畜牧兽医学报  2023, Vol. 54 Issue (3): 976-988. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2023.03.012    PDF    
引用本文
欧正淼, 周家文, 刘莉莉, 吴芸, 陈粉粉. 基于RNA-Seq的无量山乌骨鸡肝脏组织脂代谢相关基因筛选及其表达分析[J]. 畜牧兽医学报, 2023, 54(3): 976-988.  
OU Zhengmiao, ZHOU Jiawen, LIU Lili, WU Yun, CHEN Fenfen. Screening and Expression Analysis of Genes Related to Lipid Metabolism in Liver Tissue of Wuliangshan Sooty Chicken Based on RNA-Seq[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2023, 54(3): 976-988.  
基于RNA-Seq的无量山乌骨鸡肝脏组织脂代谢相关基因筛选及其表达分析
欧正淼1, 周家文2, 刘莉莉1, 吴芸3, 陈粉粉1     
1. 西南林业大学生命科学学院, 昆明 650224;
2. 南涧彝族自治县农业农村局无量山乌骨鸡产业发展服务中心, 南涧 675700;
3. 遵义师范学院生物与农业科技学院, 遵义 563006
收稿日期：2022-08-01
基金项目：国家自然科学基金(32060739)；云南省特色优势重点学科生物学一级学科建设项目(50097505)；贵州省教育厅特色领域项目(黔教合KY字[2019]076)
作者简介：欧正淼(1998-)，男，云南曲靖人，硕士生，主要从事家禽脂类代谢研究，E-mail: 2546670966@qq.com.
通信作者：陈粉粉, 主要从事畜禽脂肪沉积机理研究, E-mail: ffchen03@sina.com.
摘要：旨在通过分析不同日龄无量山乌骨鸡肝组织mRNA表达谱，挖掘肝脂代谢相关基因及其所参与的调控通路，并确定部分关键基因在肝发育中的表达特征。本研究采集1日龄(D1)和168日龄(D168)各3只母鸡肝组织样品，利用DNBSEQ平台进行转录组测序，随机选取10个差异表达基因进行RT-qPCR验证。以|log2FC|≥2、Q value≤0.01和差异基因KEGG分析筛选参与脂代谢的差异表达基因，对筛选出的脂代谢相关差异表达基因进行GO富集、KEGG通路和蛋白互作分析。100只雌性雏鸡以出壳体重组间无差异随机分为5组，每组20只鸡，在D1、D42、D84、D126和D168共5个阶段每组随机屠宰2只健康母鸡(n=10)，并提取肝组织RNA，RT-qPCR构建部分差异基因mRNA表达谱。结果，筛选出50个与脂代谢相关的差异表达基因，其中38个基因表达上调，12个基因表达下调。差异表达基因主要富集在脂质代谢、氧化还原、脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢、胆固醇生物合成和甾醇生物合成等过程；差异表达基因参与了类固醇生物合成、脂肪酸代谢、甘油脂类代谢、不饱和脂肪酸生物合成和PPAR信号通路。蛋白互作分析筛选出SCD、ACSBG2、SQLE、HSD17B7、LCAT和LPIN1等关键蛋白基因，通过其mRNA表达量不同参与脂代谢调控。通过转录组测序挖掘出与脂代谢相关的差异表达基因50个，且42个差异表达基因之间存在相互作用关系，该研究结果为进一步解析优质鸡脂代谢相关基因的分子调控提供了理论依据。
关键词：无量山乌骨鸡    RNA-Seq    肝组织    脂代谢    差异表达基因    
Screening and Expression Analysis of Genes Related to Lipid Metabolism in Liver Tissue of Wuliangshan Sooty Chicken Based on RNA-Seq
OU Zhengmiao1, ZHOU Jiawen2, LIU Lili1, WU Yun3, CHEN Fenfen1     
1. College of Life Science, Southwest Forest University, Kunming 650224, China;
2. Wuliangshan Sooty Chicken Industry Development Service Center of Nanjian Yi Autonomous County, Nanjian 675700, China;
3. School of Biology and Agricultural, Zunyi Normal University, Zunyi 563006, China
Corresponding author: CHEN Fenfen, E-mail: ffchen03@sina.com.
Abstract: This study was conducted to screen out and verify differentially expressed genes and their regulatory pathways related to lipid metabolism by analyzing mRNA expression profiles in liver tissues of Wuliangshan Sooty chicken at different ages, and to provide theoretical basis for determining the expression characteristics of genes related to lipid metabolism in liver tissues of Wuliangshan Sooty chicken. In this study, D1 and D168 liver tissues were sequenced by RNA-Seq technique, and there were 3 biological replicates in each stage, transcriptome sequencing using the DNBSEQ platform, 10 differentially expressed genes were randomly selected for RT-qPCR validation. The differential genes related to lipid metabolism were screened by |log2FC|≥2, Q value≤0.01 and KEGG pathways analysis. The differentially expressed genes of lipid metabolism were analyzed for GO enrichment, KEGG pathways, and protein interactions. A total of 100 female chicks were randomly divided into 5 groups with 20 chickens in each group. Two healthy hens were randomly slaughtered in each group at 5 stages (D1, D42, D84, D126, D168), and RNA was extracted from liver tissues. RT-qPCR was used to construct partial differential genes mRNA expression profiles. A total of 50 differentially expressed genes related to lipid metabolism were screened by transcriptome sequencing, among which 38 genes were up-regulated and 12 genes were down-regulated. The differentially expressed genes were mainly enriched in lipid metabolism, redox process, fatty acid biosynthesis, fatty acid metabolism, cholesterol biosynthesis and sterol biosynthesis. The differentially expressed genes were involved in steroid biosynthesis, fatty acid metabolism, glycerolipids metabolism, unsaturated fatty acid biosynthesis and PPAR signaling pathway. Key protein genes such as SCD, ACSBG2, SQLE, HSD17B7, LCAT and LPIN1 were screened out by protein interaction analysis, which were involved in the regulation of lipid metabolism through their mRNA expression levels. The 50 differentially expressed genes related to lipid metabolism were identified by transcriptome sequencing, and there are interactions among 42 differentially expressed genes. It provides a theoretical basis for further analysis of the molecular regulation of fat metabolism related genes in indigenous Chinese chicken.
Key words: Wuliangshan Sooty chicken    RNA-Seq    liver tissue    lipid metabolism    differentially expressed genes    

