2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 塔里木大学动物科学与技术学院, 阿拉尔, 843300
, CHEN Wenxun1,2, HUI Haoyang3, PENG Can1, TANG Shaoxun1
, ZHOU Xiaoling3, TAN Zhiliang1
2. University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China;
3. College of Animal Science and Technology, Tarim University, Alaer 843300, China
玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)作为镰刀菌属Fusarium真菌产生的次生代谢产物，在玉米、玉米副产物、小麦及麸皮和全价料中检出率均在80%以上[1]。各种饲料由于肝肠循环，ZEA在血液中的半衰期较长，经过代谢可转变为α-或β-玉米赤霉烯醇，玉米赤霉酮，α-或β-玉米赤霉醇等。α/β-玉米赤霉烯醇在奶牛全混合日粮中亦广泛存在[2]。ZEA及其衍生物与动物内源性雌激素β-雌二醇有类似的化学结构，故可以与细胞内β-雌二醇的受体(ERα和ERβ)结合而表现出生殖毒性和免疫毒性。
反刍动物的瘤胃微生物能将一些毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)降解成毒性更弱的物质进而发挥保护性作用[3-4]。然而，在ZEA污染的情况下，瘤胃微生物介导的代谢可能不会导致脱毒。体外瘤胃液中的代谢试验表明，ZEA主要被转化成α-玉米赤霉烯醇，而α-玉米赤霉烯醇的毒性是ZEA的60倍[3, 5-6]。高浓度的α-玉米赤霉烯醇和低浓度的β-玉米赤霉烯醇也于最近在奶牛瘤网胃不同部位食糜中检出[7]。给泌乳奶牛饲喂ZEA和DON共同污染的日粮不影响其生产性能指标[8]。泌乳后期崂山奶山羊采食黄曲霉毒素B1和ZEA污染日粮也不影响其产奶量，但摄入黄曲霉毒素B1、ZEA和赫曲霉毒素A联合污染日粮时，其采食量和产奶量显著降低[9]。以富含ZEA和DON的霉变玉米面替代正常玉米面配制日粮饲喂奶牛，会降低其采食量、饲料转化率和产奶性能[10]。研究还发现，日粮ZEA、黄曲霉毒素和赫曲霉毒素A污染会显著降低奶山羊肠道菌群总数，同时增加琥珀酸弧菌(Succinivibrionaceae)、考拉杆菌(Phascolarctobacterium)和气单胞菌(Aeromonadales)的丰度[11]。日粮200 μg·kg-1 ZEA降低小母猪盲肠微生物的多样性，800~1 600 μg·kg-1 ZEA升高盲肠微生物多样性，但各浓度处理均未改变盲肠主要菌群的结构[12]。由此可见，ZEA对反刍家畜生产性能和肠道微生物的影响不尽相同，这可能与物种和ZEA或黄曲霉毒素的剂量都有关。但关于ZEA对反刍家畜胃肠道发酵模式和微生物群落影响的研究鲜见报道，值得进一步研究。
因此，本研究以山羊为研究对象，应用液相色谱仪和Illumina-NovaSeq测序技术对不同胃肠道食糜进行微生物发酵产物以及微生物菌群结构进行检测，研究不同剂量ZEA添加对山羊胃肠道发酵模式和菌群结构的影响，旨在为生产中霉菌毒素的预防和控制提供科学依据。
1 材料与方法所有动物试验程序均按照中国科学院亚热带农业生态研究所动物保护委员会批准的指导原则进行。
1.1 试验设计将24头体重相近((12.82±2.03) kg)的雌性湘东黑山羊随机分成3组，每组8只，分别为对照组(Control组)、低剂量玉米赤霉烯酮组(Low-ZEA组)和高剂量玉米赤霉烯酮组(High-ZEA组)。对照组饲喂未被玉米赤霉烯酮污染的基础饲粮，Low-ZEA组在每千克基础饲粮(干物质基础)中添加100 μg的ZEA，High-ZEA组在每千克基础饲粮中添加500 μg的ZEA。ZEA污染饲粮参照廖文双等[13]的研究进行配制，即将晶体粉末状ZEA用乙酸乙酯完全溶解后喷洒到定量滑石粉上，待乙酸乙酯全部挥发后，制成ZEA预混料。然后用毒素干物质含量低于检测限的玉米粉将上述ZEA预混料稀释成50 mg·kg-1DM ZEA预混料。最后与其他精料混匀，配制成500 μg·kg-1DM和100 μg·kg-1DM的ZEA污染饲粮。参照我国农业部发布的肉羊饲养标准(2004)营养需要配制基础日粮，具体配方及营养水平见表 1。精料与粗料的比例为45∶55。试验羊单笼饲喂，自由饮水。每日8:00和17:00各饲喂1次，剩料量控制在5%以内。预饲期7 d，饲喂对照组基础日粮。正试期28 d，正试期内记录每只山羊每天的采食量。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
