猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是危害世界养猪业最严重的病毒性疾病之一，临床表现主要包括妊娠母猪流产、早产、产死胎和木乃伊胎，仔猪消瘦、生长缓慢以及成活率下降等，以及各年龄育肥猪的呼吸系统疾病。其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)能够诱导机体免疫抑制，导致继发感染或混合感染[1]。PRRSV的另一特点是变异速度较快。目前，我国主要流行亚型为PRRSV-2(高致病毒株、NADC-30样毒株和NADC-34样毒株)，近年来，陆续出现PRRSV-1[2-5]。此外，我国多地免疫猪群出现野毒株和疫苗毒株重组的新毒株，并呈现多毒株并存的现象[6]，提示现有的商品化疫苗并不能提供很好的交叉保护，给该病的有效免疫防控带来巨大困难。因此，新的PRRSV防控手段的研发迫在眉睫。抗病毒药物是控制病毒性疾病的一个重要研究方向。天然产物，特别是传统中草药分布广泛、简便易得、低毒，并且可以作为动物饲料的一部分[7]。因其在临床治疗病毒感染性疾病中疗效显著，成为新药物发现的宝贵资源。目前，已经证明多种天然化合物可作为抗PRRSV的潜在药物[8-10]。双香豆素[3, 3-亚甲基双(4-羟基香豆素), dicumarol, DIC]存在于芸香科植物、伞形科植物、菊科植物、豆科植物，主要作为一种抗凝剂用于血栓的预防和治疗，同时也可以通过调节酶活性、诱导细胞凋亡等机制，具有一定的抗病毒作用[11-14]。DIC对PRRSV是否具有抑制作用尚未可知。因此研究DIC对PRRSV增殖的影响并确定其机制，能够为PRRSV预防和控制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料1.1.1 细胞和病毒 Marc-145细胞(非洲绿猴肾上皮细胞)及高致病性PRRSV毒株BB0907均由南京农业大学姜平教授馈赠。
1.1.2 主要试剂与仪器 双香豆素(dicumarol，DIC)购自上海麦克林生化科技有限公司；PRRSV N蛋白单克隆抗体由南京农业大学姜平教授馈赠；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(A0216)购自上海碧云天生物技术有限公司；RNA提取试剂TRIzol、DMEM均购自Invitrogen公司。恒温二氧化碳无菌细胞培养箱(Thermo，型号：3543)；荧光定量PCR仪(Stratagene公司，型号：Mx 3005P)；酶标仪(Bio-RAD，型号：BR-680)。
1.2 方法1.2.1 Western blot 使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白，按照碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。根据BCA结果将各组蛋白浓度调整统一。加入5×Loading Buffer混匀后，置于100 ℃沸水中煮10 min。利用12.5%聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质样品，并电印迹到硝酸纤维素膜膜上，通过封闭、孵育PRRSV N蛋白单克隆抗体(1∶1 500)、孵育辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶2 000)等步骤检测目标蛋白。
1.2.2 荧光定量PCR 每孔Marc-145细胞加入200 μL TRIzol收集细胞，按照总RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，依据HiScript Ⅱ 1 st Strand cDNA Synthesis进行RNA反转录。以cDNA为模板，依据qPCR SYBE Green Master Mix说明书进行qPCR。反应体系：2× SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，模板0.2 μL，引物F、R(10 μmol·L-1)各0.4 μL，ROX Reference Dye (20 μmol·L-1)，RNase free water 8.6 μL。反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，1个循环。同时设定阴性对照，获得Ct值。目的基因的mRNA的相对表达采用2-△△Ct法分析[15]。所有处理组均重复检测3次。引物详见表 1。