肝是家禽体内物质和能量代谢的重要器官，它在脂类合成、降解以及转运过程中发挥着重要作用[1]。脂类代谢及其调控机制的研究有助于揭示鸡肉质形成的分子基础。近年来，为改善鸡肉品质，国内外研究者通过高通量测序发现并验证了大量编码蛋白的功能基因和非编码RNAs，对揭示脂肪沉积机制起到了显著的推动作用[2-3]。

脂类代谢直接影响脂质生成并参与免疫调控，多个功能基因通过肝组织转录组测序被发现[4]。Xu等[5]对鸡出壳前后的肝组织进行转录组分析，发现肝在通过线粒体呼吸链为机体提供能量方面发挥着重要作用，同时也是抗氧化应激的重要组成部分，其在出壳后肝发育过程中其功能变化显著，这与鸡肝器官逐渐发育成熟有关。Ren等[6]通过对注射雌激素药物和正常饲喂的鸡肝组织进行转录组测序分析，发现雌激素可通过影响脂代谢基因表达水平调控鸡肝组织脂质代谢。Lan等[7]对3种不同品系的鸡在高温胁迫下的肝组织进行转录组测序，对差异表达基因进行GO富集和KEGG通路分析，最终确认血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4)是改善鸡耐热性的候选基因。Liu等[8]通过黄曲霉毒素B1 (aflatoxin B1, AFB1)诱导鸡肝凋亡和脂质代谢相关转录调控研究发现，肝脂质沉积主要是由PPAR信号通路、脂肪酸降解、脂肪酸代谢等参与调控脂质代谢的信号通路所调控。可见不同发育阶段或不同的生理条件影响了肝组织对脂类代谢调控作用的发挥。