在正式试验第1天及第4周最后连续2 d于晨饲前准确称量每只羊的体重，数据用于试验期羊平均日增重(ADG)的计算。ADG=(末期平均体重-初始平均体重)/时间间隔。在正式试验结束时，所有试验羊空腹24 h后进行屠宰取样。屠宰后取出瘤胃，将瘤胃沿底部中线剪开并立即把内容物取出分装。同时采集结肠近端内容物进行分装。一份瘤胃和结肠内容物样品分别装于10 mL离心管中，－20 ℃保存用于后续瘤胃和结肠内容物DNA的提取。另一份瘤胃和结肠内容物经四层纱布过滤，参照王荣等[14]的方法处理滤液后使用气相色谱仪(7890A，安捷伦，美国)测定挥发性脂肪酸浓度。
1.3 瘤胃和结肠内容物微生物组总DNA提取瘤胃和结肠内容物样品解冻后，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行微生物总DNA的提取，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA进行定量[15]。
1.4 瘤胃和结肠细菌Illumina-NovaSeq测序选取细菌通用V3-V4可变区域为目的片段，对瘤胃和结肠内容物细菌DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，包含12.5 μL Phusion Hot start flex 2X Master Mix、2.5 μL Forward Primer, 2.5 μL Reverse Primer, 50 ng DNA模板，剩余为双蒸水。在扩增过程中引入不同样本的接头Barcode(8 bp碱基序列)和测序引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)[16]。PCR反应条件为98 ℃预热30 s；98 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循环35次，72 ℃延长10 min。扩增完成后，采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检验合格后使用Qubit(Invitrogen, 美国)进行定量，随后使用AMPure XT beads回收试剂盒提取和纯化预期条带。对纯化后的PCR产物使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent，美国)和Illumina(Kapa Biosciences, Woburn, MA，美国)的文库定量试剂盒进行评估，合格的文库浓度应在2 nmol·L－1以上。将合格的各上机测序文库梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合，并经NaOH变性为单链进行上机测序；使用NovaSeq 6000测序仪进行2×250 bp双端测序。
1.5 生物信息学分析对测序获得的双端数据，首先根据barcode信息对样品进行数据拆分，去除接头和barcode序列。使用cutadapt(v1.9)去除RawData的引物序列和平衡碱基序列，FLASH(v1.2.8)将每一对paired-end reads根据overlap区拼接合并成一条更长的tag。采用fqtrim软件对测序reads进行窗口法质量扫描，扫描窗口默认为100 bp，当窗口内平均质量低于20时，将read从窗口起始到3′终止的部分截掉。去除截短后长度小于100 bp的序列和截短后N的含量在5%以上的序列，使用Vsearch(v2.3.4)去除嵌合体序列。通过qiime dada2 denoise-paired调用DADA2进行长度过滤和去噪。获得ASV(feature)特征序列和ASV(feature)丰度表格，并去除singletons ASVs。
基于得到的ASV(feature)特征序列和ASV(feature)丰度表格进行alpha多样性分析和beta多样性分析。其中alpha多样性分析主要通过操作分类单元数目observed_species，香农指数shannon，Simpson指数simpson，Chao1指数chao1，覆盖率goods_coverage，Shannon均匀度pielou_e六大指数对生境内的多样性进行评估。Beta多样性主要基于bray_curtis距离进行评估分析。
根据ASV(feature)序列文件采用SILVA(Release 138，https://www.arb-silva.de/documentation/release138/)数据库以NT-16S数据库进行物种注释，并根据ASV(feature)丰度表对各物种在各样本中的丰度进行统计。注释的置信度阈值为：0.7。
1.6 统计分析生长性能和发酵参数数据用SPSS 25.0软件进行单因素ANOVA分析，并采用LSD法进行多重比较，结果用平均值和标准误(SEM)表示。基于得到的微生物物种丰度统计信息，采用非参数Kruskal-Wallis test分析三组间瘤胃和结肠内容物微生物的门和属的相对丰度的差异。P < 0.05为差异显著，0.05≤P < 0.1为差异趋势。