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表 1 荧光定量PCR引物 Table 1 Primers for qPCR |
1.2.3 DIC对Marc-145细胞的毒性测定 在96孔板中培养Marc-145细胞，待细胞汇合度达到70%时，吸弃孔中培养液，加入用DMEM稀释的不同浓度的DIC溶液(0、1.925、3.9、7.812 5、31.25、62.5、125、250、500、1 000 μmol·L-1)，置37 ℃培养箱培养48 h后弃去药液，每孔加入10 μL CCK-8溶液和200 μL细胞培养液，37 ℃温箱继续孵育2 h，通过酶标仪测定各组OD450 nm值，利用Graphpad软件计算出DIC对Marc-145细胞的CC50。
1.2.4 DIC对PRRSV的50%抑制浓度(IC50)的测定 将DIC用营养液稀释成不同浓度，同时设立含等量DMSO的阴性对照组；接种PRRSV(0.01 MOI)，37 ℃孵育30 h，吸弃细胞上清；进行间接免疫荧光试验：将细胞用PBS洗3遍，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%TritonX-100透膜30 min，用PBS洗3次，每次5 min。加入PRRSV N蛋白单克隆抗体(1∶1 000稀释)，37 ℃孵育细胞1 h；PBS洗细胞3次，3 min·次-1；加入绿色荧光二抗Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(1∶1 000稀释，Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG，A0428，上海碧云天生物技术有限公司)，37 ℃孵育45 min；于室温下用DAPI染色细胞核10 min；荧光显微镜下观察结果；用尼康A1共聚焦显微镜随机记录3张照片；用ImageJ软件测定其荧光值强度；利用GraphPad Prism 7.0软件统计并计算出DIC对PRRSV的50%抑制浓度(IC50)。
1.2.5 DIC的抗PRRSV活性测定 在24孔板中培养Marc-145细胞，待细胞汇合度达到60%时，将营养液换成含有不同浓度DIC(5、10和25 μmol·L-1) 的10% DMEM培养液。培养细胞12 h，吸弃孔中培养液，用无菌PBS洗1遍后，接种0.1MOI的PRRSV。于37 ℃孵育1 h后弃去病毒液，PBS充分洗涤，再将含有DIC的2% DMEM重新加入细胞孔中，培养36 h，进行qPCR检测PRRSV ORF7的mRNA含量；Western blot检测PRRSV的N蛋白含量；反复冻融3次，检测病毒的TCID50。
1.2.6 DIC不同给药时间对PRRSV感染周期影响的测定 在24孔板中培养Marc-145细胞，待细胞汇合度达到60%时，按试验分组(全程不给药M1、预处理阶段+复制全周期给药M2、预处理阶段+吸附阶段给药M3、吸附阶段给药M4、入侵阶段给药M5、复制阶段给药M6、仅预处理阶段给药M7)接种0.1MOI的PRRSV及DIC。在24 hpi收获细胞，进行荧光定量PCR，检测PRRSV ORF7的mRNA含量；进行Western blot，检测N蛋白含量。
1.2.7 DIC对PRRSV吸附阶段影响的测定 将长满单层的培养在24板中的Marc-145细胞置于4 ℃预冷1 h。弃液，用预冷的PBS清洗细胞表面3次，加入不同浓度的DIC并接种PRRSV(1 MOI)，同时设立DMSO对照组。将细胞板置于4 ℃冰箱中1 h，用预冷的PBS清洗细胞表面3次，然后裂解细胞进行细胞RNA的提取，用qPCR检测细胞内PRRSV ORF7 mRNA含量。
1.2.8 DIC对PRRSV入胞阶段影响的测定 将细胞汇合度达到70%的Marc-145细胞，用浓度为10 μg·mL-1蛋白合成抑制剂环乙酰亚胺(cycloheximide，CHX)预处理12 h，用预冷的PBS清洗细胞表面后接种PRRSV(1MOI)，4 ℃孵育1 h。再次用预冷的PBS清洗细胞3次，去除游离的病毒粒子，加入含有DIC(25 μmol·L-1)或DMSO的DMEM，37 ℃孵育30 min。用柠檬酸缓冲液(pH=3)洗涤细胞以去除未内化的病毒。用qPCR检测细胞内PRRSV ORF7 mRNA含量。