无量山乌骨鸡是云南省的“六大名鸡”之一，为生产性能优良且肉质好的高海拔地区蛋肉兼用品种[9]，经过6个世代选育，在18周龄上市时，母鸡平均体重为1.5 kg，公鸡平均体重为2.0 kg[10]。李秋玉等[11]对无量山乌骨鸡胚胎期皮下脂肪沉积特点进行了研究，但目前还没有关于调控脂代谢分子机制的报道。本研究旨在构建出壳当日和产蛋初期不同日龄无量山乌骨鸡肝组织mRNA表达谱，通过生物信息学分析挖掘肝脂代谢相关基因及其所参与的调控通路，并确定部分关键基因在出壳当日(1日龄)、育雏结束(42日龄)、育成中期(84日龄)、育成结束(126日龄)和产蛋初期(168日龄)等5个发育阶段肝发育中的表达特征。研究结果将为无量山乌骨鸡脂代谢研究提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物和肝组织样品的采集

试验用无量山乌骨鸡母鸡鸡苗购自南涧县无量山乌骨鸡种鸡场，将雏鸡分成5组，每组20只进行饲养，所有鸡饲养条件一致，并按常规程序进行免疫。在1日龄(D1)、42日龄(D42)、84日龄(D84)、126日龄(D126)和168日龄(D168)时，经12 h禁食，每组随机选取2只健康鸡(n=10)，颈静脉放血法处死，采集肝组织，迅速放于液氮中，随后置于－80 ℃超低温冰箱中保存备用。试验中测序样品分别用D1和D168母鸡肝组织，每组样本3个生物学重复，分别命名为D1-L1、D1-L2、D1-L3和D168-L1、D168-L2、D168-L3；基因表达量检测每个时期10个生物学重复。本研究中动物试验遵循相关法律和准则进行，并经过西南林业大学伦理委员会批准(批准号：SWFU-2021019)。

1.2 主要试剂和仪器

RNAiso Plus、TB Green® Premix Ex TaqTM Ⅱ和PrimeScriptTM RT试剂盒均购自大连宝日医生物技术有限公司；三氯甲烷和无水乙醇等分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

全自动快速研磨仪(JXFSTPRP-64)购自上海净信实业发展有限公司；全自动立式压力蒸汽灭菌锅(SQ510C)购自雅马拓科技贸易(上海)有限公司；高速冷冻离心机(1-14K)购自sigma-aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；电子单通道移液器(FinnpipetteTM Novus)购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；凝胶成像系统(GelDoc XR+)和荧光定量PCR仪(CFX96TM)购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司；超微量紫外分光光度计(NanoVue plus)购自通用电气医疗系统贸易发展(上海)有限公司。

1.3 肝组织转录组测序

采用TRIzol试剂(宝生物工程有限公司，大连，中国)提取D1和D168无量山乌骨鸡肝组织的总RNA，对提取的总RNA进行质量检测。通过PCR扩增，对cDNA进行纯化和富集，构建肝组织的cDNA文库，由华大基因公司使用DNBSEQ平台进行测序构建mRNA表达谱。

1.4 转录组测序数据分析

将测序原始数据中包含的低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads去除。利用得到的clean reads，使用HISAT[12]软件将clean reads比对到NCBI数据库中版本号为GCF_000002315.6_GRCg6a鸡的参考基因组序列，同时使用Bowtie2[13]将clean reads比对到参考基因序列上，然后使用RSEM[14]计算各个肝组织样品的基因表达水平。

根据Love等[15]描述的方法通过DEseq2软件筛选出不同发育阶段肝组织差异表达基因，差异表达基因筛选条件为差异倍数|log2FC|≥2、显著性Q value (adjusted P value)≤0.01，使用R包pheatmap进行聚类分析并进行绘图。验证测序结果后，以|log2FC|≥2、Q value≤0.01和KEGG分析进一步确定脂代谢相关的差异表达基因。通过GO和KEGG注释的分类，使用R软件中的phyper函数对脂代谢相关的差异基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，计算出P值，然后对P值进行错误发现率(false discovery rate，FDR)的校正得到Q值，Q value≤0.05被视为显著富集。利用Cytoscape String App[16]软件对相关蛋白质进行网络互作分析。

