2. 中国农业大学动物科学技术学院, 北京 100193
2. College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
随着高通量测序技术的出现，人们发现动物基因组的数量已经远超当前的基因注释，蛋白质编码基因只占整个基因组的不到2%，超过70%的基因序列被转录成RNA，但大多数未翻译成蛋白质，这些不编码蛋白的转录物被称为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNAs)[1]。根据长度将小于200 bp的ncRNA被称为小的非编码RNA(small noncoding RNA，sncRNA)[2]，而200 bp以上的非编码RNA被称为长链非编码RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)[3]。lncRNAs通常分为反义lncRNA、内含子ncRNA、大基因间ncRNA、启动子相关lncRNA和非翻译区lncRNA五类，主要由RNA聚合酶II转录，其结构具有5mG cap，经过剪接和多聚腺苷酸化，但缺乏明显的开放阅读框架[3-4]。随着二代测序和微阵列等敏感、高通量测序技术的应用，已发现多种lncRNAs具有调控细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学功能[5-6]，对其功能的研究逐渐成为当前热点。
雌性哺乳动物从性成熟开始卵泡发生周期性变化，但只有优势卵泡能发生排卵，其余卵泡均发生闭锁，GCs凋亡被认为是闭锁过程中的潜在机制[7]。细胞凋亡是最常见的程序性细胞死亡类型，功能性凋亡途径对器官发育和组织稳态至关重要[8]。GCs发生凋亡最为明显的特征是其形态学变化，表现为核质浓缩、线粒体空泡化和凋亡小体的形成[9]。研究表明，GCs凋亡的分子途径有外源性途径和内源性途径，以线粒体释放凋亡酶激活因子激活半胱氨酸蛋白酶(CASPASE)的内源性途径为主[10]。在凋亡信号作用下GCs内的线粒体细胞色素C释放，作为凋亡诱导因子能与凋亡蛋白活化因子、CASPASE9前体、ATP/dATP等形成凋亡体，激活CASPASE3后引发级联反应，最终导致GCs凋亡[11]。细胞凋亡受到多种因素的影响，最近的研究显示lncRNAs可作为重要调控因素参与细胞凋亡过程[12-13]。
目前，已经发现lncRNAs在不同物种的GCs凋亡过程中发挥作用，例如，在人、猪、羊、小鼠上的研究表明lncRNA NEAT1、lncRNA TCONS_00814106、lncRNA-FDNCR、lncRNA- MALAT1等参与调控GCs的凋亡过程[14-17]。关于lncRNAs对牦牛GCs凋亡的调控作用研究较少，从lncRNAs角度研究卵泡GCs的凋亡，对阐明卵巢卵泡的闭锁机制具有重要意义。本课题组前期通过生物信息学软件预测结合牦牛卵巢测序结果发现，在健康卵泡中lncRNA ENSBGRT00000000387.1的表达显著高于闭锁卵泡，提示它可能参与调控卵泡闭锁过程。本研究拟利用慢病毒载体构建技术构建牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒载体，并感染牦牛GCs以了解其对细胞凋亡的影响，为研究lncRNA在牦牛卵巢生理过程中的分子调控机制提供基础。
1 材料与方法 1.1 牦牛卵泡总RNA提取及cDNA池构建在西藏林芝临河牲畜屠宰场选择健康的5~7岁的娘亚母牦牛，屠宰后立即取卵巢保存于37 ℃的灭菌PBS缓冲液中并在2 h内带回实验室。使用75%酒精快速表面消毒卵巢后，37 ℃的PBS反复清洗3次，用20 mL注射器配12号灭菌针头，抽吸2~6 mm的卵泡于2 mL离心管中。利用Trizol ReagentTM试剂(Invitrogen)法提取卵泡总RNA，使用超微分光光度计(Thermo Fisher)测定浓度和纯度；按照FastKing cDNA第一链合成试剂盒(天根)说明书在冰浴条件下按照5×gDNA Buffer 2 μL、RNA 2 μL和RNase-Free ddH2O 8 μL配制gDNA去除体系，42 ℃孵育3 min；反转录反应体系：10×King RT Buffer 2 μL、FastKing RT Enzyme Mix 1 μL、FQ-RT Primer Mix 2 μL、RNase-Free ddH2O 5 μL；将gDNA去除体系和反转录体系充分混匀，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min，以构建牦牛卵泡cDNA池，将产物－80 ℃保存备用。
