2. 新疆阿勒泰地区动物疾控中心, 阿勒泰 836500;
3. 新疆畜牧科学院畜牧研究所, 乌鲁木齐 830011
, CHEN Zhuo1, LI Xin2, SUN Yawei1, JIN Xiaoye1, LI Ziqian1, WUMAIERJIANG·Yahefu1, ZHONG Qi3, MA Xuelian1
, YAO Gang1
2. Center of Diagnosis and Control of Animal Diseases in Altay Prefecture, Altay 836500, China;
3. Institute of Veterinary Research, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830011, China
羔羊从出生后以摄食母乳为主过渡到完全摄入固体饲料，其消化道形态构造和功能在出生后第1个月发生显著的持续变化，在生命最初2~3 d内变化最大。这些生长发育变化会一直持续到断奶后[1]。羔羊在吮乳阶段的42日龄内，胃肠道的重量大幅度增加。小肠的生长发育时间持续更长，其肠黏膜遵循由近端至远端的发育模式，即隐窝和绒毛首先出现在十二指肠，然后逐渐出现在肠道的远端部分。羔羊出生时具有明显大空泡状结构的胎儿型肠细胞(foetal-type enterocytes)，在出生后5~7 d内逐渐被成年型肠细胞(adult-type enterocytes)取代[2-3]。羔羊肠道中消化酶也从出生开始随日龄增长而增加，如海藻糖酶(trehalase)的含量在7日龄达到最高，麦芽糖酶(maltase)含量在出生后第1天从十二指肠至回肠远端逐渐降低，在第7天均匀分布肠道[4]。羔羊在30~42日龄断奶会导致空肠和回肠的绒毛高度降低，吸收面积减少，在之后的30 d内更新肠上皮重新建立吸收能力[5]。断奶后羔羊肠道胰淀粉酶(pancreatic amylase)、肠刷状缘麦芽糖酶(intestinal brush margin maltase)和异麦芽糖酶(isomaltase)的产量增加，能够有效降解肠道内碳水化合物，而结构性膳食碳水化合物无法在近端胃肠道中消化，只能被微生物酶降解[6]。
研究表明，肠道菌群与其宿主的营养吸收、生长发育和免疫功能具有密切关系，生命早期的肠道微生物定植对宿主的生长、代谢、免疫系统的成熟及幼畜的健康至关重要[7-8]。Bi等[9]研究发现，产前羔羊胎儿肠道已具有低多样性和低丰度的代谢活性微生物，且主要由变形菌门、放线菌门和厚壁菌门的细菌组成。Li等[10]研究了0~56日龄山羊的胃肠道菌群，发现随着日龄的增长菌群多样性增加，大肠中的变形菌门被厚壁菌门所替代，毛螺旋菌属、巴恩斯氏菌属和布劳特氏菌属等的丰度随日龄增加而增加。Quijada等[11]发现，益生元对断奶前羔羊生长及其肠道菌群组成会造成影响，添加益生元后的羔羊平均日增重显著增加，而肠道菌群多样性显著性降低。Wang等[12]对早期断奶羔羊瘤胃菌群的动态变化研究发现，早期断奶会导致短期内羔羊瘤胃微生物群落丰富度和多样性显著降低。瘤胃微生物群的变化与断奶应激的持续性有关。吮乳期犊牛的肠道菌群组成结构和功能的研究也已有大量报道，Dias等[13]研究断奶前4个阶段犊牛胃肠道菌群的动态变化，发现菌群多样性在生命早期是高度可变的，随着日龄的增加犊牛瘤胃菌群的丰富度增加，而大肠中的丰富度减少。新生幼畜早期菌群移植在介导炎症反应和肠道菌群成熟方面具有积极作用。王燕等[14]采用粪菌移植法治疗羔羊腹泻，治疗效果表明，粪菌移植法能够有效治愈羔羊腹泻症状，血液生理生化功能得到改善，抑制了炎性反应，显著降低腹泻率。Rosa等[15]研究早期肠道菌群移植对新生犊牛健康和生产性能的影响，菌群分析显示，在第1周和第5周之间，受体犊牛的肠道菌群α多样性显著增加。然而，一月龄羔羊的肠道菌群组成结构及其功能的动态变化规律尚不够清晰。因此，本研究以一月龄湖羊吮乳羔羊为研究对象，采用16S rRNA基因测序技术对其新生期(3日龄)、哺乳期(10日龄)、补饲期(15日龄)和断奶前期(30日龄)肠道菌群的组成结构及其潜在功能的动态变化进行测定，并与43~45日龄断奶的60日龄的断奶羔羊的肠道菌群进行比较研究，以期阐明一月龄羔羊肠道菌群及其潜在功能的变化规律，为生产实践中通过早期调控菌群促进羔羊生长发育与保健提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计与动物分组试验在某规模化商品湖羊养殖场进行。