肝是反刍动物氮营养素周转代谢的主要场所之一，同时也是机体进行氨解毒的重要器官[1]。日粮中含氮类物质(蛋白质、氨基酸以及尿素等非蛋白氮等)在进入反刍动物消化道后会被其内的微生物降解产生大量的氨，造成门静脉血氨浓度升高。大量的氨积聚在血液中会对动物健康产生不利影响。有研究表明，当血氨浓度高于20 mg·L－1时，动物会发生氨中毒；当血氨浓度超过40 mg·L－1时，会导致动物死亡[2]。而肝可以对来自血液的氨进行回收利用，以此达到降低血氨、维持机体氨氮平衡的目的[3]。这其中，尿素循环和谷氨酰胺合成途径是肝进行氨解毒的主要方式，而尿素循环是最主要的途径。通过门静脉进入肝组织的氨很大比例会通过尿素循环合成尿素并返回胃肠道被再次利用，且相比于单胃动物，反刍动物肝组织合成的尿素返回胃肠道的比例会更高[5-6]。此外，肝中的谷氨酰胺循环可以对逃离门静脉周尿素循环的血氨进行利用，在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GLUL)的作用下生成谷氨酰胺，是氨解毒的另一重要途径[7-8]。肝组织尿素循环与谷氨酰胺途径协同互作，共同维持机体内氨水平稳态。因此，肝的这种氨解毒能力不仅可以提高反刍动物的氨利用效率，同时也可避免氮资源的浪费。
日粮中氮的降解和随后氨的吸收与肝组织尿素生成密切相关[9]。Noro和Wittwer[4]研究指出，给反刍动物大量饲喂粗蛋白含量高的日粮，瘤胃中高浓度的氨会导致肝内尿素循环程度加强，产生大量尿素，但是对于其影响肝组织尿素生成的具体机制尚未说明。有研究指出，日粮蛋白摄入增加造成肝组织尿素生成增多的原因可能与肝组织尿素循环中酶浓度的相应增加有关[10]。Yang等[11]及Brosnan J T和Brosnan M E[12]分别在狗和小鼠的门静脉灌注大量的NH4Cl后均发现，血液尿素含量显著升高，说明NH4+处理也会使肝的尿素合成能力增强。而尿素在反刍动物体内脲酶的作用下会分解产生游离NH3，随后NH3会与氢离子结合产生NH4+，这提示日粮添加尿素可能同样会使肝组织的尿素合成能力增强。肝内高强度的尿素循环会影响机体的能量代谢，这是因为尿素循环与糖异生、三羧酸循环等能量代谢途径密切相关。尿素循环过程中的许多中间体(如α-酮戊二酸、草酰乙酸)是与三羧酸循环和糖异生等途径共享的前体物质[4]。因此，瘤胃氨含量的过度增加会对肝的尿素生成造成负担，同时影响肝的糖异生和能量平衡。本实验室前期研究已证实，日粮添加不同水平尿素会影响育肥湖羊瘤胃和血液的氨氮平衡，瘤胃氨态氮浓度、血液中血氨和血尿素氮浓度均随尿素剂量的升高线性增加[13-14]。肝通过氨解毒来维持血氨平衡，但是因尿素剂量升高引起的血氨浓度升高会如何影响肝的氨代谢及相关代谢通路还鲜有报道。因此，本研究基于转录组学方法探究日粮添加尿素对育肥湖羊肝组织氨代谢及相关代谢通路的影响，为深入了解肝在氨代谢和尿素生成中的重要作用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计与饲养管理随机选择42只体重相近((24.3±1.7)kg)的健康公湖羊，按照随机区组试验设计分为3个处理组，每个处理7栏，共计21栏，每栏饲喂2头。3组在饲喂基础日粮的基础上分别添加0(U0组)、10(U10组)和30 g·kg-1(U30组)的饲用尿素。各组日粮的能量水平相近，满足25 kg育肥肉羊的生长需求(NY/T 816—2004)。但粗蛋白水平不尽相同，具体日粮组成和营养水平与前期饲养试验保持一致[12]。于每日的7:00和19:00两个时间点等量饲喂，并保证剩余料在5%~10%左右，自由采食和饮水。试验共进行11周，包括1周适应期和10周正式试验期。
1.2 样品采集正式试验期结束时，每组随机选择6栏，每栏选择1只湖羊于晨饲后4 h进行屠宰取样。屠宰后对各脏器依次进行分离结扎，摘取肝，统一采集肝右叶的同一位置作为试验样品。手术剪剪碎后分装于2 mL冻存管中，迅速投入液氮罐速冻后放入－80 ℃冰箱中保存，以备后续试验指标的测定。整个采样过程中尽量保证每头羊的屠宰取样时间基本保持一致。
1.3 肝组织氨态氮和尿素氮测定借鉴Chaney和Marbach[15]的试验方法，以氯化铵为标准品，用比色法测定肝中氨态氮的浓度。肝中尿素氮按照尿素氮测试盒(南京建成生物工程研究所)说明书操作，肝组织样品经生理盐水进行适当稀释后，依次添加缓冲酶液、酚显色剂和碱性次氯酸钠，经37 ℃水浴10 min后在波长640 nm、光径1 cm条件下比色测定各组的吸光度OD值。
1.4 肝组织RNA提取与质检采用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)提取肝组织总RNA，肝组织样品经液氮研磨成粉末后，取70 mg研磨样加入1 mL TRIzol裂解液使其完全裂解，之后依次经过氯仿、酚∶氯仿(25∶24)混合液、异丙醇、75%乙醇漂洗液处理，对肝组织RNA进行分离纯化。使用Nano-drop 2000c微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)检测RNA的浓度和纯度，确保RNA的A260/A280比值在1.8~2.1之间。