1.2 lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达重组质粒的构建及鉴定在Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)中检索出牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全序列信息(登录号：ENSBGRT00000000387.1)，应用Primer Premier5.0软件设计的特异性引物(F：GACTGGCTGGGGCCAGAGGG；R：TGCAGTAAGCCAGGCTTTCTTCCTGCA)由成都擎科生物科技有限公司合成，通过PCR技术从牦牛卵泡cDNA池中扩增lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全长片段，预期扩增目的片段总长度为2 566 bp。反应体系：上游引物(10.0 μmol·L-1)0.5 μL，下游引物(10.0 μmol·L-1) 0.5 μL，2×Taq Plus Master Mix(TAKARA)10.0 μL，ddH2O 9.0 μL，共20.0 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；4 ℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离并切胶回收，送往成都擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果使用DNAMAN软件进行序列比对，PCR产物用于酶切。
对LV-EF1a-EGFP-2A载体(武汉枢密生物科技有限公司)进行Nhe I和EcoR I双酶切，获得线性化的载体片段。反应体系: LV-EF1a-EGFP-2A质粒(1 μg·μL-1)2 μL，10×酶切缓冲液5 μL，Nhe I(Fermentas公司)1 μL(10 U·μL-1)，EcoR I(Fermentas公司) 1 μL(10 U·μL-1)，ddH2O 41 μL，共50 μL。反应条件: 37 ℃酶切3 h。使用Pirme pirmer5.0对牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1序列及载体序列比对分析后，利用Nhe I和EcoR I两个限制性内切酶位点将目的片段克隆到LV-EF1a-EGFP-2A载体中，据此设计lncRNA的特异性引物(F：TGTCGTGATCTAGAGCTAGCGACTGGCTGGGGCCA；R：AAGGCGCAACCCCAACCCCGTGGGAATTCCACACAAAAAACCAACAC)，其中导入了Nhe I和EcoR I内切酶酶切位点(引物下划线部分)，并且正向引物含有与线性化的lncRNA ENSBGRT00000000387.1片段Nhe I酶切位点末端15 bp同源区，反向引物含有与线性化的lncRNA ENSBGRT00000000387.1片段EcoR I酶切位点末端18 bp同源区。将线性化载体与具有同源臂的插入片段混合，在同源重组酶Exnase作用下，实现多个片段与载体的同源重组连接。LV空载具有Nhe I和BamH I酶切位点(引物斜体下划线部分)的插入片段(F：TGTCGTGATCTAGAGCTAGCGAATTCCCACGGGGTTGGGG；R：CTCACCATGGTGGCGGATCCCCTGGGGAGAGAGGTCGG)，其中正向引物含有与线性化的hPGK片段Nhe I酶切位点末端14 bp同源区，反向引物含有与线性化的hPGK片段BamH I酶切位点末端18 bp同源区，采用Nhe I和BamH I(Fermentas公司)对LV-EF1a-EGFP-2A载体酶切获得线性化的载体片段，连接方法同上。上述产物分别转化至大肠杆菌Trans1-T1(全式金生物)，吸取适量转化后的菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的筛选平板上，37 ℃恒温箱中倒置培养12~16 h。挑取抗性菌落至PCR管中，使用质粒小提试剂盒(天根)提取质粒，并用Nhe I和EcoR I对目的片段及LV-EF1a-EGFP-2A载体进行双酶切及鉴定。反应体系：上游引物(10.0 μmol·L-1)0.5 μL，下游引物(10.0 μmol·L-1) 0.5 μL，2×Taq Plus Master Mix(南京诺唯赞)10.0 μL，ddH2O 9.0 μL，共20.0 μL。扩增循环反应条件：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，22个循环。对鉴定正确的质粒送往成都擎科生物科技有限公司进行测序验证，使用Chromas Lite Version 2.1.1软件对测序结果与目的片段序列进行比对分析，分别提取足量的lncRNA过表达重组质粒与LV空载，进行超纯去内毒素抽提。
1.3 慢病毒质粒的包装浓缩和滴度测定1.3.1 慢病毒质粒的包装和浓缩 按照1.2×106个每孔接种293T细胞(武汉枢密生物科技有限公司)于6孔板中，置于37 ℃，5% CO2的二氧化碳培养箱(Esco Lifesciences)中培养。慢病毒辅助包装系统(武汉枢密生物科技有限公司)中成分pVSVG∶pMDL∶pRev与lncRNA过表达重组质粒(20 μg)分别按照1∶1∶1∶2的比例混合后，加入含有适量LipofectamineTM2000(Invitrogen)的DMEM(Gibco)培养基中，混匀15 min后用于共转染密度达到60%~70%的293T细胞。8 h后更换为含有10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培养基，于37 ℃培养箱继续培养48~72 h。由于在重组质粒上含有EGFP标签蛋白，若293T细胞被慢病毒感染后均有EGFP标签蛋白绿色荧光的出现，即细胞EGFP阳性率可得出慢病毒的感染效率。在荧光显微镜之下选择3个视野分别在明场和绿色荧光下进行计数，根据公式EGFP阳性率=(带有绿色荧光的细胞数/明场下所有细胞数)×100%，计算得出慢病毒的感染效率。收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，1 000 r·min-1离心5 min，0.45 μm滤器(Millipore)过滤收集病毒浓缩液，即为目的lncRNA过表达慢病毒载体。