在临床观察基础上随机选择新生期(3日龄，d03)、哺乳期(10日龄，d10)、补饲期(15日龄，d15)和断奶前期(30日龄，d30)无抗生素用药史，胎次一致，体重相近的健康吮乳羔羊各10只作为断奶前组，再选择相同条件断奶后期的健康羔羊(43~45日龄时一次性断奶后的60日龄，d60)10只作为对照组(表 1)。所有羔羊在早晨10点统一采集直肠粪便。按照该场常规饲养方式羔羊出生至断奶前与母羊在同一栏中随母羊饲养，第15天开始补饲颗粒料，羔羊自由采食和饮水。日粮配方和营养成分见表 2。
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表 1 试验羔羊分组 Table 1 Grouping of experimental lambs |
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表 2 羔羊日粮组成及营养水平 Table 2 Diet composition of lambs pre- and post- weaning period |
采样者佩戴一次性无菌PE手套，中指和食指伸入羔羊肛门近直肠处采集新鲜粪便约20 g，快速置于冻存管中，随即移入液氮中保存。所有样品带回实验室于－80 ℃保存，待测。
1.3 DNA提取、PCR扩增及高通量测序按照粪便基因组DNA提取试剂盒(天根生化有限公司)操作提取基因组DNA，采用16S rRNA序列扩增、测序和分析。测序分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。根据序列中的保守区域设计相应引物，并添加样本特异性Barcode序列，进而对rRNA可变区V3~V4进行PCR扩增。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒对目标片段进行切胶回收。参照电泳初步定量结果，采用荧光定量试剂盒Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit对PCR扩增回收产物进行荧光定量，定量仪器为Microplate reader(BioTek，FLx800)。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。MiSeq测序。最后上机进行高通量测序，由于MiSeq测序读长较短的特性，同时也为了保证测序质量，设定目标片段的测序长度为200~450 bp。
1.4 生物信息学及统计分析Miseq测序得到的PE reads使用软件Trimmomatic、FLASH、Usearch、perl程序，首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后用软件平台Usearch进行操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)聚类分析和物种分类学分析，去除丰度值低于全体样本测序总量0.001%(十万分之一)的OTU[16]。首先对OTU丰度矩阵中的全体样本在90%的最低测序深度水平，统一进行随机重抽样，从而校正测序深度引起的多样性差异。随后，使用QIIME软件分别对每个样本计算α多样性指数。使用QIIME软件，对UniFrac PCoA分析得到的三维数据作图，从而得知基于微生物系统发育关系的群落样本空间分布特征，量化样本间的差异和相似度。使用R软件对Unweighted的UniFrac距离矩阵分别NMDS分析，通过二维排序图描述群落样本的结构分布[17-18]。运用PICRUSt预测菌群基因组功能与KEGG数据库比对，进行菌群代谢功能的预测[19]，运用GraphPad Prism 9.0.0对相对丰度平均数大于0.1%的菌门和菌属进行差异统计并作图。
1.5 数据处理数据采用“mean±SE”表示。采用统计分析软件GraphPad Prism 9.0.0进行各组间单因素方差分析并作图。P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著，P>0.05表示无显著差异。