1.5 RT-qPCR检测基因mRNA表达量

随机挑选出10个差异表达基因，通过实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR, RT-qPCR)进行测序结果验证；根据脂代谢相关差异表达基因的蛋白互作，挑选出6个关键节点基因进行mRNA表达量检测。以GenBank查找鸡(Gallus gallus)的差异表达基因序列为参照，通过Primer Premier 6.0软件对筛选出的差异基因进行定量扩增引物序列的设计，引物(表 1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将上述肝组织中提取质量合格的RNA，通过PrimeScriptTM RT试剂盒反转录得到cDNA，具体条件和方法参照李秋玉等[11]的报道。qPCR的扩增条件为：95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。

表 1 qPCR扩增引物序列 Table 1 Primer sequences of quantitative PCR amplification
1.6 统计学分析

利用Excel 2010对试验数据进行整理，2-ΔΔCt法对基因的相对表达量进行分析[17]，利用SPSS 21.0软件对数据进行单因素方差分析和独立样本t检验，采用GraphPad Prism 6.0进行图表绘制。结果以“平均数±标准误”表示，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。

2 结果 2.1 转录组测序数据质量分析

对D1和D168两个时期无量山乌骨鸡肝组织测序所得到的数据进行质控、数据过滤与参考基因组进行比对，并对其计算Q30值(正确率为99.9%)和碱基含量以确定测序数据是否适用于后续分析。测序质量结果(表 2)表明，原始读数在442 200 000~ 490 800 000之间，经过质控过滤后读数在403 000 000~ 453 200 000之间，过滤后碱基数稳定，其中Q20≥96.85%，Q30≥91.95%且过滤后的比对率高于85%，说明测序数据可靠，满足后续生物信息学分析的条件。

表 2 测序数据质量分析 Table 2 Sequencing data quality analysis
2.2 转录组测序差异表达基因分析

用DEseq2软件对D1和D168无量山乌骨鸡肝组织转录组测序数据进行差异表达基因的筛选，筛选条件为|log2FC|≥2、Q value≤0.01。发现共有1 404个差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，其中表达上调的基因有790个，表达下调的基因有614个(图 1)。

图 1 差异表达基因火山图 Fig. 1 Volcano map of differentially expressed genes
2.3 差异表达基因的RT-qPCR验证

随机选取10个差异表达基因进行RT-qPCR验证，结果如图 2所示，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2(UDP-glucose pyrophosphorylase 2, UGP2)、脂肪酸去饱和酶2(fatty acid desaturase 2, FADS2)、细胞色素P450家族2亚家族C成员18(cytochrome P450 family 2 subfamily C member 18, CYP2C18)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase 3, GPX3)和乙醇脱氢酶1 C(alcohol dehydrogenase 1C, ADH1C)在肝组织中显著上调，丝氨酸羟甲基转移酶1(serine hydroxymethyltransferase 1, SHMT1)、苹果酸脱氢酶2 (malate dehydrogenase 2，MDH2)、细胞色素P450家族8亚家族B成员1 (cytochrome P450 family 8 subfamily B member 1, CYP8B1)、乙醇胺磷酸裂解酶(ethanolamine-phosphate phospho-lyase，ETNPPL)和3-羟基-3-甲基戊二酰裂解酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase, HMGCL)在肝组织中显著下调。10个基因在鸡肝不同发育阶段(D168-L vs. D1-L)表达趋势与测序结果相符，表明转录组测序结果可靠。

*表示差异显著(P < 0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01) * indicate significant difference (P < 0.05), ** indicate extremely significant difference (P < 0.01) 图 2 差异表达基因real-time qPCR验证 Fig. 2 Real-time qPCR validation for differentially expressed genes
2.4 脂代谢差异基因的筛选

将1 404个差异表达基因进行KEGG Pathway的分类(图 3)，这些基因富集到6个生物过程的44个通路。其中，参与环境信息过程的信号转导通路富集的基因最多，机体系统中免疫系统富集的差异基因次之，而代谢通路中脂代谢为富集差异基因数目最多的通路，共有50个差异基因参与脂代谢。对这50个差异表达基因进行聚类分析结果表明，表达上调的基因38个，表达下调的基因12个(图 4)。

