC组GRP78蛋白表达量显著高于空白组和pEGFP-C1组，24 h后，VceC组GRP78蛋白表达量仍显著高于其他组(图 7A、B)；CHOP蛋白表达量在转染12 h后无明显变化，24 h后VceC组显著低于其他组(图 7A、C)。结果表明，VceC蛋白能够激发GTC的内质网应激反应。
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A. GRP78和CHOP蛋白条带；B、C. GRP78和CHOP蛋白条带灰度分析量化值。*.P < 0.05，**.P < 0.01 A. Protein bands of GRP78 and CHOP; B, C. Quantification of GRP78 and CHOP bands. *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 7 GRP78和CHOP在质粒转染GTC内的表达变化 Fig. 7 Quantitative expressions of GRP78 and CHOP in plasmind-transfected GTCs |
上述结果表明，VceC能引起GTC的内质网应激反应，作者进而在mRNA水平初步研究了VceC对UPR 3条信号通路相关分子表达的影响。结果显示，VceC转染GTC 24 h后，IRE1 mRNA表达量相比于其他两组显著升高(P < 0.05)(图 8A)，而PERK、ATF6和ATF4 mRNA的表达量没有发生显著变化(图 8B、C、E)，XBP-1 mRNA的表达量显著高于其他两组(P < 0.05)(图 8D)。
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*. P < 0.05 图 8 UPR相关分子在mRNA水平表达变化 Fig. 8 The mRNA expression levels of UPR associated molecules |
进一步用Western blot检测结果表明，VceC转染组的IRE1表达量显著高于GTC空白组和pEGFP-C1空载体组(P < 0.01)，但是低于内质网应激激活剂Tm组的表达(P < 0.05)(图 9A、B)。表明VceC可激活UPR的IRE1通路。
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A.IRE1蛋白条带；B.IRE1蛋白条带灰度分析量化值。*.P < 0.05，**.P < 0.01 A. Protein bands of IRE1; B. Quantification of IRE1 band. *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 9 转染12 h IRE1在不同处理组的表达 Fig. 9 Expression of IRE1 at 12 h after transfection in different groups |
如图 10所示，VceC转染GTC 12和24 h后孕酮浓度均显著低于GTC空白组和pEGFP-C1空载体组(P < 0.01)(图 10 A)，雌激素含量有一定升高，但变化不显著(图 10 B)。
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**.P < 0.01 图 10 VceC对GTC分泌性腺激素的影响(ELISA) Fig. 10 Effects of VceC on Endocrine of gonadal hormones in GTC (by ELISA) |
布鲁氏菌进入宿主细胞后是如何逃逸宿主的杀灭机制仍然不是很清楚，有研究表明，可能是释放大量的各种效应分子进入宿主细胞质中[18]，帮助布鲁氏菌运输到达内质网，在内质网内生存并建立增殖小室，且大量繁殖[19]。目前，研究已经鉴别出多种T4SS分泌的效应分子，不同效应分子其功能和发挥功能的时期可能相同也可能不同。如BtpA和BtpB都能够抑制树突状细胞的成熟和NF-κB的激活[20-21]；BspA、BspB和BspF在转染细胞内过表达时可以抑制宿主细胞的蛋白分泌途径，但仅在感染后期发挥它们的影响力[22]；SepA缺失突变株在布鲁氏菌感染巨噬细胞48 h后增殖能力表现出轻微的减弱，在感染4~24 h后增殖能力是显著地下降，表明SepA是参与胞内生存的最初阶段[23]；VceC在所有布鲁氏菌种里高度保守，是最早进入宿主细胞的，因此研究它在布鲁氏菌感染宿主细胞过程中的毒力具有重要意义。在HeLa细胞和小鼠巨噬细胞VceC表现出可以激活未折叠蛋白反应，引起内质网应激，并且在感染期间诱导产生前炎性应答反应[8]，但是在布鲁氏菌侵染宿主细胞时是如何发挥细胞毒性作用的仍然不是很清楚[7]，需要进一步的研究来阐明VceC与Bip两者之间互作的性质和结果。BiP/GRP78在蛋白质分泌和维持内质网稳态中起着关键作用[24-25]，但如果内质网应激长时间持续，细胞无法恢复正常生理功能，那么促凋亡蛋白CHOP表达量增加[26-27]，细胞就会发生程序性死亡[26]。本研究为了阐明VceC蛋白在布鲁氏菌侵染宿主细胞GTC过程中对内质网应激的影响，试验进行VceC真核表达载体的构建及转染，结果显示，布鲁氏菌S2株VceC引起了GTC内质网应激，GRP78表达显著升高，CHOP表达降低，表明VceC蛋白对不同的宿主细胞均能引起内质网应激，使细胞恢复正常生理功能，进而布鲁氏菌可以在宿主细胞内生存增殖。