1.3.2 qPCR法测定病毒的滴度 按1.2×106个·孔-1接种293T细胞于6孔板中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养12 h后，每孔添加20 μL制备好的lncRNA过表达慢病毒载体悬液，轻轻摇晃，使病毒悬液均匀分散在培养基中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养72 h。按照基因组DNA提取试剂盒(天根)操作提取293T细胞基因组DNA，并测定DNA浓度。选取病毒相对应的质粒(LV-EF1a-EGFP-2A)为标准品，测定质粒浓度并计算出其相应体积的拷贝数，并将浓缩质粒稀释到1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103 copies·μL-1。根据该慢病毒载体中所用转录后调控元件WPRE测定慢病毒滴度。qPCR反应体系：SsoAdvancedTM Universal SYBRⓇ Green Supermix(BIO-RAD) 5 μL、DNA 2 μL、ddH2O 1 μL、WPRE上下游引物各1 μL(F：CCGTTGTCAGGCAACGTG；R：AGCTGACAGGTGGTGGCAAT)。PCR反应条件：95.0 ℃预变性3 min，40个循环(95.0 ℃变性10 s，60.0 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s)，读板，72 ℃延伸15 s，其中65~95 ℃每隔0.5 ℃读板一次，温度恒定1 s后读板。qPCR反应完成后生成标准曲线及加入样品的拷贝数，根据公式计算慢病毒的滴度：慢病毒滴度(TU·mL-1)=(q-PCR copies·μL-1×M×gDNA稀释倍数)×1 000 μL/感染细胞病毒体积(μL)，其中M为gDNA提取后洗脱体积。将慢病毒载体调整滴度为2×108 TU·mL-1，用于后续细胞感染试验。
1.4 牦牛卵泡GCs的分离培养及感染牦牛卵巢采集方法同“1.1”，抽吸卵巢表面2~6 mm的卵泡置于15 mL离心管中沉淀15 min，弃上清；利用PBS缓冲液重悬沉淀后使用70 μm细胞筛(Falcon)过滤，取滤液1 000 r·min-1离心4 min，PBS清洗3次后获得牦牛GCs。按照1.2×106个·孔-1接种于6孔板，在含有10% FBS(Gibco)的DMEM培养基中38.5 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。试验共分为3组，其中一组感染lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体(lncRNA组)，第二组感染LV空载体(LV组)，第三组为空白对照组(NC组)不做处理，每组均设置3个平行重复孔。GCs培养至密度达70%~80%时，弃去原培养基将慢病毒载体7 μL在2.5 mL的DMEM培养液中混匀，感染GCs 8 h后，用PBS清洗3次，立即在荧光倒置显微镜(Olymplus)下观察细胞感染情况。更换为含10%FBS的DMEM培养基，继续培养48 h，完成试验后分别收集细胞用于qPCR、Western blot和流式细胞仪检测。
1.5 RNA表达量检测采用Trizol法提取各组牦牛卵泡GCs的总RNA，参考“1.1”操作反转录，RT产物用于qPCR法检测lncRNA ENSBGRT00000000387.1 (F：TAGCAGGTGGGCAGTG，R：TTTCAAATACCGCCAC)以及CASPASE3(登录号：NW_005394655.1，F：GACAGACAGTGGTGCTGAGG，R：AGAAACATCACGCATCAA)、BAX(登录号：NW_005393662.1，F：GAGCAACCCAGAGGCGG，R：CTGATCAACTCGGGCACCTT)、BCL-2(登录号：NW_005396489.1，F：GACTTCGCCGAGATGTCCAG，R：CACATGACCCCTCCGAACTC)基因mRNA水平的相对表达量。反应体系为20 μL：SYBRⓇ Green Supermix(BIO-RAD)10 μL，RT产物1 μL，上、下游引物各500 nmol·L-1。反应程序：95.0 ℃预变性3 min，40个循环(95.0 ℃变性10 s，退火30 s，72 ℃延伸15 s)，读板，72 ℃延伸15 s，其中65~95 ℃，每隔0.2 ℃读板一次，温度恒定1 s后读板。以β-actin为内参(F：CCAACTGGGACGACATGGA，R：GTCTCGAACATGATCTGGGTCAT，产物146 bp)，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA ENSBGRT00000000387.1、CASPASE3、BAX、BCL-2基因mRNA水平的相对表达量。