图 3 差异表达基因分类图 Fig. 3 Classification of differentially expressed genes
图 4 脂代谢差异表达基因表达量聚类热图 Fig. 4 Cluster heat map of expression levels of differentially expressed genes related to lipid metabolism
2.5 脂代谢差异表达基因GO和KEGG分析

对差异表达的50个脂代谢相关基因进行GO和KEGG功能富集分析。显著富集到细胞组分7个、分子功能6个和生物过程16个的GO条目共29个(图 5)。KEGG通路分析(表 3)结果表明，类固醇生物合成、脂肪酸代谢、甘油脂类代谢、不饱和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢、甾类激素生物合成等16条通路被显著富集。

BP、CC、MF分别代表生物过程、细胞组分、分子功能 BP, CC, MF represent biological processes, cellular components, molecular functions, respectively 图 5 脂代谢相关差异表达基因GO富集 Fig. 5 GO enrichment analysis of differentially expressed genes related to lipid metabolism
表 3 脂代谢相关的候选信号通路及基因 Table 3 Signaling pathways and genes related to lipid metabolism
2.6 脂代谢相关差异表达基因蛋白互作分析

构建肝组织中脂代谢相关差异表达基因的蛋白网络互作图，能够直接展现出D1和D168的无量山乌骨鸡肝组织中脂代谢相关差异表达基因之间的互作关系(图 6)。本研究中网络互作图由节点(node)和连线(edge)组成，节点代表差异表达基因，其中节点越大表示该基因越关键[18-19]。在蛋白网络互作图中发现，与脂代谢相关差异表达的基因中有42个基因之间存在相互作用关系，其中33个上调基因，9个下调基因。

节点代表差异表达基因，黄色代表上调，白色代表下调 The nodes represent differentially expressed genes, yellow means up-regulation and white means down-regulation 图 6 脂代谢相关差异表达基因蛋白互作网络 Fig. 6 Proteins interaction network of differentially expressed genes related to lipid metabolism
2.7 差异表达基因mRNA表达量分析

对不同生长发育时期无量山乌骨鸡肝组织中显著富集在不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢、PPAR通路、甘油磷脂代谢、胆固醇代谢和类固醇生物合成等KEGG信号通路的部分差异表达基因的mRNA表达量进行分析，结果显示(图 7)，显著富集在不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢、PPAR通路的SCD(图 7A)和ACSBG2(图 7D)mRNA表达量都持续上调。显著富集在甘油磷脂代谢通路的LPIN1(图 7B)和LCAT(图 7E)mRNA表达量均为D1高表达，之后持续下调至D168表达量最低。显著富集在类固醇生物合成通路的SQLE(图 7C) 和HSD17B7(图 7F)mRNA表达量D168较D1上调，但在发育过程中表达规律不同，SQLE mRNA表达量表现为显著上调再下调后至D168达到峰值，而HSD17B7 mRNA表达量在D84达到峰值，表明此类基因在不同发育阶段存在转录表达差异。

小写字母不同表示差异显著(P < 0.05) Different lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05) 图 7 不同日龄差异表达基因mRNA表达量 Fig. 7 mRNA relative expression of differentially expressed genes at different ages
3 讨论

家禽肝组织是脂质分解和合成的重要器官，是脂代谢的重要场所，鸡的脂代谢特点与肝发育有直接联系，脂类合成和分解产物直接影响鸡只健康和肉品质的优劣。转录组测序被用做脂代谢基因筛选，已在罗斯308肉鸡、卢氏绿壳蛋鸡和杏花鸡等商业、培育和地方鸡品种肝组织中广泛应用，以揭示差异表达基因及其对鸡生产性能等的影响[20-22]。本研究通过建立的mRNA表达谱，筛选出D1与D168的脂代谢差异基因50个，其中上调基因38个，下调基因12个。李红[20]对卢氏绿壳蛋鸡产蛋前期与产蛋高峰期肝脂代谢差异基因的研究结果表明，产蛋前期与产蛋高峰期肝脂代谢的差异基因有161个，76个上调基因和85个下调基因。蒋可人[23]对20和30周龄产蛋鸡肝组织进行测序，确定两个时期的差异基因有123个，其中显著上调基因99个，显著下调基因24个；差异基因中筛选出的与脂代谢相关的基因包括DHCR24、DHCR7、AACS、CYP51A1、MSMO1、FDFT1、NSDHL、LSS、甲羟戊酸脱羧酶(mevalonate decarboxylase, MVD)、HMGCR等。本试验筛选出的50个差异基因与上述基因有部分吻合，表明参与脂代谢的基因在不同生理阶段、不同品种的鸡肝组织中存在差异。