布鲁氏菌侵染诱发UPR反应，内质网伴侣分子GRP78与PERK、ATF6和IRE1进行解离，诱发PERK、ATF6和IRE1通路来降低内质网应激引起的细胞损伤，其中IRE1通路中下游的XBP-1的激活有利于细胞维持内质网稳态[14]。不同的宿主细胞产生的UPR反应所侧重的通路有所不同。许多研究已证实感染牛型布鲁氏菌和羊型布鲁氏菌后，UPR反应的产生会促进这些菌种在细胞内的生存[28-30]，尤其是IRE1通路的激活[30]。但具体是布鲁氏菌的何种成分引发产生UPR的机制仍然不是很清楚。在巨噬细胞内，生存和增殖对于慢性布鲁氏菌感染的建立是极其重要的。毒型光滑型布鲁氏菌株，如牛型布鲁氏菌株2308和光滑型猪型布鲁氏菌株，会抑制巨噬细胞程序性死亡而在巨噬细胞内进行增殖[31-32]，但具体的机制不清楚。相比而言，粗糙型牛型布鲁氏菌株，如RB51和RA1，会以一种依赖于Caspase-2方式诱导巨噬细胞死亡[33]。因此，研究效应分子VceC在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中能否通过诱发UPR反应来成功处理内质网应激进而抑制细胞凋亡极其重要。本研究通过检测布鲁氏菌S2株VceC对GTC的UPR影响，结果表明UPR通路中相关分子在mRNA水平表达变化的有IRE1和XBP-1，可能影响IRE1通路；进一步检测IRE1蛋白水平表达变化，说明VceC激活UPR信号通路中的IRE1途径，即VceC在布鲁氏菌侵染GTC时通过IRE1途径引起GTC内质网应激反应，进一步说明VceC可能具有一定的抑制细胞凋亡作用，猜测VceC在布鲁氏菌侵染宿主细胞内的生存增殖起到较为重要的作用。
胎盘滋养层细胞功能的正常是保证母胎交流、妊娠维持、胎儿发育的关键，其分泌的各种激素对母畜妊娠产生、胎儿发育及分娩发生具有重要作用[34]。孕酮是母畜妊娠维持的关键激素，在整个妊娠阶段，高浓度的孕酮能维持子宫容受性，抑制雌激素对子宫的收缩[35-36]。有研究表明布鲁氏菌S2株的侵染是通过损害滋养层细胞分泌激素的平衡和子宫内膜上皮细胞的容受性，而非通过破坏滋养层细胞的迁移和侵袭力来引起母畜流产及早产[37]。本研究的结果显示VceC可以使GTC分泌孕酮浓度降低，而雌激素浓度则无显著变化，说明VceC在布鲁氏菌侵染GTC过程中对性腺激素比例的改变，进而可能对生殖产生影响，但是具体的机制有待进一步研究。
由细菌转染进入宿主细胞的效应分子在细菌和宿主之间提供一个桥梁，并且位于二者之间作用的前沿。研究效应分子不仅仅有助于理解细菌的致病机制，而且也为真核细胞的免疫应答研究提供更广阔视野。弱的免疫应答能力是宿主细胞对布鲁氏菌的感染无能为力是一个主要的原因[38]。因此，研究布鲁氏菌分泌的效应分子可能为这种胞内菌特异阻止宿主免疫信号途径的机制提供一定的视角。这些机制的解析有助于开发更好的防制布鲁氏菌的疫苗和治疗方案。
4 结论本研究构建了pEGFP-C1-VceC真核表达载体，所转染的细胞表达VceC蛋白。VceC蛋白能够激发GTC的内质网应激反应，且是通过激活UPR中的IRE1通路。VceC蛋白引起GTC孕酮分泌显著降低，推测VceC蛋白与布鲁氏菌感染引起的流产可能相关。
| [1] |
陆承平. 兽医微生物学[M]. 5版. 北京: 中国农业出版社, 2013. LU C P. Veterinary Microbiology[M]. 5th Edition. Beijing: China Agriculture Press, 2013. (in Chinese) |
| [2] |
ATLURI V L, XAVIER M N, DE JONG M F, et al. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts[J]. Annu Rev Microbiol, 2011, 65: 523-541. DOI:10.1146/annurev-micro-090110-102905 |
| [3] |
CASWELL C C. Assessment of survival and replication of Brucella spp. in murine peritoneal macrophages[M]//ALLEN I C. Mouse Models of Innate Immunity. New York: Humana Press, 2019, 1960: 181-189.