2 结果 2.1 生长性能如表 2所示，与对照组相比，ZEA添加量为100和500 μg·kg-1DM时, 对山羊的终体重、总增重、日增重以及干物质采食量影响不显著(P>0.05)。但与对照组相比，高剂量添加组的总增重、日增重以及干物质采食量分别提高了72.4%、72.4%和3.8%。
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表 2 玉米赤霉烯酮添加对山羊生长性能的影响(n=8) Table 2 Effects of zearalenone addition on the growth performance of goats(n=8) |
如表 3所示，与对照组相比，ZEA添加量为100和500 μg·kg-1DM时, 不影响山羊瘤胃食糜各种挥发性脂肪酸(VFA)的摩尔百分比、乙丙比和总VFA含量(P>0.05)，但500 μg·kg-1DM ZEA的添加显著降低结肠食糜中戊酸的摩尔百分比(P < 0.05)，对结肠其他VFA的摩尔百分比、乙丙比和总VFA含量影响不显著(P>0.05)。
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表 3 玉米赤霉烯酮添加对山羊瘤胃和结肠挥发性脂肪酸的影响 Table 3 Effects of zearalenone addition on the profile of volatile fatty acids in rumen and colon of goats |
如表 4所示，与对照组相比，100 μg·kg-1DM ZEA的添加显著降低瘤胃细菌的Shannon指数(P= 0.04)和Simpson指数(P=0.02)，500 μg·kg-1DM ZEA的添加显著降低瘤胃细菌的Simpson指数(P=0.03)和Shannon均匀度(P=0.03)，Shannon指数出现下降趋势(P=0.07)。与低剂量处理组相比，高剂量ZEA添加降低了瘤胃细菌的覆盖率(P=0.03)。
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表 4 玉米赤霉烯酮添加对瘤胃和结肠细菌菌群α多样性的影响 Table 4 Effects of zearalenone addition on rumen and colon bacterial α diversity of goats |
与对照组相比，500 μg·kg-1DM ZEA的添加有降低结肠细菌Shannon指数的趋势(P=0.07)。与低剂量ZEA添加组相比，高剂量ZEA的添加显著降低结肠细菌的Shannon指数(P=0.02)和Simpson指数(P=0.04)。
2.4 瘤胃和结肠菌群β多样性基于Bray-Curtis距离算法的主坐标分析(PCoA)结果见图 1。结果表明，对照组、低剂量ZEA组和高剂量ZEA组瘤胃和结肠内容物样本区分不开，表明在OTU水平上ZEA的添加不影响山羊瘤胃和结肠细菌群落组成。
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图 1 玉米赤霉烯酮添加对山羊瘤胃(A)和结肠(B)细菌菌群影响的PCoA分析 Fig. 1 PCoA analysis of goat rumen(A)and colon(B)bacterial diversity affected by zearalenone addition |
如表 5所示，瘤胃内容物中的细菌由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)、互养菌门(Synergistota)、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、放线菌门(Actinobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetota)组成。各处理组优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota) 和变形菌门(Proteobacteria)，以上四者相对丰度占瘤胃菌群的93.4%以上。与对照组相比，500 μg·kg-1DM ZEA的添加使厚壁菌门(Firmicutes)的丰度显著下降(P=0.04)。与低剂量处理组相比，高剂量ZEA处理显著降低脱硫杆菌门(Desulfobacterota)的丰度(P=0.04)。
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表 5 玉米赤霉烯酮添加对山羊瘤胃细菌门水平相对丰度(至少一个处理相对丰度>0.5%)的影响 Table 5 Effect of zearalenone addition on relative abundance of rumen bacteria at phylum level (each with a relative abundance >0.5% in at least one treatment)in goats |