1.5 PCR扩增与文库构建利用带有Oligo(dT)的磁珠将真核生物mRNA富集后用NEB片段缓冲液(5×)将mRNA分成短片段。随后以片段化的mRNA为模板，加入随机引物合成双链cDNA，并用QiaQuick PCR提取试剂盒(E7530，New England Biolabs，中国)纯化cDNA片段。纯化后的cDNA经过末端修复、加A尾、连接序列接头、AMPure XP beads(Beckman Coulter，美国)进行片段筛选等步骤后，通过PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化产物，最终获得cDNA文库。PCR扩增反应条件为：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，65 ℃ 75 s，12个循环；65 ℃ 5 s。文库构建完成后，将质检合格的数据在Illumina平台进行测序。
1.6 差异表达基因筛选通过HISAT2软件将序列与绵羊基因组进行比对后，利用Stringtie重构转录本，并用RSEM计算每个样本中所有基因的表达量。随后对测序深度进行校正，再对基因或转录本的长度进行校正以提高其准确性，获得基因FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值。使用edgeR 3.28.0软件进行差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)筛选，以|fold change|>2且P < 0.05作为筛选标准得到DEGs。
1.7 差异表达基因GO和KEGG富集分析将差异基因向Gene Ontology数据库(http://www.geneontology.org/)的各条目映射，并计算每个条目的差异基因数，获得具有某个GO功能的差异基因列表及差异基因数目统计。随后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比在差异基因中显著富集的GO条目。将差异基因与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes数据库(http://wego.genomics.org.cn)进行比对，得到差异基因涉及的信号通路或代谢通路，后续分别使用DAVID 6.8软件和KOBAS 3.0软件进行GO功能和KEGG通路富集分析。
1.8 数据分析试验数据经过Excel 2017初步整理后利用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan’s法进行多重比较，P < 0.05表示差异显著，利用GraphPad Prism 5.0进行作图。
2 结果 2.1 肝中氨态氮和尿素氮含量如图 1所示，日粮添加尿素使肝组织氨态氮浓度升高，其中U10组氨态氮浓度相较于U0组显著升高(P < 0.05)；与U0和U10组相比，U30组肝中尿素氮浓度显著升高(P < 0.05)。
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*. P < 0.05；**. P < 0.01 图 1 日粮尿素添加对育肥湖羊肝组织中氨态氮(A)和尿素氮(B)的影响 Fig. 1 Effect of dietary urea supplementation on ammonia-N (A) and urea-N (B) in liver of fattening Hu lambs |
以P < 0.05、|fold change|>2作为差异表达基因筛选标准，各组样品两两比较共筛选得到546个DEGs。从差异基因柱状图(图 2)和火山图(图 3)可以发现，U0组与U10组的比较中共得到180个DEGs，包括85个上调基因和95个下调基因；U0组与U30组的比较中共得到193个DEGs，其中包括85个上调基因和108个下调基因；U10组与U30组的比较中共有173个DEGs，其中有58个上调基因和115个下调基因。
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图 2 差异表达基因数量 Fig. 2 The number of differentially expressed genes (DEGs) |
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红点和蓝点分别代表上调基因和下调基因的分布情况 Red and blue points indicate the distributions of up-regulated and down-regulated genes, respectively 图 3 肝组织中基因表达分布的火山图 Fig. 3 Volcano plot of the distributions of gene expression in livers |