2 结果 2.1 肠道菌群组成结构和多样性分析2.1.1 羔羊肠道菌群OTU划分和分类 各组羔羊肠道菌群OTU划分和分类结果见表 3。各分类水平OTU数量在一月龄内呈上升趋势，且断奶后OTU数量极显著高于断奶前(P < 0.01)。在同一分类水平上3日龄与10日龄无显著差异(P>0.05)，但与15日龄和30日龄组差异极显著(P < 0.01)，且与60日龄组差异极显著(P < 0.01)。
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表 3 OTU划分和分类地位鉴定结果统计表 Table 3 Statistical table of OTU classification and classification status identification results |
2.1.2 alpha多样性 如图 1所示，羔羊肠道菌群Chao1、ACE和Shannon指数在一月龄内呈先降后升(P < 0.05)，且断奶后Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数显著高于断奶前(P < 0.05)。各指数均表现为10日龄组最低、60日龄组最高。
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*.表示P＜0.05，差异显著；**.表示P＜0.01，差异极显著。下同 *. Means P < 0.05, indicating there were significant differences; **. Mean P < 0.01, indicating there were extremely significant differences. The same as below 图 1 不同日龄羔羊肠道菌群alpha多样性指数结果 Fig. 1 Results of alpha diversity index of gut microbiota in lambs with different ages |
2.1.3 主成分分析(PCoA) PCoA结果如图 2所示，各组间肠道菌群结构分布Unweighted Anosim和Unweighted Adonis比较差异极显著(P < 0.01)。其中3日龄组肠道菌群极显著聚为一类(P < 0.01)；10日龄组极显著聚为一类(P < 0.01)；15日龄组和30日龄组极显著聚为一类(P < 0.01)；60日龄组极显著聚为一类(P < 0.01)。经NMDS降维处理后与PCoA结果一致，更好说明了这一分布特征(图 3)。
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图 2 不同日龄羔羊肠道菌群PCoA分析结果(Unweighted UniFrac) Fig. 2 Results of PcoA of gut microbiota in lambs with different ages(Unweighted UniFrac) |
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图 3 不同日龄羔羊肠道菌群NMDS分析图(Unweighted UniFrac) Fig. 3 Unweighted UniFrac NMDS analysis of gut microbiota in lambs with different ages |
2.2.1 门水平组成与差异 羔羊的肠道菌群相对丰度前20的菌门如图 4所示。羔羊肠道中拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋体门(Spirochaetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)和迷踪菌门(Elusimicrobia)在一月龄内呈上升趋势；厚壁菌门(Firmicutes)在一月龄内呈下降趋势。羔羊断奶前各日龄肠道中的拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、螺旋体门(Spirochaetes)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)和迷踪菌门(Elusimicrobia)的相对丰度均低于断奶后，断奶前各日龄的变形菌门(proteobacteria)相对丰度均高于断奶后。