1.6 Western blot检测蛋白表达水平用预冷的PBS清洗牦牛卵泡GCs后，分别加入200 μL的1×SDS-Loading Buffer收集细胞，100 ℃金属浴中加热10 min，瞬离取上清，使用BCA蛋白定量试剂盒(Sigma-Aldrich)检测蛋白质浓度。蛋白质以20 μg的上样量经SDS-PAGE凝胶蛋白电泳仪(BIO-RAD)电泳分离，取出凝胶切下目的条带，在转膜缓冲液中漂洗数秒，覆上NC膜，然后200 mA转膜2 h。取出膜进行抗体杂交，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别将CASPASE3抗体、BAX抗体、BCL-2抗体(Cell Signaling Technology) 与1%脱脂奶粉按1∶2 000配制成一抗，向NC膜上加入5 mL一抗，摇床上室温孵育1 h；将辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗鼠抗体(Sigma-Aldrich)、辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔抗体(Sigma-Aldrich)与1%脱脂奶粉按1∶1 000稀释，分别加入NC膜上摇床室温孵育1 h。将ECL发光液A液和B液等体积混合，均匀滴于膜上避光反应1 min，全自动化学发光成像分析系统(Tanon)曝光显影30 s，蛋白曝光图采用Image J软件进行灰度分析，以β-actin为内参计算CASPASE3、BAX、BCL-2蛋白的相对表达量。
1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡率将各组GCs使用0.05%胰酶(Gibco)消化后收集于离心管内，调整细胞密度为5×105个·mL-1，1 000 r·min-1离心5 min弃上清。使用Annexin V凋亡检测试剂盒(上海生工)处理细胞，加入195 μL的1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL的Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育15 min。加入200 μL的1×Binding Buffer再重悬细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清。加入190 μL的1×Binding Buffer重悬细胞，再加入10 μL的PI染色液轻轻混匀，1 h内使用流式细胞仪(Beckman CytoFlex LX)检测细胞凋亡率，设置激发光波长为488 nm，检测FITC荧光用一波长为515 nm的通带滤器，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。在双变量流式细胞仪的散点图上，左上象限区域(FITC-/Pl+)为坏死细胞；左下象限区域(FITC-/PI-)为未发生凋亡的细胞；右上象限区域(FITC+/PI+)为晚期凋亡细胞；而右下象限区域(FITC+/PI-)为早期凋亡细胞，试验设3个重复。
1.8 统计学分析采用SPSS 22.0软件的Independent sample T-test法分别对293T细胞lncRNA组和LV组的感染效率进行差异分析；采用One-Way ANOVA法分别对lncRNA组、LV组和NC组GCs的感染效率、lncRNA的相对表达量、细胞凋亡率和凋亡相关基因的mRNA和蛋白表达量进行显著性分析，试验结果采用“平均值±标准差(Mean±SD)”表示，显著水平设为P＜0.05或P＜0.01，利用GraphPad Prism8作图。
2 结果 2.1 lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒过表达载体构建2.1.1 lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达质粒构建 通过设计的特异性引物PCR扩增牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全长片段，经测序大小为2 566 bp，使用DNAMAN 9.0软件序列对比发现与Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)中牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1的全序列(登录号：ENSBGRT00000000387.1) 相似性为100%，确认扩增出牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1序列(图 1A)。