如表 6所示，结肠内容物中的细菌由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋菌门(Spirochaetota)、脱硫杆菌门(Desulfobacterota)和放线菌门(Actinobacteriota)组成。各处理组优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)，三者相对丰度占瘤胃菌群的95.2%以上。与对照组相比，100 μg·kg-1DM ZEA处理显著降低放线菌门(Actinobacteriota)的丰度(P=0.04)，500 μg·kg-1DM ZEA处理则显著降低螺旋菌门(Spirochaetota)的丰度(P=0.04)。与低剂量ZEA添加组相比，高剂量ZEA添加显著降低螺旋菌门(Spirochaetota)的相对丰度(P=0.02)，显著升高放线菌门(Actinobacteriota)的相对丰度(P=0.01)。
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表 6 玉米赤霉烯酮添加对山羊结肠细菌门水平相对丰度(至少有一个处理相对丰度>0.5%)的影响 Table 6 Effect of zearalenone addition on relative abundance of colon bacteria at phylum level (each with a relative abundance >0.5% in at least one treatment) in goats |
如表 7所示，与对照组相比，100 μg·kg-1DM ZEA处理显著降低瘤胃丁酸弧菌Butyrivibrio(P=0.03)、毛螺旋菌Oribacterium(P=0.01)和未分类毛螺旋菌Lachnospiraceae_unclassified(P=0.01)的丰度，500 μg·kg-1DM ZEA处理显著升高F082_unclassified的丰度(P=0.03)，显著降低瘤胃毛螺菌Lachnospiraceae_ND3007 (P=0.01)、普雷沃氏菌Prevotellaceae_UCG-003(P=0.04)和未分类毛螺旋菌Lachnospiraceae_unclassified (P=0.03)丰度。
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表 7 玉米赤霉烯酮添加对山羊瘤胃细菌属水平相对丰度(至少有一个处理相对丰度>0.5%) 的影响 Table 7 Effect of zearalenone addition on relative abundance of rumen bacteria at genus level (each with a relative abundance >0.5% in at least one treatment)in goats |
如表 8所示，与对照组相比，500 μg·kg-1DM ZEA处理显著降低结肠克里斯滕森菌Christensenellaceae_R-7_group(P=0.03)、梭菌Clostridium(P=0.04)和密螺旋体Treponema(P=0.04)的丰度。与低剂量ZEA添加组相比，高剂量ZEA的添加显著降低未分类F082_unclassified菌(P=0.02)和密螺旋体Treponema的丰度(P = 0.03)。
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表 8 玉米赤霉烯酮添加对山羊结肠细菌属水平相对丰度(至少有一个处理相对丰度>0.5%)的影响 Table 8 Effect of zearalenone addition on relative abundance of colon bacteria at genus level (each with a relative abundance >0.5% in at least one treatment)in goats |
