伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病病毒(PRV)引起的一种烈性传染病,以种猪的繁殖障碍、育肥猪的呼吸困难、生长缓慢和仔猪的脑脊髓炎为主要特征,妊娠期的母猪会出现流产、死胎、木乃伊胎等现象,仔猪感染后死亡率极高[1]。猪是PRV的唯一自然感染宿主、长期贮存和传播宿主。有研究表明,PRV可感染包括猪在内的多种脊椎动物[2-3]。最近研究表明,PRV的变异株可感染人,对人的神经系统和呼吸系统造成严重损害,表现为高热和脑炎[4-6]。PRV感染宿主的扩大引起对PRV跨物种传播的重视,已成为威胁危害公共健康的重要问题。
PRV入侵机体后,宿主可以通过炎症因子与抗病毒蛋白来抵抗病毒的感染,但是宿主体内蛋白数量众多,筛选有效抑制病毒入侵的宿主蛋白非常重要。郭振华等[7]发现敲低宿主膜联蛋白A2(ANXA2)的表达,可以显著抑制PRV在PK-15细胞上的复制增殖;过表达ANXA2可以抑制PRV或者凋亡刺激剂诱导的细胞凋亡。徐晶晶等[8]通过免疫沉淀、质谱筛选等方法发现宿主蛋白凋亡诱导因子(AIFM1)能与PRV编码的UL16相互作用以抑制PRV的复制。王书文等[9]通过免疫共沉淀、激光共聚焦的方法,探究出宿主蛋白Nedd4能与PRV的UL56蛋白相互作用。传统方法筛选抗病毒相关宿主蛋白往往耗时耗力,新兴的蛋白质组学技术可以很好的解决这些问题。串联质谱标签(TMT)标记定量蛋白组学技术是一种多肽体外等重同位素标记的相对与绝对定量技术,通过该技术可以更精确的筛选出与抗病毒相关的宿主蛋白,使这些蛋白成为新药物设计的潜在靶点,也为疾病的早期诊断提供分子标志[10-12]。采用蛋白质组学技术筛选病毒感染前后的差异蛋白成为主要手段。
实验室在前期研究中,通过TMT标记定量蛋白组学技术分析PRV感染PK15细胞前后的差异蛋白[13],本试验对筛选的差异蛋白进行验证,并分析其在PRV复制中的作用,为探究PRV与宿主的相互作用及其分子机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料猪肾上皮细胞(PK15)、ISG15基因敲除的PK15细胞(ISG15-/--PK15)、pCAGGS-HA、IFN-β-Luc、pRL-TK由本实验室保存;PRV变种QXX(GenBank登录号KF017332.1),2012年,在病猪中分离得到,并保存于本实验室。pEASY®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit购自全式金生物技术有限公司;普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司;限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ、RNAiso Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser购自宝日医生物技术有限公司;MonAmpTM SYBR® Green qPCR Mix试剂购自莫纳生物科技有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega;PRV-gE鼠单克隆抗体购自普莱柯生物工程股份有限公司;STRAP兔多克隆抗体、IL18兔多克隆抗体、MCCC1兔多克隆抗体、Hsp40兔多克隆抗体购自Proteintech;β-actin抗体购自赛维尔生物科技有限公司。
1.2 差异表达蛋白的荧光定量PCR和Western blot验证本实验室前期研究结果表明,PRV感染PK15细胞和ISG15-/--PK15细胞后均在24 h病毒复制达到最大值[13]。根据蛋白组学数据处理和生物信息学分析结果,筛选免疫相关分子STRAP、MCCC1、IL18、Hsp40。利用RT-qPCR和Western blot对PRV感染24 h的细胞样品中相关分子的转录水平和蛋白水平进行验证。所用荧光定量引物均通过NCBI设计(表 1)。分析基因表达的倍数差异,同时结合蛋白组学结果比较分析。