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图 4 不同日龄羔羊肠道菌群门水平组成和相对丰度 Fig. 4 Composition and relative abundance of gut microbiota at phylum level in lambs with different ages |
差异菌门如图 5所示，3日龄和10日龄组的拟杆菌门(Bacteroidetes)显著低于60日龄组(P < 0.05)；3日龄、10日龄和15日龄组的黏胶球形菌门(Lentisphaerae)极显著低于60日龄组(P < 0.01)；3日龄、10日龄、15日龄和30日龄组的迷踪菌门(Elusimicrobia)和螺旋体门(Spirochaetes)极显著低于60日龄组(P < 0.01)；3日龄和10日龄组疣微菌门(Verrucomicrobia)显著低于60日龄(P < 0.05)；3日龄和10日龄组的厚壁菌门(Firmicutes)显著高于15日龄组和30日龄组(P < 0.05)；3日龄组和15日龄组的变形菌门(proteobacteria)显著高于60日龄组(P < 0.05)；10日龄组的放线菌门(Actinobacteria)显著低于15日龄组和30日龄组(P < 0.05)。
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***表示P＜0.001，差异极显著。下同 *** mean P < 0.001, indicating there were extremely significant differences. The same as below 图 5 不同日龄羔羊肠道菌群相对丰度差异菌门 Fig. 5 The differential phyla in relative abundance of gut microbiota in lambs with different ages |
2.2.2 属水平组成与差异 羔羊的肠道菌群相对丰度前20的菌属如图 6所示。羔羊肠道中5-7N15、CF231、瘤胃球菌属(Ruminococcus)和密螺旋体属(Treponema)在一月龄内呈上升趋势且断奶后显著高于断奶前(P < 0.05)；拟杆菌属(Bacteroides)、乳酸菌属(Lactobacillus)和韦荣球菌属(Veillonella)在一月龄内呈下降趋势；拟杆菌属(Bacteroides)显著低于断奶前(P < 0.05)。
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图 6 不同日龄羔羊肠道菌群属水平组成和相对丰度 Fig. 6 Composition and relative abundance of gut microbiota at genus level in lambs with different ages |
差异菌属如图 7所示，3日龄组的产丁酸菌属(Butyricicoccus)和乳酸菌属(Lactobacillus)极显著高于15日龄、30日龄、60日龄组(P < 0.01)；3日龄和10日龄组的拟杆菌属(Bacteroides)显著高于60日龄组(P < 0.05)；3日龄组、10日龄组和60日龄组的脱硫弧菌属(Desulfovibrio)显著低于15日龄组(P < 0.05)；3日龄组的韦荣球菌属(Veillonella)极显著高于10日龄组、15日龄组、30日龄组和60日龄组(P < 0.01)；3日龄组的颤螺菌属(Oscillospira)极显著低于10日龄组(P < 0.01)；3日龄组、10日龄组和60日龄组的丁酸弧菌属(Butyricimonas)极显著低于15日龄组(P < 0.01)；3日龄、10日龄和15日龄组的5-7N15和密螺旋体属(Treponema)极显著低于60日龄组(P < 0.01)；3日龄和10日龄组瘤胃球菌属(Ruminococcus)显著低于60日龄组(P < 0.05)；3日龄和10日龄组的阿克曼氏菌属(Akkermansia)显著低于60日龄组(P < 0.05)；3日龄、10日龄和15日龄组的CF231显著低于60日龄组(P < 0.05)。