1.2.9 DIC对PRRSV复制阶段影响的测定 对汇合度达到70%Marc-145细胞接种1 MOI PRRSV，37 ℃培养6 h，用PBS清洗细胞3次，加入含DIC(25 μmol·L-1)或DMSO的新鲜DMEM(含2% FBS)，37 ℃孵育。在7、8和9 h后，用qPCR检测细胞内PRRSV ORF7 mRNA含量。
1.2.10 DIC对PRRSV释放阶段影响的测定 对汇合度达到70%的Marc-145细胞接种0.1 MOI PRRSV，37 ℃孵育1 h，吸弃孔内病毒液，加入含2% FBS的DMEM。在18 hpi时，用PBS洗涤细胞3次，加入含有DIC(25 μmol·L-1)或DMSO的DMEM(含2% FBS)，并在37 ℃下继续培养10、30和60 min，分别收获上清液。用绝对荧光定量检测细胞上清中存在的病毒含量。
1.3 统计学方法本研究中使用GraphPad prism 8.0软件(One-way ANOVA test)进行统计学分析绘图，所有数据都被表示为“平均值±标准差(x±s)”，P < 0.05(*)表示差异显著，P < 0.01(**)、P < 0.001 (***)和P < 0.000 1(****)表示差异极显著。
2 结果 2.1 DIC对Marc-145细胞的细胞毒性测定DIC的结构式如图 1A所示。用不同浓度DIC溶液处理Marc-145细胞，通过CCK8试验检测细胞毒性。结果显示：当DIC浓度 < 31.25 μmol·L-1时，CCK-8检测DIC对Marc-145细胞无明显毒性。通过GraphPad软件分析，DIC对Marc-145细胞的CC50为96.11 μmol·L-1(图 1B)。用不同浓度(0~150 μmol·L-1)的DIC或溶剂DMSO处理细胞后，接种PRRSV(0.01 MOI)，30 h进行间接免疫荧光试验，通过统计DIC与DMSO对照组的PRRSV荧光，计算出DIC对PRRSV的IC50为12.75 μmol·L-1。CC50较高，IC50较低，说明DIC对Marc-145细胞毒性较低，且在该细胞上对PRRSV具有较好的抗病毒作用。
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A.双香豆素的化学式；B. 双香豆素的CC50测定；C. 双香豆素的IC50测定 A. Chemical formula of DIC; B. CC50 determination of DIC; C. IC50 determination of DIC 图 1 双香豆素的化学式及其CC50和IC50测定 Fig. 1 Chemical formula of DIC and the CC50and IC50 determination |
用不同浓度DIC(5、10和25 μmol·L-1)处理Marc-145细胞12 h后，接种0.1 MOI的PRRSV。于37 ℃培养36 h(培养过程营养液中含有对应浓度DIC)。通过qRT-PCR检测PRRSV ORF7的mRNA含量；Western blot检测PRRSV的N蛋白含量；并反复冻融3次，检测病毒的TCID50。结果显示：与对照组(未添加DIC组)相比，DIC处理组Marc-145细胞中PRRSV的N蛋白表达量(图 2A)与ORF7 mRNA的相对表达量(图 2B)降低，并呈剂量依赖性。DIC浓度为25 μmol·L-1的给药组，差异最为显著(P＜0.000 1)，几乎检测不到N蛋白。同时，不同浓度给药组TCID50结果也显示DIC可以抑制PRRSV的增殖，并呈剂量依赖性(图 2C)。
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A. Western blot检测DIC剂量依赖性抑制PRRSV增殖；B. qPCR法检测DIC剂量依赖性抑制PRRSV增殖；C. TCID50检测DIC剂量依赖性抑制PRRSV增殖。*.P < 0.05，**.P < 0.01，***.P < 0.001，****.P < 0.000 1，ns. P>0.05，下图同 A.Western blot was used to detect the dose-dependent inhibition of PRRSV proliferation by DIC; B. The dose-dependent inhibition of PRRSV proliferation by DIC was detected by qPCR; C. TCID50 detection of DIC dose-dependent inhibition of PRRSV proliferation. *.P < 0.05, **.P < 0.01, ***.P < 0.001, ****.P < 0.000 1, ns. P>0.05, the same as below 图 2 DIC剂量依赖性抑制PRRSV增殖 Fig. 2 DIC dose-dependent inhibition of PRRSV proliferation |