1.3.1 真核表达载体的构建 根据NCBI网站所公布的猪STRAP、MCCC1、IL18和Hsp40基因序列(GenBank:XM_003355564.4、XM_021069889.1、NM_213997.1、XM_013999339.2),利用Primer 5设计扩增全长的基因引物,并应用Primer-Blast设计RT-qPCR引物(表 2)。
自PK15细胞提取RNA,反转录为cDNA,以此为模板利用设计的特异性引物进行PCR扩增,同时使用KpnⅠ和XhoⅠ限制性内切酶对pCAGGS-HA质粒进行双酶切,所得PCR产物和酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。回收正确的扩增片段和线性化载体,将其通过同源重组的方法进行连接。
1.3.2 宿主蛋白过表达对PRV转录水平的影响 PK15细胞转染4个宿主蛋白的真核表达质粒,按照Lipofectamine 3000说明书操作,12 h后PRV(MOI=2)感染细胞,24 h后收取RNA。Trizol法提取RNA并反转录成cDNA,以cDNA为模板,进行RT-qPCR检测。反应体系20 μL:MonAmpTM SYBR Green qPCR Mix 10 μL,上、下游引物(0.2 μmol·L-1),各0.4 μL,cDNA 3 μL,ddH2O 6.2 μL。反应条件:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性10 s,60 ℃退火和延伸30 s,共40个循环。以β-actin mRNA表达水平为内参值,计算PRV-gE转录水平。
1.3.3 宿主蛋白的过表达对PRV蛋白表达的影响 PK15细胞转染4个宿主蛋白的真核表达质粒,12 h后PRV感染细胞,24 h后收取细胞蛋白。BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后转膜,5%脱脂奶室温封闭1 h后,加入相应的特异性抗体(1∶3 000)4 ℃摇床过夜孵育,TBST洗膜3次,室温孵育HRP标记的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)1 h后ECL显影。以β-actin作为内参,Image J软件分析条带灰度值。
1.3.4 宿主蛋白的对PRV子代病毒滴度的影响 PK15细胞每孔加入400 μL的DMEM培养基,含PRV细胞上清液按照4倍梯度稀释后加入孔中,置于37 ℃、5% CO2培养箱1 h,期间每隔15 min均匀晃动一次,以便病毒吸附;弃去含PRV稀释液DMEM,加入含1%低熔点琼脂糖的细胞维持培养基,置于37 ℃、5% CO2培养箱培养3 d;取出细胞培养板,10%甲醛室温固定30 min,0.5%结晶紫染色15 min后冲洗多余结晶紫染液,选择合适的稀释度进行计数与计算。
1.4 宿主蛋白对IFN-β启动子活性的影响PK15细胞共转染IFN-β-Luc、pRL-TK与4个宿主蛋白的真核表达质粒,12 h后PRV感染细胞,48 h后检测启动子活性。按照试剂盒说明书操作,加入裂解液,在摇床上充分裂解,收集细胞裂解液,离心收集上清。加入萤火虫荧光素酶反应液检测萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase) 活性。随后加入海肾荧光素酶反应液检测海肾荧光素酶(Renilla luciferase)活性。最终计算出IFN-β启动子相对活性。
1.5 敲低筛选蛋白对PRV复制的影响1.5.1 siRNA最佳浓度的筛选 PK15细胞转染不同浓度的(0、10、25、50 nmol·L-1)si-STRAP/MCCC1,24 h后收取RNA检测其转录水平(方法同“1.3.2”)。siRNA由上海吉玛有限公司合成,序列见表 3。