玉米赤霉烯酮对家养动物生长性能的影响研究多集中在单胃动物，包括猪[13, 17]、家兔[18-19]和蛋鸡[20]等，在反刍家畜中的研究报道较少。ZEA污染日粮对单胃动物生产性能的影响不尽相同，有的研究发现低剂量摄入会使采食量、日增重和营养物质消化率降低，诱发氧化应激从而导致生长性能下降[17, 19]，也有一些研究报道ZEA摄入对断奶仔猪、后备母兔和育成蛋鸡的生产性能不造成影响[13, 18, 20]。反刍家畜中的研究发现，给泌乳奶牛饲喂浓度范围为330~660 mg·kg-1DM ZEA和2.62~5.24 mg·kg-1DM DON的日粮不影响其体重、干物质采食量、产奶量和乳成分等生产性能指标[8]。自然霉变条件下玉米面主要产生并富集ZEA和DON，以50%、100%霉变玉米面替代正常玉米面配制不同日粮饲喂奶牛，发现降低了其采食量、饲料转化率和产奶性能[10]。给泌乳后期崂山奶山羊饲喂50 μg·kg-1DM黄曲霉毒素B1和500 μg·kg-1DM ZEA污染日粮时，不影响其产奶量，但饲喂黄曲霉毒素B1、ZEA和赫曲霉毒素A联合污染日粮时，采食量和产奶量则显著降低[9]。本研究结果显示，100和500 μg·kg-1DM ZEA的饲喂不影响山羊的终体重、总增重、日增重以及干物质采食量这些生长性能指标，表明该剂量范围的ZEA不足以影响生长期山羊的采食和生长。此外，本研究还发现，500 μg·kg-1DM ZEA的饲喂对山羊的总增重、日增重以及干物质采食量均呈现上升趋势。该发现与前人的预测是一致的。Powell-Jones等[21]通过对ZEA的化学结构分析，表明ZEA有潜在的促进生长作用；ZEA催化加氢后形成的玉米赤霉醇，已被同化成类激素形式而商品化，作为一种生长促进剂应用于反刍动物生产中。本研究中添加ZEA后，山羊增重有提高的现象有可能是其在瘤胃中通过微生物的氢化作用形成玉米赤霉醇，进而促进动物的生长，但这还有待进一步的试验验证。
瘤胃中挥发性脂肪酸VFA的产量和组成是表征瘤胃发酵模式的重要指标。瘤胃发酵所产生的VFA来源于微生物对碳水化合物的消化，是反刍家畜的重要能量来源，约占其吸收能量的70%~80%，而其中乙酸、丙酸和丁酸约占瘤胃VFA总产量的95%左右[22]。大肠中的厌氧菌要比好氧菌高，因此纤维性碳水化合物可以通过微生物厌氧发酵产生VFA，与瘤胃相似，主要由乙酸、丙酸和丁酸组成。大肠对由VFA的积累而引起的肠腔内环境变化的缓冲能力要比瘤胃弱，因此VFA的过度积累就会破坏肠道的单层细胞结构，引发肠道功能下降[23]。本研究结果发现，500 μg·kg-1DM ZEA的添加降低结肠食糜中戊酸的摩尔百分比，不影响山羊瘤胃食糜各种VFA和结肠其他VFA的摩尔百分比和总VFA含量。相比于其他主要VFA，戊酸是一种尚未得到充分研究的代谢产物。据报道，戊酸一方面由碳水化合物产生，另一方面来自蛋氨酸、脯氨酸、精氨酸和赖氨酸的降解产物[24-26]。体外发酵模型研究报道，在人体结肠中戊酸由脯氨酸代谢产生，能促进结肠屏障的形成[27]。因此推测，500 μg·kg-1 DM ZEA的添加可能会降低结肠对蛋白质的代谢能力，但这有待进一步的研究证实。
瘤胃中栖息的微生物数量和种类最多，它们每天消化的碳水化合物占采食总碳水化合物的50%~55%，因此，瘤胃微生物在反刍家畜的饲料消化过程中起着重要的作用。瘤胃微生物包括细菌、原虫和厌氧真菌，一般每克瘤胃内容物中含细菌109~1010个。据报道，在80~100日龄的山羊瘤胃中优势菌门为厚壁菌门和互养菌门(Synergistetes)，但从110日龄以后，拟杆菌门和厚壁菌门变为优势菌门[28]。厚壁菌门可以降解纤维和纤维素，与机体的能量代谢密切相关，在多糖的发酵等过程中发挥作用，且厚壁菌门与拟杆菌门在能量代谢方面有互作效应，能协同促进能量的吸收利用和储存[29-31]。在瘤胃微生物区系的变化方面，厚壁菌门在瘤胃微生物门水平上表现为优势菌，在科水平上的优势菌为普雷沃菌科[32]。本研究发现，100和500 μg·kg-1 DM ZEA处理后，瘤胃的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota) 和变形菌门(Proteobacteria)。这与前述的研究结果并不完全一致。本研究采用的湘东黑山羊在试验期间不足三月龄，饲喂的是玉米-豆粕型精料，粗料是黑麦草。而前述Han等[28]的研究采用的精料也是以玉米和豆粕为主，但粗料采用的是苜蓿。由于优势菌的组成容易受到品种和日粮组成的影响，所以认为是品种和日粮组成的不同导致瘤胃优势菌门的组成不同。本研究结果显示，低剂量ZEA的添加降低瘤胃细菌的Shannon指数和Simpson指数，高剂量ZEA的添加也降低瘤胃细菌的Simpson指数和Shannon均匀度，表明ZEA处理降低了山羊瘤胃细菌的α-多样性和均匀度。丁酸弧菌(Butyrivibrio)可发酵纤维素、淀粉和其他多聚糖产生丁酸，有时也产生乳酸。毛螺菌属通常参与动物体内糖代谢，尤其是多糖降解过程[33]。普雷沃氏菌和丁酸弧菌是反刍动物的瘤胃核心菌[34]，瘤胃宏基因组数据显示普雷沃氏菌与果糖的利用相对丰度和蛋白质降解相对丰度成正相关，对于瘤胃发酵功能有重要意义[35]。本研究发现，低剂量ZEA添加升高瘤胃丁酸弧菌(Butyrivibrio)、毛螺旋菌(Oribacterium)和未分类毛螺旋菌(Lachnospiraceae_unclassified)的丰度。高剂量ZEA添加降低瘤胃毛螺菌(Lachnospiraceae_ND3007)和未分类毛螺旋菌(Lachnospiraceae_unclassified)以及普雷沃氏菌(Prevotellaceae_UCG-003)的相对丰度，说明高剂量ZEA会抑制毛螺旋菌和普雷沃氏菌的生长，可能阻碍瘤胃中这些微生物对多糖、果糖以及蛋白质营养物质的消化利用。