图 4、图 5、图 6展示的是差异表达基因在GO生物过程上的富集分析。U0组与U10组中显著注释到45个GO条目，其中生物过程(biological process，BP)有24个，分子功能(molecular function，MF)有8个，细胞组分(cellular component，CC)有13个。按照P值排名前20的BP主要与胺代谢与分解、细胞杀伤调节、免疫系统调节等相关，具体包括细胞生物胺代谢过程(cellular biogenic amine metabolic process)、细胞生物胺分解过程(cellular biogenic amine catabolic process)、胺代谢过程(amine metabolic process)、胺分解过程(amine catabolic process)、细胞杀伤调节(regulation of cell killing)、自然杀伤细胞接介导的免疫调节(regulation of natural killer cell mediated immunity)、芳香族氨基酸分解过程(aromatic amino acid family catabolic process)、免疫系统过程(immune system process)等功能上。U0组与U30组中显著注释到48个GO条目，其中BP有23个，MF有9个，CC有16个。按照P值排名前20的BP主要与胺代谢与分解、应对病毒、生物刺激反应等相关，具体包括胺代谢过程(amine metabolic process)、胺分解过程(amine catabolic process)、细胞生物胺代谢过程(cellular biogenic amine metabolic process)、细胞生物胺分解过程(cellular biogenic amine catabolic process)、应对病毒(response to virus)、对病毒的防御反应(defense response to virus)、病毒基因组复制(viral genome replication)、生物刺激反应(response to biotic stimulus)、对其他生物的反应(response to other organism)等功能上。U10组与U30组中显著注释到51个GO条目，其中BP的有24个，MF有11个，CC有16个。按照P值排名前20的BP主要与应对病毒、生物刺激等相关，具体包括应对病毒(response to virus)、对生物过程调节(regulation of multi-organism process)、生物刺激反应(response to biotic stimulus)、病毒过程调控(regulation of viral process)、防御反应(defense response)、先天免疫反应调节(regulation of innate immune response)等功能上。
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图 4 U0 vs. U10肝组织差异表达基因注释到的GO生物过程(前20) Fig. 4 Gene ontology (GO) biological processes annotated by liver DEGs in U0 vs. U10 (top 20) |
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图 5 U0 vs. U30肝组织差异表达基因注释到的GO生物过程(前20) Fig. 5 Gene ontology (GO) biological processes annotated by liver DEGs in U0 vs. U30 (top 20) |
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图 6 U10 vs. U30肝组织差异表达基因注释到的GO生物过程(前20) Fig. 6 Gene ontology (GO) biological processes annotated by liver DEGs in U10 vs. U30 (top 20) |