1.5.2 敲低宿主蛋白对PRV复制的影响 PK15细胞转染si-STRAP/MCCC1,12 h后PRV感染细胞,24 h后收取RNA、蛋白和上清。分别检测PRV-gE的转录水平(方法同“1.3.2”)和蛋白表达(方法同“1.3.3”)以及子代病毒滴度(方法同“1.3.4”)。
1.6 统计学分析各试验均平行重复3次,通过GraphPad Prism 8.0软件中T-test检验方法对数据结果进行统计学分析。
2 结果 2.1 差异蛋白的鉴定为保证获得的蛋白质组数据的可靠性,选取4个蛋白(STRAP、MCCC1、IL18、Hsp40)进行RT-qPCR和Western blot验证,这些蛋白代表了上调和下调的蛋白组。如图 1A、B所示,PRV感染ISG15-/--PK15细胞中这些基因的RT-qPCR和Western blot分析结果与TMT定量蛋白质组学分析结果一致(表 4)。结果表明,采用TMT定量蛋白组学技术鉴定的DEPs具有较高的可信度。在PRV感染PK15细胞后的RT-qPCR与Western blot结果中,MCCC1、IL18、Hsp40结果均保持一致,STRAP表达出现了与ISG15-/--PK15细胞不一致的结果(图 1C、D)。
2.2.1 宿主蛋白的过表达对PRV转录水平的影响 以PK15细胞cDNA作为模板,利用STRAP、MCCC1、IL18、Hsp40的特异性引物扩增并构建重组质粒。4个重组质粒双酶切后均与预期分子量大小相符。经测序分析分别与NCBI数据库中猪源STRAP、MCCC1、IL18、Hsp40的碱基序列相似度为100%,说明重组表达质粒构建成功。
通过蛋白组学分析以及查阅相关文献筛选出4个抗病毒相关的宿主蛋白,为了验证4个宿主蛋白是否可以抑制PRV的复制。首先通过RT-qPCR检测PK15细胞过表达宿主蛋白对PRV-gE转录水平的影响。结果显示,与对照组相比,STRAP、MCCC1、IL18、Hsp40对PRV-gE的转录水平均有显著的抑制作用(图 2)。
2.2.2 宿主蛋白的过表达对PRV蛋白水平的影响 为进一步验证宿主蛋白对PRV-gE复制的影响,Western blot检测PK15细胞过表达宿主蛋白对PRV-gE蛋白水平的影响。结果显示,与对照组相比,STRAP、MCCC1、IL18、Hsp40均显著抑制PRV-gE蛋白表达(图 3)。
2.2.3 宿主蛋白的过表达对PRV子代病毒滴度的影响 为研究宿主蛋白对PRV病毒滴度的影响,通过病毒噬斑检测PK15细胞过表达宿主蛋白后病毒滴度的变化。结果显示,与对照组相比,过表达STRAP、MCCC1、IL18、Hsp40后病毒滴度显著下降(图 4)。
前面研究表明,过表达宿主蛋白均可抑制PRV复制。有研究报道PRV复制主要受Ⅰ型干扰素通路影响[9]。因此,接下来将要筛选与Ⅰ型干扰素通路相关宿主蛋白。为了进一步筛选出差异表达蛋白,利用双荧光素酶报告基因检测四个宿主蛋白对IFN-β启动子活性的影响。结果如图 5所示,与对照组相比,STRAP和MCCC1的促进作用最为显著,所以接下来从STRAP和MCCC1中筛选一个对PRV复制影响最大的宿主蛋白。
2.4.1 siRNA最佳浓度的筛选 针对MCCC1、STRAP设计siRNA,分别使用不同浓度的siRNA转染PK15细胞后24 h提取细胞RNA,检测其转录水平。结果如图 6所示,si-MCCC1浓度为25 nmol·L-1时敲低效率最高,为71.56%(图 6A);si-STRAP浓度为10 nmol·L-1时敲低效率最高,为87.63%(图 6B)。可用于后续试验。
2.4.2 敲低宿主蛋白对PRV复制的影响 为了进一步筛选抑制PRV复制的宿主蛋白,作者检测了敲低宿主蛋白对PRV复制的影响。结果显示,敲低STRAP可以显著促进PRV-gE的转录水平(图 7D),而敲低MCCC1对PRV-gE的转录水平影响不大(图 7A)。蛋白水平也是类似的结果(图 7E, B)。病毒噬斑的结果显示敲低STRAP对PRV的病毒滴度有显著的促进作用(图 7F),而敲低MCCC1对PRV病毒滴度影响不大(图 7C)。