利用限制性核酸内切酶(Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ)对PCR产物和线性化的空载体LV-EF1a-EGFP-2A进行双酶切，结果如图 1B所示，线性化的空载体大小为8 955 bp，lncRNA ENSBGRT00000000387.1的PCR产物经双酶切后获得3个具有酶切位点的部分片段，大小分别为1 442、891、288 bp；在同源重组酶Exnase作用下，实现多个lncRNA ENSBGRT00000000387.1片段与载体的同源重组连接，通过双酶切、琼脂糖凝胶电泳检测的方法进行初步鉴定，表明重组质粒LV-EF1a-lncRNA-EGFP-P2A-Pure-WPRE构建成功。该重组质粒的图谱如图 1C所示，对鉴定正确的质粒进行测序验证，结果显示重组质粒中的插入片段与lncRNA ENSBGRT00000000387.1基因序列完全一致，无碱基突变以及碱基插入、缺失等(图 1D)，表明重组过表达质粒构建成功。
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A.PCR扩增的lncRNA全长片段；B.重组质粒双酶切后的产物(1. Trans2KⓇ Plus Ⅱ DNA Marker；2.重组质粒双酶切后的产物)；C.重组质粒图谱；D.重组质粒的部分测序图谱 A. Full length of lncRNA fragment amplified by PCR; B. Product of recombinant plasmid after double enzyme digestion (1. Trans2kⓇ Plus Ⅱ DNA Marker; 2. The product of double enzyme digestion of recombinant plasmid); C. Recombinant plasmid map; D. Partial sequencing map of recombinant plasmid 图 1 lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达质粒的构建 Fig. 1 Construction of lncRNA ENSBGRT00000000387.1 overexpression plasmid |
2.1.2 lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒包装浓缩和滴度测定 lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体感染293T细胞后，如图 2所示，EGFP标签蛋白绿色荧光成功表达。利用荧光显微镜进行计数，结果表明，慢病毒的感染效率达(75.77±0.850)%，空载体感染293T细胞后感染效率达(77.02±1.373)%，二者之间差异不显著(P＜0.05)，且符合慢病毒载体感染细胞效率，说明目的lncRNA过表达慢病毒载体成功感染293T细胞。
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A.lncRNA组的293T细胞(明场)；B. lncRNA组的293T细胞(绿色荧光)；C. LV组的293T细胞(明场)；D. LV组的293T细胞(绿色荧光)；E. 293T细胞的感染效率：LV组表示细胞感染LV空载体，lncRNA组表示细胞感染lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体；ns表示差异不显著(P＞0.05)，下同 A. 293T cells of lncRNA group (bright-field); B. 293T cells of lncRNA group (green fluorescence); C. 293T cells of LV group (bright-field); D. 293T cells of LV group (green fluorescence); E. Infection efficiency of 293T cells: LV group indicate that cells infected with LV empty vector, and lncRNA group indicate that cells infected with lncRNA ENSBGRT00000000387.1 overexpression lentivirus vector; ns means no significant difference (P>0.05), the same as below 图 2 lncRNA过表达慢病毒载体感染后的293T细胞(40×) Fig. 2 293T cells infected with lncRNA overexpression lentivirus vector(40×) |
293T细胞感染慢病毒载体后提取细胞的DNA，以相应的对照质粒为标准品qPCR法测定lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒滴度，结果显示，经过计数可得慢病毒感染细胞后平均拷贝数达2.93×104 copies·μL-1，经计算病毒滴度为7.32×108 TU·mL-1，将其校准为2.00×108 TU·mL-1用于后续lncRNA过表达慢病毒载体感染GCs试验。