检测DIC在PRRSV增殖的不同时间的作用，分别在病毒接种后的12、24和48 h进行Western blot和qPCR，比较DIC处理组和未处理组细胞内N蛋白表达量与ORF7 mRNA含量的区别。结果如图 3显示，与对照组相比，同一时间点的DIC给药组中PRRSV的N蛋白表达量(图 3A)与ORF7 mRNA的相对表达量(图 3B)显著降低。表明DIC在PRRSV增殖的不同时间均具有抑制病毒增殖的作用。
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A. Western blot检测N蛋白含量；B. qPCR检测ORF7 mRNA的相对表达量 A. Western blot for N protein content; B. qPCR method for relative expression of ORF7 mRNA 图 3 DIC抑制不同时间的PRRSV增殖 Fig. 3 DIC inhibits PRRSV proliferation at different time |
用不用滴度的PRRSV接种Marc-145细胞，检测DIC是否对不同滴度的病毒具有抑制作用。结果显示，PRRSV在高剂量(0.1MOI)和低剂量(0.01MOI)时，DIC给药组中PRRSV的N蛋白表达量(图 4A)与ORF7 mRNA的相对表达量(图 4B)都显著降低。表明DIC可对不同滴度的PRRSV的增殖起到抑制作用。
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A. Western blot检测DIC抑制不同滴度PRRSV增殖；B. qPCR检测DIC抑制不同滴度PRRSV增殖 A.Western blot showed that DIC inhibited the proliferation of PRRSV with different titers; B. Detection of DIC inhibiting PRRSV proliferation with different titers by qPCR 图 4 DIC可抑制不同滴度的PRRSV增殖 Fig. 4 DIC can inhibit the proliferation of PRRSV with different titers |
为了确定DIC抑制PRRSV增殖的具体机制，首先建立了时间过程分析，以确定DIC的抗PRRSV活性阶段，时间过程分为7组(全程不给药M1、预处理阶段+病毒增殖全过程M2、预处理阶段+吸附阶段给药M3、吸附阶段给药M4、入侵阶段给药M5、复制阶段给药M6、仅预处理阶段给药M7)(图 5A)。结果显示，与M1对照组相比，M2和M6给药组的PRRSV的N蛋白(图 5B)和ORF7 mRNA(图 5C)表达水平均显著降低。表明DIC可能主要在PRRSV的复制周期发挥抗病毒作用。
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A.在不同PRRSV感染时间段给药分组；B. Western blot检测DIC抑制不同时期PRRSV增殖；C. qPCR法检测DIC抑制不同时期PRRSV增殖 A. Different treatment times of DIC and infection time of PRRSV; B. Western blot for N protein content; C. qPCR detection of relative expression of ORF7 mRNA 图 5 感染前后不同时间加入DIC对PRRSV增殖的抑制作用 Fig. 5 Inhibition of PRRSV proliferation by adding DIC at different times before and after infection |
为了进一步确定DIC影响PRRSV感染周期的具体阶段，分别在PRRSV的吸附、入胞、复制和释放阶段检测DIC的作用。