|
| [4] |
FRANCO M P, MULDER M, SMITS H L. Persistence and relapse in brucellosis and need for improved treatment[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2007, 101(9): 854-855. DOI:10.1016/j.trstmh.2007.05.016 |
| [5] |
BYNDLOSS M X, TSAI A Y, WALKER G T, et al. Brucella abortus infection of placental trophoblasts triggers endoplasmic reticulum stress-mediated cell death and fetal loss via type IV secretion system-dependent activation of CHOP[J]. mBio, 2019, 10(4): e01538-19. |
| [6] |
ZHOU Y C, BU Z Y, QIAN J, et al. The UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase of Brucella melitensis inhibits the activation of NF-κB via regulating the bacterial type IV secretion system[J]. Int J Biol Macromol, 2020, 164: 3098-3104. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2020.08.134 |
| [7] |
DE JONG M F, SUN Y H, DEN HARTIGH A B, et al. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system[J]. Mol Microbiol, 2008, 70(6): 1378-1396. DOI:10.1111/j.1365-2958.2008.06487.x |
| [8] |
DE JONG M F, STARR T, WINTER M G, et al. Sensing of bacterial type IV secretion via the unfolded protein response[J]. mBio, 2013, 4(1): e00418-12. |
| [9] |
ZIMMERMANN R. Components and mechanisms of import, modification, folding, and assembly of immunoglobulins in the endoplasmic reticulum[J]. J Clin Immunol, 2016, 36 Suppl 1: 5-11. |
| [10] |
WANG M, KAUFMAN R J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease[J]. Nature, 2016, 529(7586): 326-335. DOI:10.1038/nature17041 |
| [11] |
PLUQUET O, POURTIER A, ABBADIE C. The unfolded protein response and cellular senescence. A review in the theme: cellular mechanisms of endoplasmic reticulum stress signaling in health and disease[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2015, 308(6): C415-C425. DOI:10.1152/ajpcell.00334.2014 |
| [12] |
GORMAN A M, HEALY S J M, JÄGER R, et al. Stress management at the ER: regulators of ER stress-induced apoptosis[J]. Pharmacol Ther, 2012, 134(3): 306-316. DOI:10.1016/j.pharmthera.2012.02.003 |
| [13] |
CLÁUDIO N, DALET A, GATTI E, et al. Mapping the crossroads of immune activation and cellular stress response pathways[J]. EMBO J, 2013, 32(9): 1214-1224. DOI:10.1038/emboj.2013.80 |
| [14] |
TODD D J, LEE A H, GLIMCHER L H. The endoplasmic reticulum stress response in immunity and autoimmunity[J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8(9): 663-674. DOI:10.1038/nri2359 |
| [15] |
MCCONKEY C A, DELORME-AXFORD E, NICKERSON C A, et al. A three-dimensional culture system recapitulates placental syncytiotrophoblast development and microbial resistance[J]. Sci Adv, 2016, 2(3): e1501462. DOI:10.1126/sciadv.1501462 |
| [16] |
SFERRUZZI-PERRI A N, CAMM E J. The programming power of the placenta[J]. Front Physiol, 2016, 7: 33. |
| [17] |
MARTÍNEZ R, DUNNER S, TORO R, et al. Effect of polymorphisms in the Slc11a1 coding region on resistance to brucellosis by macrophages in vitro and after challenge in two Bos breeds (Blanco Orejinegro and Zebu)[J]. Genet Mol Biol, 2010, 33(3): 463-470. DOI:10.1590/S1415-47572010000300014 |
| [18] |
BOSCHIROLI M L, OUAHRANI-BETTACHE S, FOULONGNE V, et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(3): 1544-1549. DOI:10.1073/pnas.032514299 |
| [19] |
CELLI J, DE CHASTELLIER C, FRANCHINI D M, et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum[J]. J Exp Med, 2003, 198(4): 545-556. DOI:10.1084/jem.20030088 |
| [20] |
SALCEDO S P, MARCHESINI M I, DEGOS C, et al. BtpB, a novel Brucella TIR-containing effector protein with immune modulatory functions[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2013, 3: 28. |
| [21] |
SENGUPTA D, KOBLANSKY A, GAINES J, et al. Subversion of innate immune responses by Brucella through the targeted degradation of the TLR signaling adapter, MAL[J]. J Immunol, 2010, 184(2): 956-964. DOI:10.4049/jimmunol.0902008 |