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图 7 不同日龄羔羊肠道菌群相对丰度差异菌属 Fig. 7 The differential genera in relative abundance of gut microbiota in lambs with different ages |
2.3.1 KEGG生物代谢一级通路 不同日龄羔羊肠道菌群的生物代谢一级通路分析中相对丰度大于1%的功能基因有6种，包括环境信息处理(Environmental Information Processing)、遗传信息处理(Genetic Information Processing)、代谢(Metabolism)、有机系统(Organismal Systems)、细胞过程(Cellular Processes)、和人类疾病(Human Diseaes)，每种功能基因在不同日龄羔羊中相对丰度基本一致。由图 8所示，不同日龄羔羊的功能基因主要富集在环境信息处理、遗传信息处理、代谢，少量功能基因富集在有机体系统，其次是细胞过程和人类疾病。
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图 8 不同日龄羔羊肠道菌群KEGG-L1代谢通路功能组间差异 Fig. 8 Functional differences of KEGG-L1 metabolic pathway of gut microbiota in lambs with different ages |
2.3.2 KEGG-L2功能基因预测差异性分析 在KEGG-L2水平上具有显著差异的物质代谢通路有6条，羔羊肠道菌群的氨基酸代谢、能量代谢、辅助因子和维生素的代谢、萜类化合物和聚酮化合物代谢功能通路相对丰度在一月龄内呈上升趋势且断奶后显著高于断奶前(P < 0.05)，碳水化合物代谢通路相对丰度在一月龄内呈下降趋势且断奶后显著低于断奶前(P < 0.05)。
如图 9所示，3、10和15日龄组羔羊肠道菌群的氨基酸代谢、能量代谢、萜类化合物和聚酮化合物代谢功能通路相对丰度显著低于60日龄组羔羊(P < 0.05)，随日龄呈显著上升趋势；而3、10和15日龄组羔羊肠道菌群的碳水化合物代谢通路相对丰度显著高于60日龄组(P < 0.05)，随日龄增加呈现下降趋势。3日龄和10日龄组羔羊肠道菌群的葡甘聚糖生物合成与代谢功能通路相对丰度显著低于15日龄组和60日龄组羔羊(P < 0.05)，随日龄增加呈现先上升后下降趋势；3日龄组羔羊肠道菌群的辅助因子和维生素的代谢功能通路相对丰度显著低于60日龄组(P < 0.05)，随日龄增加呈现上升趋势。
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图 9 不同日龄羔羊肠道菌群KEGG-L2物质代谢功能组间差异 Fig. 9 Functional differences of KEGG-L2 metabolic pathway of gut microbiota in lambs with different ages |
本试验结果显示，羔羊出生后其肠道菌群丰富度和多样性随日龄增加不断升高，但在10日龄时有一下降趋势，说明羔羊随日龄以及断奶后饮食的变更，肠道菌群趋于复杂化和多样化。一项追踪了12名新生儿出生1年以内肠道菌群演替的研究结果显示，婴儿在60~130 d阶段时菌群多样性显著增加，但这种增长不是线性趋势，都经历了一个下降的间歇期后开始增加，并且这些微生物群在发育过程中是高度动态的[20]。上述研究与本研究相似，本研究在羔羊在第10日龄时菌群多样性也经历了一个下降的间歇期，分析其原因可能是由于微生物的成熟需要一个过渡时期以及随着肠道环境的发育单一菌群的消失使羔羊肠道菌群出现了这一间歇期。Yin等[21]将0~120日龄的湖羊分为9个不同日龄组，对其瘤胃菌群进行分析比较，发现菌群多样性在第3天有一显著下降，10日龄后呈持续上升，在第0、3和10天年龄组的菌群分别呈独立结构且相似度低于其他年龄组。