病毒侵入机体后,机体通过上调或下调宿主蛋白以抵抗病毒的感染。TMT定量蛋白组学技术具有检测范围广、试验结果可靠、重复性高等优点。通过该技术可以更精确地筛选出抗病毒相关的宿主蛋白。利用TMT定量蛋白组学分析PRV感染后差异表达的蛋白质,有助于进一步理解PRV的致病机制。本研究中,作者通过定量蛋白组学的结果鉴定出241个差异表达的蛋白质,并利用生物数据库分析这些差异蛋白质生物学功能和参与的信号通路[14]。丁小满等[15]通过蛋白质组学技术筛选出了甲型流感病毒(H7N9)感染后的差异蛋白。刘龙和陈红英等[16]的研究中也通过定量蛋白组学技术筛选出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后的39个差异蛋白,并且通过RT-qPCR和Western blot验证了SPP1、IFIT3、STAT3和IL8蛋白。作者前期也通过相同的方法进行分析与筛选,最终确定了4个宿主蛋白,分别是Hsp40、IL18、MCCC1和STRAP。
热休克蛋白40(Hsp40)家族蛋白能够调节多种病毒复制,有研究报道Hsp40家族成员B1调节单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)和人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制[17]。本研究中作者检测到PRV感染的细胞中Hsp40蛋白水平表达上调,说明Hsp40在抑制PRV的复制中也起到一定的作用。甲基巴豆酰辅酶a羧化酶1(MCCC1)主要位于线粒体内[18]。有研究报道MCCC1通过靶向MAVS信号体激活NF-κB信号,从而抑制病毒的复制,例如甲型流感病毒(IAV)、水泡性口炎病毒(VSV)[19]。本研究中PRV感染细胞中MCCC1蛋白表达上调,说明MCCC1可能通过NF-κB信号通路抑制PRV复制。白细胞介素(IL)18是促炎细胞因子,其血浆水平在人类疱疹病毒(EBV)感染的急性期显著升高[20]。在另一项研究中,感染肝炎病毒的IL18-/-小鼠与野生型小鼠相比,生存率显著降低[21]。这表明IL18在病毒的抵抗和清除过程中具有很重要的作用。
丝氨酸/苏氨酸激酶受体相关蛋白(STRAP)包含七个WD40结构域。WD40结构域通过介导蛋白相互作用参与多种信号通路[22-24]。最近的研究报道,STRAP调控多种信号转导通路,包括PI3K/PDK、ASK1和p53通路[22]。研究表明,STRAP通过促进TAK1-IKKα-p65相互作用参与激活TLR2/4介导的细胞因子产生[24]。然而,尚不完全清楚STRAP在TBK1介导的TLR3激活和IFN-β产生中的作用。本研究发现PK15细胞感染PRV后STRAP表达上调,而ISG15-/--PK15细胞感染PRV后STRAP表达下调。说明PRV感染后,STRAP在Ⅰ型干扰素通路抗病毒过程中起到重要的作用。
为了进一步的探究这4个宿主蛋白的功能,首先构建真核表达载体,发现Hsp40、MCCC1、IL18、STRAP过表达均能抑制PRV的复制。随后通过双荧光素酶报告基因检测,进一步筛选出能够显著促进IFN-β启动子活性的MCCC1与STRAP。最后针对MCCC1与STRAP设计siRNA序列,探究敲低MCCC1/STRAP对PRV复制的影响,结果显示敲低MCCC1对PRV的复制没有显著的影响,而敲低STRAP能够显著促进PRV的复制。
4 结论通过蛋白功能分析初步筛选出4个与抗病毒相关宿主蛋白,又通过一系列的试验最终确定影响PRV复制的宿主蛋白STRAP。接下来将深入研究STRAP对PRV复制的影响,阐明STRAP抑制PRV复制的分子机制,为PRV的防控提供理论基础。
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(编辑 孟培)