后肠和瘤胃的微生物的数量相似，都在1010~1012个·mL-1, 其中95%以上都是厌氧菌[36]。目前，关于反刍家畜后肠微生物菌群的研究非常有限。有报道发现，在6月龄山羊结肠内容物中的优势菌门是厚壁菌门(Firmicutes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)，占比可达90%以上[37]，也有研究报道4月龄波杂雌山羊盲肠和结肠内容物菌群中厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌门[38]。饲喂全混合日粮的5周龄荷斯坦奶牛其后肠内容物中的优势菌门是厚壁菌门和变形菌门[39]。拟杆菌门是断奶前犊牛后肠的最优势菌门，在结肠内容物中的占比达到49.8%，其次是厚壁菌门，结肠内容物中占比为25.4%。在属水平上，后肠的优势菌属包括普雷沃菌(Prevotella), 拟杆菌(Bacteroides), 粪杆菌(Faecalibacterium)和梭菌(Clostridium)等[40]。本研究发现，ZEA处理后山羊结肠食糜中优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)，优势菌门的组成与前述在山羊中的研究结果是一致的。以往研究发现，在家兔中400~1 600 μg·kg-1DM ZEA处理增加盲肠菌群多样性[19]。然而本研究显示，与低剂量组相比，高剂量ZEA的添加降低结肠细菌的α多样性(主要体现在Shannon指数和Simpson指数的下降)，这可能是物种、剂量以及肠段的不同导致ZEA的作用效果出现差异。该结果说明高剂量ZEA的添加对结肠细菌的生长具有抑制性，这与高剂量ZEA的添加造成结肠戊酸的产量下降23%是协同的，进一步表明高剂量ZEA可能会对结肠的屏障造成损伤[27]，相关的分子介导机制值得进一步研究。放线菌门是一类革兰阳性菌，是非常重要的微生物资源，约70%的抗菌肽是其次级代谢产物，对宿主有着较强的益生作用，其相对丰度的变化可能和机体的免疫反应有关[12]。据报道，螺旋菌门是反刍动物肠道黏膜的共生菌[40]，在山羊盲肠黏膜中大量存在[41]。本研究还发现，低剂量ZEA添加降低放线菌门(Actinobacteriota)的丰度，高剂量ZEA添加降低螺旋菌门(Spirochaetota)的丰度，说明100和500 μg·kg-1DM ZEA的添加均影响放线菌门和螺旋菌门细菌，可能对结肠部位的抗菌肽的生成以及局部免疫反应造成一定的不利影响。有报道证实，克里斯滕森菌(Christensenellaceae minuta)能够利用各种糖并产生挥发性脂肪酸终产物，因此该菌与肥胖指数呈负相关[42-43]。梭菌(Clostridium)又名梭状芽孢杆菌属，是一类可以产生芽孢的肠道菌群。梭菌属的很多细菌能将碳水化合物转化为乙酸、丁酸、氢气和有机溶剂等[44-46]，如丁酸梭菌、丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等。研究表明，梭菌属定植于肠道可刺激机体肠嗜铬细胞分泌5-羟基色胺[47]。螺旋菌门下的密螺旋体属Treponema，是重要的纤维分解菌[48-49]。本研究中高剂量ZEA添加降低克里斯滕森菌(Christensenellaceae_R-7)、梭菌(Clostridium)和密螺旋体(Treponema)的丰度，说明500 μg·kg-1DM ZEA的添加会抑制这三类细菌的生长，影响结肠部位糖类和纤维的分解，这可能与ZEA的内分泌干扰作用有关。推测高剂量下结肠戊酸产量的下降可能是克里斯滕森菌(Christensenellaceae_R-7)相对丰度下降所导致。
4 结论 4.1日粮中添加100和500 μg·kg-1DM ZEA不影响山羊的生长性能和瘤胃发酵参数，但降低瘤胃细菌的α多样性和均匀度。高剂量ZEA添加抑制瘤胃优势菌门厚壁菌门(Firmicutes)、毛螺菌属(Lachnospiraceae_ND3007)和未分类毛螺菌属(Lachnospiraceae_unclassified)以及普雷沃氏菌(Prevotellaceae_UCG-003)的增殖。
4.2日粮中添加500 μg·kg-1 DM ZEA抑制结肠食糜中戊酸的生成，100和500 μg·kg-1DM ZEA的添加不影响结肠细菌的α多样性。同时100和500 μg·kg-1DM ZEA的添加会抑制结肠放线菌门(Actinobacteriota)和螺旋菌门(Spirochaetota)的增殖。
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(编辑 范子娟)