图 7、图 8、图 9表示的是对上调和下调差异表达基因参与的主要代谢途径进行的KEGG代谢通路富集结果分析。结果发现，与U0组相比，U10组DEGs显著富集的通路有12条，主要与代谢相关的通路包括脂质代谢、碳水化合物代谢、辅酶因子和维生素代谢、外源物质的生物降解和利用，其内多数基因显著上调。具体通路包括甾类激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、花生四烯酸代谢(arachidonic acid metabolism)、亚油酸的新陈代谢(linoleic acid metabolism)；抗坏血酸和醛酸代谢(ascorbate and aldarate metabolism)、戊糖和葡萄糖醛酸转换(pentose and glucuronate interconversions)；视黄醇的新陈代谢(retinol metabolism)、卟啉与叶绿素代谢(porphyrin and chlorophyll meta-bolism)；细胞色素P450代谢的异种生物(metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)。其他代谢通路分别为核苷酸切除修复(nucleotide excision repair)、自然杀伤细胞介导的细胞毒性(natural killer cell mediated cytotoxicity)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、细胞因子及其受体间的相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)。与U0组相比，U30组DEGs显著富集的通路有8条，主要与代谢相关的通路是碳水化合物代谢，包括半乳糖代谢(galactose metabolism)、淀粉和蔗糖的代谢(starch and sucrose metabolism)。其他代谢通路分别为味觉转导(taste transduction)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair)、细胞因子及受体间的相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、过氧化物酶体(peroxisome)、TGF-beta信号通路(TGF-beta signaling pathway)、碳水化合物消化吸收(carbohydrate digestion and absorption)。与U10组相比，U30组DEGs显著富集的通路有6条，更多参与的是与免疫系统相关的通路，包括RIG-Ⅰ型受体信号通路(RIG-Ⅰ-like receptor signaling pathway)、胞质DNA感应通路(cytosolic DNA-sensing pathway)、趋化因子信号通路(chemokine signaling pathway)。其他代谢通路分别为昼夜节律(circadian entrainment)、谷氨酸能突触(glutamatergic synapse)和Hedgehog信号通路(hedgehog signaling pathway)。
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两组比较中均前面组是对照组，绿框表示与代谢相关的信号通路，下同 The first group was the control group between two groups, and the green bars represent the pathways associated with metabolism, the same as below 图 7 U0 vs. U10肝组织差异表达基因KEGG聚类分析 Fig. 7 KEGG pathway assignments of DEGs in U0 vs. U10 in the liver |
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图 8 U0 vs. U30肝组织差异表达基因KEGG聚类分析 Fig. 8 KEGG pathway assignments of DEGs in U0 vs. U30 in the liver |
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图 9 U10 vs. U30肝组织差异基因KEGG聚类分析 Fig. 9 KEGG pathway assignments of DEGs in U10 vs. U30 in the liver |