上述研究与本研究相似，在哺乳阶段菌群多样性都有一个下降阶段。新生幼畜出生3~4 d其胎便菌群与母亲羊水、胎盘菌群共同存在，然而在出生后单独生长和哺乳阶段时食物单一，可能造成了羔羊胃肠道菌群α多样性的降低[22-23]。Li等[10]研究0~56 d的断奶前山羊胃肠道微生物群，其肠道菌群Beta多样性结果显示，第0天肠道菌群独立分布，14和28日龄聚为一类，补饲后的42~56日龄聚为一类。与本研究相似，3日龄和10日龄羔羊肠道菌群结构分别呈现独立分布，断奶前后羔羊肠道菌群差异显著，推测羔羊初生3 d肠道菌群可能来自母羊胎盘、肠道和初乳等，所以单独分类。补饲后的15日龄和30日龄羔羊肠道菌群分布较近，由于补饲条件下肠道菌群会保持着一定稳定状态，肠道内菌群的发酵底物较为稳定，没有强烈因子干扰，菌群在此阶段逐渐稳定下来。60日龄单独聚类，表明断奶后菌群趋于稳定。羔羊随胃肠道微生物与肠道组织之间互相作用，菌群结构在早期断奶至成年逐渐稳定，为反刍动物机体健康成长提供保障[24]。羔羊肠道菌群在一月龄内由一个由相对简单、脆弱逐渐转变为复杂、稳定。
3.2 羔羊肠道菌群组成差异性门水平上一月龄羔羊的肠道菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门组成。大量研究发现，羊、牛、猪等多数哺乳动物肠道主要优势菌门为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、螺旋菌体门和放线菌门等[25-26]。本研究结果与以上研究结果相一致。厚壁菌门丰度在3日龄至15日龄呈下降趋势后缓慢回升，拟杆菌门在3日龄和10日龄开始呈上升趋势。研究表明，当饲料中植物纤维含量较高时，肠道菌群以拟杆菌门为主，当饲料中蛋白质含量较高时，则厚壁菌门所占比例较大，厚壁菌门和拟杆菌门二者含量的比例会影响机体对能量的吸收[27]。由于羔羊在15日龄开始补饲以及肠道的持续发育，饲喂方式和食物的改变容易对机体产生一定应激[28]。变形菌门丰度在一月龄至断奶阶段呈下降趋势，变形菌门在哺乳动物体内作为一个不稳定的因素在某些特定的环境下会增加宿主患病的风险[29]，可能羔羊早期由于肠道内外环境的变化导致肠道菌群失调，而随补饲及断奶后逐渐适应日粮过渡和肠道内新环境，进而影响变形菌门的丰度。迷踪菌门丰度断奶后显著高于断奶前，可能与其生长特异性有关，受日粮、母乳、肠道环境等因素影响较为强烈[30]。疣微菌门在哺乳动物胃肠道免疫耐受中起主要作用，其相对丰度的减少或缺失与宿主免疫力的下降密切相关[31]。螺旋体菌门的升高可能与反刍或非反刍类食草特性相关[32]。
在属水平上，各菌属随日龄和断奶因素变化较多。本研究中产丁酸菌属、乳酸菌属、韦荣氏球菌属和梭菌属在羔羊3日龄丰度最高，10日龄开始丰度呈下降趋势，至断奶后部分菌属基本消失。新生羔羊在接触到母体粪便和阴道细菌后初步形成其早期菌群。产丁酸菌属主要从动物及人类粪便中分离，丁酸作为其主要代谢物在体内可以通过脂肪酸氧化为机体供应能量，是肠道上皮细胞的主要供能物质，与机体健康密切相关，对调节肠道健康、抑制炎症、提高免疫力、抗氧化等生理功能具有重要意义[33-34]。Slifierz等[35-36]研究发现，梭菌属为断奶前仔猪的主要优势菌属，可以调节肠道T细胞介导的免疫应答，与结肠炎抗性密切相关。乳酸菌属作为人体肠道中的有益菌，在人体肠道中能发挥营养功能作用，可有效地调节肠道微生态平衡，维持胃肠道正常生理功能，并提高机体免疫力，促进细胞素的分泌，抵抗外来致病微生物的的入侵[37-38]，说明参与降解饲粮中营养物质的菌群在羔羊摄取固体饲料之前便已在肠道中定植。婴儿刚出生时，最初肠道菌群中以乳酸菌属为优势菌，随着婴儿的成长，肠道菌群中乳酸菌属数量反而下降[39]，上述研究与本研究相似，羔羊的乳酸菌属最初为优势菌群，之后随日龄增加而减少，阿克曼氏菌属、密螺旋体属和瘤胃球菌属在15日龄后丰度增加。肠道微生物的定植可以分为三大类，分别是先导菌、过渡菌和成熟菌[40]，本研究中在3~10日龄时乳酸菌属为主要的先导菌，在15日龄补饲后拟杆菌属、瘤胃球菌属和密螺旋体属等为主要的过渡菌，此阶段饲粮对羔羊菌群结构变化的影响最显著。阿克曼氏菌属是肠道中降解黏蛋白的主要菌，以黏蛋白作为能源物质，从而通过竞争作用保护肠道免受致病菌的侵害。