利用qPCR检测加入不同浓度的DIC并接种PRRSV(1 MOI)的Marc-145细胞内PRRSV ORF7 mRNA含量，结果如图 6A所示，DIC对PRRSV吸附阶段无影响。
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A. qPCR检测DIC对PRRSV吸附阶段的影响；B. qPCR检测DIC对PRRSV入胞阶段的影响；C.qPCR检测DIC对PRRSV复制阶段的影响；D. 绝对荧光定量PCR检测DIC对PRRSV释放阶段的影响 A.qPCR method was used to detect the effect of DIC on the adsorption stage of PRRSV; B. qPCR method was used to detect the effect of DIC on the entry stage of PRRSV; C. qPCR was used to detect the effect of DIC on the replication stage of PRRSV; D. Effect of DIC on PRRSV release phase detected by absolute fluorescence quantitative PCR 图 6 DIC对PRRSV不同复制阶段的影响 Fig. 6 Effects of DIC on different replication stages of PRRSV |
进而，用CHX预处理Marc-145细胞，再接种PRRSV(1 MOI)，清洗细胞后加入含有DIC (25 μmol·L-1)或DMSO的DMEM，洗涤细胞，用qPCR检测进入细胞内的PRRSV的ORF7 mRNA含量，结果如图 6B所示，DIC对PRRSV入胞阶段无影响。
将Marc-145细胞接种PRRSV后，分别在7、8和9 hpi收集细胞，检测细胞内ORF7 mRNA的相对表达量(图 6C)，8和9 hpi组的DIC处理的细胞内ORF7 mRNA的相对表达量显著降低，表明DIC对PRRSV复制阶段有抑制作用。
Marc-145细胞接种0.1 MOI PRRSV，洗涤后加入含有DIC(25 μmol·L-1)或DMSO的DMEM(含2% FBS)，继续培养10~60 min，分别收获细胞上清液用绝对荧光定量检测PRRSV含量。结果显示，10、30和60 min DIC处理组与对照组相比，细胞上清中的病毒含量无差别(图 6D)。表明DIC不影响PRRSV的释放阶段。
综上，DIC能够抑制HP-PRRSV的复制阶段。
3 讨论PRRSV对生猪养殖产业造成的经济损失巨大，并在传播和进化过程中极易发生变异。目前，传统PRRS疫苗保护效果不佳，因此，迫切需要新手段来降低该病毒对养殖行业的影响[16-18]。当前在临床上正使用的抗病毒药，价格昂贵且易产生耐药性[3, 19]。鉴于此，基于天然产物的药物治疗具有较大的替代潜力[20]。双香豆素存在于多种植物中，来源广泛。在临床上双香豆素因其与维生素K的化学结构相似而被用作天然抗凝剂，其临床应用时间长，安全性高[21-22]。近年来，一些研究证明了DIC的抗病毒活性，如DIC在体外具有抑制狂犬病病毒复制的活性[23]；DIC对多种亚型的流感病毒具有预防或治疗作用[24]；此外，DIC表现出显著的抗HBV活性，研究证明，口服DIC显著降低小鼠HBV模型体内的病毒DNA含量[14]。
本研究对双香豆素是否具有抑制PRRSV增殖作用进行了初步探究，证明了DIC在较低浓度时可有效抑制PRRSV在Marc-145细胞上增殖，其机制主要作用于病毒的复制阶段。首先确定双香豆素在Marc-145细胞上的毒性较低，其CC50为96.11 μmol·L-1，但其在25 μmol·L-1时即可表现出较高的抗PRRSV活性，说明其抗PRRSV效果较好。在PRRSV感染的不同时间，DIC均可以抑制PRRSV的增殖；并对高剂量和低剂量的PRRSV均具有抗病毒活性。以上提示DIC对不同程度PRRSV感染均有抑制作用。同时，本研究对DIC抗病毒的具体阶段进行了探究，证明DIC主要抑制PRRSV的复制阶段，提示DIC具有作为PRRSV治疗药物或添加剂的潜力，而不是一种预防性的药物。
4 结论本研究证明天然产物双香豆素在体外对PRRSV的感染具有抑制作用，且主要针对其复制阶段，为双香豆素在临床上治疗PRRS提供理论依据。
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(编辑 孟培)