精氨酸生物合成是肝调控尿素生成以及氨代谢的重要代谢途径，其中精氨酸酶(arginase，ARG)、氨甲酰磷酸合成酶-1(carbamyl phosphate synthetase-1，CPS1)、L-鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ornithine carbamoyltransferase，OTC)、精氨酸琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase，ASS)和精氨酸琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase，ASL)是编码肝组织尿素生成的关键酶，GLUL和谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)是调控谷氨酰胺合成途径的关键酶。本研究发现，与U0组相比，U30组中编码肝内尿素生成的关键酶基因的表达有不同程度的升高，且U10组和U30组中ARG2基因的表达量显著上调(P < 0.05)。谷氨酰胺合成途径中，日粮添加尿素使氨向谷氨酰胺转化过程中GLUL基因的表达量显著上调(P < 0.05)，使谷氨酰胺向氨转化过程中GLS基因的表达量显著下调(P < 0.05，图 10)。
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红框表示显著上调基因，绿框表示显著下调基因，白框表示无差异表达基因。“EC”是国际酶学委员会的缩写，后面的数字代表酶的系统编号，其中的红字表示编码肝组织尿素生成通路中的关键酶基因。分布条形图展示的是基于FPKM值的基因表达量的变化 The red bars represent the significantly up regulated genes, the green bars represent the significantly down regulated genes, and the white bars represent the genes with no difference. "EC" is the international commission on enzymology, and the following numbers represent the system number of enzyme. Meanwhile, the red characters in the picture represent the key enzyme genes in the pathway that encodes liver urea production. The distribution bar plots are colored according to the gene abundance as fragments per kilobase of transcript per million mapped reads (FPKM) 图 10 尿素代谢途径 Fig. 10 Metabolic pathways of urea metabolism |
肝是反刍动物进行氨代谢和尿素生成的主要场所之一。肝可以通过尿素循环途径或谷氨酰胺途径将血液中的氨转化为可以被机体再次回收利用的尿素或者谷氨酰胺[3, 16]。因此，明确日粮添加尿素对肝组织氨代谢的调控机制对提高尿素利用效率具有重要研究意义。
肝组织氨态氮是评估肝内氨代谢和尿素生成情况的重要指标，可以反映肝对血氨的利用情况。本实验室前期发现，随着日粮尿素添加水平的升高，育肥湖羊瘤胃氨态氮浓度和血氨浓度显著升高，而干物质采食量和平均日增重呈二次变化[13-14]，其中均在U10组最高。这是因为U10组尿素的氨释放量与碳水化合物的可利用性比较同步，能量和氮的平衡促进了动物的生长，而随着瘤胃氨浓度的进一步升高反而破坏了这一平衡，从而导致动物的生长速度有所下降。瘤胃过多的氨会进入血液造成血氨浓度升高，血氨浓度太高不利于动物机体健康，肝会将这些有毒的氨转化为无毒的尿素，随后返回胃肠道被宿主回收利用或排出体外。在正常生理和营养条件下，门静脉吸收的氨在肝中能有效地转化为尿素和谷氨酰胺等而解毒[18]。本研究发现，日粮添加尿素使肝组织氨态氮浓度升高，表明肝对血氨浓度的升高做出响应，肝吸收更多的氨并用于尿素或谷氨酰胺合成。尿素氮可以反映动物体内氮代谢的平衡状况，与体内蛋白质代谢以及氨基酸平衡状态密切相关。有研究发现，给反刍动物大量饲喂粗蛋白含量高的日粮，瘤胃中高浓度的氨会导致肝内尿素循环程度加强，产生大量尿素[4]。本研究也发现，高剂量尿素组(U30组)动物的肝中尿素氮浓度较其他两组升高显著，表明高剂量尿素使肝组织尿素循环能力增强，导致U30组有更多的尿素氮生成。以上结果提示，日粮添加尿素影响肝的氨代谢以及尿素的生物合成。