与其他肠道菌不同的是，阿克曼菌可以储备黏蛋白，即使在肠道中没有营养物质，也可以正常繁衍生息[41-42]。还有研究表明，阿克曼氏菌属在肠道菌群逐渐稳定阶段有着重要作用[43]。5-7N15属于杆菌纲，杆菌纲的一些属具有高活性的半纤维素分解能力，这为寄主提供了从纤维植物中消化和提取营养的能力，故在断奶后丰度有所增加。颤螺菌属在羔羊所有日龄中都有少量存在，可能由于羔羊出生后接触外界环境或哺乳时接触母体所致。此外，基于当前细菌数据库，本研究在羔羊肠道菌群内还检测到大量未被分类鉴定的菌属，这些结果也暗示湖羊羔羊具有自己特有的肠道菌群，同时也反映了目前对微生物区系研究还不足够的事实，在今后的研究中有待于进一步挖掘。
3.3 羔羊肠道菌群物质代谢功能预测变化碳水化合物在维持动物生长发育、机体代谢和生产性能等方面发挥重要作用。有研究报道食物中的碳水化合物等营养物质在结肠和盲肠中发酵，即在大肠厌氧微生物的作用下可生成短链脂肪酸SCFAs[44]。SCFAs可以调控山羊瘤胃上皮细胞的生长，维持瘤胃上皮完整性，这种调控作用是通过G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase)调控网络共同介导的[45]。从而提示，一月龄羔羊肠道菌群碳水化合物功能较强有助于羔羊瘤胃上皮和肠道的发育。成年反刍动物的膳食碳水化合物(例如淀粉和纤维素)大部分在瘤胃内被微生物代谢利用产生有机酸而氧化提供ATP，只有5%~20%的膳食碳水化合物在小肠中被消化[46]。本研究中羔羊在3日龄至15日龄时为非反刍阶段，瘤胃没有发育完全，大部分碳水化合物均在肠道消化吸收，随日龄及断奶后羔羊瘤胃发育完全，碳水化合物主要被瘤胃中微生物发酵，在肠道菌群预测的碳水化合物功能丰度下降。动物消化和代谢所需要的酶类有35%以上产生于肠道菌群，其中25%的酶参与了碳水化合物代谢，同时，肠道微生物多样性的降低会导致菌群功能的减少，降低菌群产生消化酶的效率[47-48]。羔羊在15日龄前菌群多样性相对于断奶后较低，这可能是影响羔羊在一月龄至断奶羔羊肠道菌群碳水化合物功能呈下降趋势的原因。本研究中，羔羊肠道菌群的氨基酸代谢、能量代谢、萜类化合物和聚酮化合物功能随日龄增加而升高。有研究发现氨基酸的供给对羔羊的体重和日增重有显著升高作用，可改善饲粮饲料转化效率，必需氨基酸的缺乏对羔羊生长发育和屠宰性能有较大影响，氨基酸代谢的降低会影响心、肝和肾等器官的发育[49-50]。Aßhauer等[51]研究证实，氨基酸代谢和碳水化合物的代谢是微生物生存过程中所具备的基本功能。Selinger等[52-53]发现，拟杆菌属、丁酸弧菌属等可以产生蛋白酶、肽酶和脱氨酶等蛋白水解酶，以帮助分解可降解蛋白质。本研究发现，瘤胃球菌属与肠道菌群的氨基酸代谢、能量代谢、萜类化合物和聚酮化合物功能的变化规律相似，有研究发现，白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌等细菌在植物纤维素、半纤维素的降解中发挥着重要作用[54]。Lim等[55]研究发现，萜类化合物和聚酮化合物的代谢的相对丰度均随着年龄的增加而显著增加，与本研究相似。萜类化合物和聚酮化合物是自然界分布广泛、种类最多的一类植物天然产物，迄今已从动物、植物和微生物中分离了4万多种萜类化合物，产生于微生物生长缓慢或稳定期，其在羔羊吃植物类食物后，释放出萜类物质[56]。肠道微生物的代谢与宿主的食性是紧密相关的，在长期进化过程中，肠道菌群会随着食物类型的变化发生响应[57]。从而提示，羔羊肠道菌群的萜类化合物和聚酮化合物功能随日龄和断奶上升可能时由于羔羊断奶后需要代谢饲料中含有的不同植物所导致。
4 结论本研究结果表明湖羊羔羊的肠道菌群的α多样性在一月龄至断奶后呈上升趋势，且在10日龄时有一下降间歇期。3~60日龄羔羊不同阶段肠道菌群组成结构显著不同。3~15日龄羔羊肠道菌群的碳水化合物代谢功能显著高于其后日龄，蛋白质、能量、萜类化合物和聚酮化合物代谢功能显著低于其后日龄。15~30日龄羔羊肠道菌群组成结构和功能呈现“分水岭”样变化，该变化与补饲固体饲料的关系值得进一步研究。本研究揭示了新生羔羊早期肠道菌群和菌群功能的变化规律，为实践中通过调控菌群促进羔羊生长发育与保健提供参考。
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(编辑 范子娟)