2.2 lncRNA过表达慢病毒载体感染牦牛卵泡GCs后对其凋亡的影响2.2.1 过表达慢病毒载体感染牦牛卵泡GCs后lncRNA ENSBGRT00000000387.1的表达量 lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体和LV空载感染牦牛卵泡GCs细胞后均能稳定表达EGFP绿色荧光蛋白(图 3D-F)。lncRNA组感染效率为(52.93±1.168)%，LV组感染效率为(53.28±0.349)%，二者之间差异不显著(P＜0.05)，表明该慢病毒载体已成功感染GCs(图 3G)。qPCR结果表明(图 3H)，目的lncRNA慢病毒过表达载体感染GCs后，目的lncRNA的相对表达水平升高，且与NC组和LV组相比差异极显著(P < 0.01)。
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A. NC组的GCs(明场)；B. LV组的GCs(明场)；C. lncRNA组的GCs(明场)；D. NC组的GCs(绿色荧光)；E. LV组的GCs(绿色荧光)；F. lncRNA组的GCs(绿色荧光)；G. GCs的感染效率；H. lncRNA ENSBGRT00000000387.1的相对表达水平：NC组表示空白对照组；不同大写字母表示差异极显著(P＜0.01)，下同 A. GCs of NC group (bright-field); B. GCs of LV group (bright-field); C. GCs of lncRNA group (bright-field); D. GCs of NC group (green fluorescence); E. GCs of LV group (green fluorescence); F. GCs of lncRNA group (green fluorescence); G. Infection efficiency of granulosa cells; H. Relative expression level of lncRNA ENSBGRT00000000387.1: NC group represents blank control group; different capital letters show significant difference(P < 0.01), the same as below 图 3 lncRNA过表达慢病毒载体感染后的牦牛GCs(40×) Fig. 3 Yak granulosa cells infected with lncRNA overexpression lentivirus vector(40×) |
2.2.2 过表达慢病毒载体感染牦牛卵泡GCs后对凋亡的影响 分别将lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒过表达载体和LV空载体感染GCs后，利用流式细胞仪检测细胞凋亡，结果见图 4，从中可以看出lncRNA组GCs凋亡率为(6.230±0.331)%，低于LV组细胞凋亡率(9.223± 0.397)%和NC组细胞凋亡率(8.653±0.705)%，且与LV组和NC组相比差异极显著(P < 0.01)，说明过表达lncRNA ENSBGRT00000000387.1抑制牦牛卵泡GCs凋亡。
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A.流式细胞仪检测GCs凋亡；B.GCs的凋亡率 A. Apoptosis of GCs detected by flow cytometry; B. Apoptosis rate of GCs 图 4 流式细胞术检测lncRNA ENSBGRT00000000387.1对牦牛GCs凋亡的影响 Fig. 4 Effect of lncRNA ENSBGRT00000000387.1 on granulosa cell apoptosis detected by flow cytometry |
2.2.3 过表达慢病毒载体感染牦牛卵泡GCs后凋亡相关基因的表达 利用qPCR检测牦牛卵泡GCs感染lncRNA ENSBGRT00000000387.1慢病毒过表达载体后凋亡相关基因的mRNA水平相对表达量，结果如图 5所示，lncRNA组CASPASE3和BAX基因mRNA水平的相对表达量显著降低(P < 0.01)(图 5A和5B)，BCL-2基因mRNA水平的相对表达量显著升高(P < 0.01)(图 5C)。Western blot检测结果显示，lncRNA组促凋亡蛋白CASPASE3和BAX表达量显著降低(P < 0.01)(图 5D、5E和5F)，抑凋亡蛋白BCL-2表达量显著升高(P < 0.01)(图 5D和5G)，表明lncRNA ENSBGRT00000000387.1可抑制牦牛卵泡GCs凋亡。