在本研究中，有546个差异基因在各处理组的比较中被检测到。这些差异表达基因在氨代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢、与免疫相关等通路中显著富集。基于GO功能层面分析发现，与U0组相比，U10组差异表达基因主要富集在胺代谢与分解、细胞杀伤调节、免疫系统调节等相关的生物过程。随着尿素剂量的进一步提升，U30组差异表达基因除了在这些生物过程进一步富集外，同时在生物刺激反应、应对病毒等生物过程中显著富集，表明日粮添加尿素影响肝的氨代谢和免疫调节。KEGG代谢通路结果显示，日粮添加尿素使肝中与免疫系统相关的通路中的基因有不同程度的下调，且U30组下调基因的数量较U10组更多，这些下调的基因包括CXCL10、DDX58、IFIH1、DHX58、CCL8等。有研究指出，CXCL10是调控免疫反应的关键调节因子，其可以刺激自然杀伤细胞和T细胞迁移以及调节黏附分子的表达[19]。DDX58是一种蛋白质编码基因，主要参与病毒双链RNA识别和抗病毒先天免疫反应的调节[20]。本研究发现这些与免疫相关的基因表达有所下调，表明高剂量尿素可能对肝的免疫系统调节产生了抑制效果，但本试验缺乏与免疫相关的直观指标结果，因此后续可以对这方面作更加深入的探究。肝的尿素循环与许多能量代谢途径密切相关，因为肝组织尿素循环需要的许多中间体(如α-酮戊二酸、草酰乙酸等)是来自三羧酸循环、糖异生等能量代谢途径[4]。有研究发现，随着血氨浓度的升高，肝的尿素循环和糖异生途径中相关酶基因的表达和活性也相应增强，尿素、葡萄糖等相关代谢产物浓度也显著升高[21]。本试验KEGG代谢通路富集结果显示，日粮添加尿素使糖异生、碳水化合物代谢等能量代谢通路中G6PC、MGAM2等多数基因的表达显著上调。表明日粮添加尿素除了会影响肝的氨代谢，还会不同程度的影响肝的碳水化合物代谢等能量代谢途径。
肝含有尿素生成所需的所有关键酶，包括ARG、CPS1、OTC、ASS和ASL，这些酶可针对不同的氮源通过缩合、脱氨或转氨作用合成尿素[3, 22]。这些关键酶的表达情况与肝的尿素生成密切相关，其浓度和活性的高低是控制尿素生成的关键因素，并且彼此间通过紧密的反应可使尿素循环效率显著提升[23-24]。通常，反刍动物氨解毒能力要强于单胃动物，这是因为反刍动物肝中OTC、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GD)和ARG等酶的活性更高，所以氨转化为尿素的效率也更强[25]。因此，这也是尿素常应用于反刍动物日粮中的主要原因。肝的尿素生成中相关酶基因的表达会受到日粮氮水平、尿素/氨浓度等因素的影响。包正喜等[21]研究发现，门静脉灌注高浓度的NH4Cl会显著上调仔猪肝中CPS1、ARG1、OTC等调控肝尿素循环的关键酶基因的表达，同时伴随着酶活性的增强，尿素合成能力增强。CPS1是尿素合成过程中的起始酶和关键限速酶，控制着尿素的生成[22]。有研究发现，当日粮蛋白质水平过高时会显著上调CPS1基因的mRNA表达[26]，CPS1酶活性的升高也会促进肝的尿素生成。本研究发现，与U0组相比，U30组肝的尿素生成途径中CPS1的表达显著上调，且与此结果一致的是U30组肝的尿素氮含量也是较其他两组显著升高，表明日粮添加尿素会通过上调CPS1基因表达来促进肝的尿素生成，且高尿素剂量组较低剂量组效果更显著。ARG是肝组织尿素循环过程中的关键酶，主要分为ARG1和ARG2两种，其在肝中高度表达[27]。本试验发现，U10组和U30组中ARG2基因的表达量相较U0组显著上调。ARG2表达量的升高预示着更多的尿素生成，本试验肝组织尿素氮结果也印证了这一观点。
肝除了可以通过尿素循环途径将血液中的氨转化为尿素外，还可以通过谷氨酰胺循环对逃离尿素循环的血氨进行利用，生成谷氨酰胺[8]。因此，谷氨酰胺途径是肝降低血氨浓度的另一重要过程。在生理氨浓度下(NH4+：200~300 μmol·L-1)，有2/3的氨会转化为尿素，1/3的氨转化为谷氨酰胺[28]。在骨骼肌细胞内，GLUL可以催化谷氨酸和氨结合生成谷氨酰胺[29]。而谷氨酰胺会依赖Na+载体进入肠上皮细胞，在GLS的作用下水解成为谷氨酸和氨，产生的氨会进入门脉系统被肝循环利用生成尿素。所以，GLUL和GLS可作为调控谷氨酰胺合成过程中的关键酶，通常GLUL活性越高、GLS活性越低，越有利于谷氨酰胺的合成，两者的协调互作对维持谷氨酰胺平衡具有重要作用[30]。有研究指出，门脉中氨水平的高低可反馈性抑制谷氨酰胺酶的活性，是肝中谷氨酰胺代谢的重要调节因素之一[31]。在本研究中，日粮添加尿素通过升高血氨水平使氨向谷氨酰胺转化途径中GLUL基因的表达量显著上调，使谷氨酰胺向氨转化途径中GLS基因的表达量显著下调。由此说明，日粮添加尿素可能通过上调GLUL基因和下调GLS基因的表达来协同调控肝中谷氨酰胺生成，但由于本试验未对谷氨酰胺表达量进行测定，因此，后续可以对其表达水平进行试验验证。以上结果表明，日粮添加尿素影响肝的氨代谢，通过上调尿素循环和谷氨酰胺途径中关键酶基因的表达促进尿素和谷氨酰胺生成，且高尿素剂量组(U30组)较低剂量组(U10组)效果更显著。
4 结论日粮添加尿素影响肝组织氨代谢和尿素生成，通过上调肝的尿素循环和谷氨酰胺途径中关键酶基因的表达，升高肝中尿素氮浓度，并且高尿素剂量组(30 g·kg-1)较低剂量尿素组(10 g·kg-1)效果更显著。
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(编辑 范子娟)