| [22] |
MYENI S, CHILD R, NG T W, et al. Brucella modulates secretory trafficking via multiple type IV secretion effector proteins[J]. PLoS Pathog, 2013, 9(8): e1003556. DOI:10.1371/journal.ppat.1003556 |
| [23] |
DÖHMER P H, VALGUARNERA E, CZIBENER C, et al. Identification of a type IV secretion substrate of Brucella abortus that participates in the early stages of intracellular survival[J]. Cell Microbiol, 2014, 16(3): 396-410. DOI:10.1111/cmi.12224 |
| [24] |
DUDEK J, BENEDIX J, CAPPEL S, et al. Functions and pathologies of BiP and its interaction partners[J]. Cell Mol Life Sci, 2009, 66(9): 1556-1569. DOI:10.1007/s00018-009-8745-y |
| [25] |
MUNRO S, PELHAM H R B. An Hsp70-like protein in the ER: identity with the 78 kd glucose-regulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein[J]. Cell, 1986, 46(2): 291-300. DOI:10.1016/0092-8674(86)90746-4 |
| [26] |
GIORGI C, BONORA M, SORRENTINO G, et al. p53 at the endoplasmic reticulum regulates apoptosis in a Ca2+-dependent manner[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(6): 1779-1784. DOI:10.1073/pnas.1410723112 |
| [27] |
OYADOMARI S, MORI M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress[J]. Cell Death Differ, 2004, 11(4): 381-389. DOI:10.1038/sj.cdd.4401373 |
| [28] |
QIN Q M, PEI J W, ANCONA V, et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1α in supporting Brucella replication[J]. PLoS Pathog, 2008, 4(7): e1000110. DOI:10.1371/journal.ppat.1000110 |
| [29] |
SMITH J A, KHAN M, MAGNANI D D, et al. Brucella induces an unfolded protein response via TcpB that supports intracellular replication in macrophages[J]. PLoS Pathog, 2013, 9(12): e1003785. DOI:10.1371/journal.ppat.1003785 |
| [30] |
TAGUCHI Y, IMAOKA K, KATAOKA M, et al. Yip1A, a novel host factor for the activation of the IRE1 pathway of the unfolded protein response during Brucella infection[J]. PLoS Pathog, 2015, 11(3): e1004747. DOI:10.1371/journal.ppat.1004747 |
| [31] |
HE Y Q, REICHOW S, RAMAMOORTHY S, et al. Brucella melitensis triggers time-dependent modulation of apoptosis and down-regulation of mitochondrion-associated gene expression in mouse macrophages[J]. Infect Immun, 2006, 74(9): 5035-5046. DOI:10.1128/IAI.01998-05 |
| [32] |
TOLOMEO M, DI CARLO P, ABBADESSA V, et al. Monocyte and lymphocyte apoptosis resistance in acute and chronic brucellosis and its possible implications in clinical management[J]. Clin Infect Dis, 2003, 36(12): 1533-1538. DOI:10.1086/375223 |
| [33] |
CHEN F, HE Y Q. Caspase-2 mediated apoptotic and necrotic murine macrophage cell death induced by rough Brucella abortus[J]. PLoS One, 2009, 4(8): e6830. DOI:10.1371/journal.pone.0006830 |
| [34] |
JI L, BRKIĆ J, LIU M, et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia[J]. Mol Aspects Med, 2013, 34(5): 981-1023. DOI:10.1016/j.mam.2012.12.008 |
| [35] |
HALASZ M, SZEKERES-BARTHO J. The role of progesterone in implantation and trophoblast invasion[J]. J Reprod Immunol, 2013, 97(1): 43-50. DOI:10.1016/j.jri.2012.10.011 |
| [36] |
WANG X G, LIN P F, LI Y, et al. Brucella suis vaccine strain 2 induces endoplasmic reticulum stress that affects intracellular replication in goat trophoblast cells in vitro[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2016, 6: 19. |
| [37] |
王相国. 内质网应激在布鲁氏菌体外感染山羊子宫内膜与滋养层细胞中的作用[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2016. WANG X G. The Role of endoplasmic reticulum stress in Brucella-infected goat endometrial and trophoblast cells in vitro[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2016. (in Chinese) |
| [38] |
MARTIROSYAN A, PÉREZ-GUTIERREZ C, BANCHEREAU R, et al. Brucella β 1, 2 cyclic Glucan is an activator of human and mouse dendritic cells[J]. PLoS Pathog, 2012, 8(11): e1002983. DOI:10.1371/journal.ppat.1002983 |
(编辑 孟培)