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A. CASPASE3基因的相对表达量；B. BAX基因的相对表达量；C. BCL-2基因的相对表达量；D. GCs凋亡相关蛋白的表达；E. CASPASE3蛋白的表达量；F. BAX蛋白的表达量；G. BCL-2蛋白的表达量 A. Relative expression of CASPASE3 gene; B. Relative expression of BAX gene; C. Relative expression level of BCL-2 gene; D. Expression of apoptosis related proteins in GCs; E. Expression of CASPASE3 protein; F. Expression of BAX protein; G. Expression of BCL-2 protein 图 5 lncRNA ENSBGRT00000000387.1感染牦牛GCs后凋亡相关基因的表达 Fig. 5 Expression of apoptosis related genes in yak granulosa cells infected with lncRNA ENSBGRT00000000387.1 |
lncRNAs是长度超过200个核苷酸但未翻译成蛋白质的转录本，在染色质、转录和转录后等多个水平上调节基因表达[5]，影响细胞增殖和凋亡[14]、细胞分化和发育[18]、某些疾病的发展[19]等过程。在哺乳动物生殖上的研究发现，lncRNAs可参与调节精子发生[20]、类固醇生成[21]、卵母细胞成熟[22]、胚胎植入和发育[23]、生殖疾病[24]等。目前，已有大量研究表明lncRNA与卵巢关系密切，在不同动物卵泡中均发现lncRNA的表达并在卵泡生长发育过程中具有重要作用[25]。小鼠的原始卵泡启动前后具有多个卵巢特异性的lncRNAs，且可能参与多个信号通路调控原始卵泡启动[26]。山羊的大卵泡和小卵泡测序鉴定出多个差异表达的lncRNAs，可能参与激素生成且与卵泡成熟密切相关[27]。目前，研究发现lncRNA在牛的卵巢、子宫和垂体中均有表达[28-30]，表明它们在雌性生殖方面的重要性。人们普遍认为，卵巢卵泡闭锁主要由GCs凋亡介导[31]，因此，探究lncRNAs对牦牛卵泡GCs凋亡的影响对阐明卵泡闭锁的分子机制至关重要。
慢病毒载体是由逆转录病毒科的人类免疫缺陷Ⅰ型病毒改造而成的一类病毒载体[32]，可将自身RNA逆转录整合到宿主细胞染色体实现目的基因的稳定表达[33]。EF1a启动子来自人类靶向延长因子1α(EF1A)基因，可在多数种类细胞中稳定表达[34]，因此本试验选用EF1a作为基因启动子构建过表达载体。前期本课题组应用转录组测序技术对牦牛卵巢卵泡的lncRNA表达谱进行了研究，发现lncRNA ENSBGRT00000000387.1在牦牛闭锁卵泡中表达显著下调。本研究构建了lncRNA慢病毒载体，感染293T细胞后其感染效率较高，符合慢病毒载体的感染效率[35]。qPCR法测定感染后293T细胞的慢病毒滴度高达7.32×108 TU·mL-1，且检测到lncRNA ENSBGRT00000000387.1的过表达效率显著，表明成功构建了lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体。
凋亡是一种由特殊的信号通路引起的细胞死亡形式，最终导致细胞收缩、细胞质起泡和细胞器的区隔化等[36]。卵泡闭锁可分为“窦闭锁”、“基底闭锁”和“终末分化凋亡”3种表型，不同的启动机制分别发生在卵泡细胞中间增生层、基底层和表皮层，但都涉及GCs凋亡[9]，已有研究表明，BCL-2、BAX和CASPASE3基因调控GCs的凋亡影响卵泡闭锁[10, 37-39]。细胞凋亡发生在卵泡发育的任何阶段，而卵泡GCs凋亡是导致卵泡闭锁的主要原因[9]。在GCs凋亡的内源性途径中，BCL-2蛋白能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而抑制了细胞凋亡；而BAX蛋白可与BCL-2蛋白形成异二聚体，对BCL-2产生抑制作用[40]；CASPASE3是一种终末剪切酶，其通过裂解细胞底物发挥重要作用[41]。因此，人们通常将CASPASE3、BAX和BCL-2基因表达水平用于衡量细胞的凋亡水平[42-43]。lncRNAs在卵巢卵泡GCs凋亡等过程中也发挥调控作用，例如，lnc-MAP3K13-7:1通过DNMT1下调促进人卵巢GCs凋亡[44]；在猪的闭锁卵泡中发现lncRNA NORHA影响GCs的凋亡过程[45]；lncRNA-Amhr2通过小鼠GCs中的Amhr2参与卵泡发育的调节[46]。本研究将lncRNA ENSBGRT00000000387.1过表达慢病毒载体感染牦牛GCs，发现其使GCs的凋亡率下降，且使CASPASE3和BAX蛋白水平均呈低表达，而BCL-2蛋白呈高表达，说明lncRNA ENSBGRT00000000387.1能抑制牦牛GCs的凋亡，提示它可能在牦牛卵巢卵泡功能中发挥作用，但其具体机制有待深入研究。
4 结论本研究成功构建了牦牛lncRNA ENSBGRT00000000387.1的过表达慢病毒载体，该载体感染牦牛GCs后可抑制细胞凋亡，为后续进一步探讨lncRNA ENSBGRT00000000387.1在牦牛卵泡中的生物学功能及其作用机制奠定了基础。
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(编辑 郭云雁)