本研究中50个差异基因富集到的GO条目分别为细胞组分中7个，分子功能中6个和生物过程中16个，富集到的KEGG信号通路共16条。潘璐[24]研究发酵中草药对产蛋后期蛋鸡肝脂代谢的影响时，对筛选出肝脂代谢的1 039个差异基因进行GO和KEGG分析，得到差异基因富集到的GO条目分别为生物学过程中的脂肪酸分解代谢过程、细胞脂质分解代谢过程、脂质分解代谢过程，分子功能中的生长因子结合等条目；细胞组分中的膜条目，还有与脂质生物合成、甘油脂代谢、磷脂代谢过程等脂代谢相关的条目。富集到KEGG的信号通路有脂肪酸代谢、PPAR信号通路、脂肪酸降解、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪细胞因子信号通路、甘油脂代谢、类固醇生物合成、甘油磷脂代谢及脂肪酸生物合成通路等。本试验中，GO和KEGG富集到的条目和信号通路与上述产蛋后期蛋鸡肝脂代谢相关基因富集到的GO条目和KEGG信号通路相似程度较高，表明处于不同生长发育阶段的鸡肝脂代谢基因参与的脂代谢途径存在相似性。

家禽脂代谢调控是由多个信号通路参与的网络调控系统，而PPAR信号通路在脂类代谢中发挥着至关重要的作用[25]。本研究中，SCD、LPL、ACSBG2、FADS2和CYP8B1等5个基因被显著富集到PPAR信号通路。其中SCD、LPL和FADS2均在肝或脂肪组织转录组测序中被发现并报道[24, 26]。ACSBG2是一种酰基辅酶a合成酶，能激活脂肪酸生成辅酶a衍生物，在脂肪酸代谢中起着重要作用[27]。Xing等[28]通过转录组学对鸡肝发育中的调控基因及其与腹部脂肪重量相关性的研究中发现，ACSBG2参与脂肪酸代谢、脂肪酸降解、脂肪细胞因子信号转导和PPAR信号转导等。本研究发现，ACSBG2基因不仅显著富集到PPAR信号通路还参与了脂肪酸代谢，而且肝组织中ACSBG2 mRNA表达量随着日龄的增加呈上升趋势，表明ACSBG2对无量山乌骨鸡肝脂代谢有调控作用。CYP8B1是合成胆汁酸的关键酶，通过胆汁酸促进脂质吸收和激活胆汁酸受体的双重能力来调节脂质代谢。研究发现，CYP8B1能够促进小鼠膳食中脂肪的吸收，而在敲除CYP8B1基因的小鼠中，胆固醇分解代谢增加和胆固醇吸收减少能够促使动脉粥样硬化和胆结石形成减少[29-31]。本研究中，通过差异表达基因的KEGG富集分析表明CYP8B1主要显著富集于初级胆汁酸合成和PPAR信号通路中，是促进胆汁酸合成和参与脂质代谢的重要基因。

结合差异基因蛋白互作及GO富集和KEGG通路分析发现，多个差异表达基因参与类固醇生物合成代谢通路、胆固醇代谢通路和甘油磷脂代谢通路。其中，SQLE是参与固醇合成途径的关键酶，增加SQLE的表达能够促进鸡肝细胞内甘油三酯和胆固醇的合成，进而促进脂质的合成[32-33]。HSD17B7是羟基类固醇脱氢酶家族成员，并且在胆固醇的合成中发挥作用[34]。结合本研究结果推测，SQLE和HSD17B7通过影响细胞膜的形成，从而对鸡肝脂质合成有调控作用。同时，本研究KEGG通路分析发现，LCAT参与了胆固醇代谢通路，LCAT是一种催化胆固醇逆转运(reverse cholesterol transport, RCT) 的关键酶，对维持细胞内胆固醇稳态具有重要作用，其主要功能是胆固醇的酯化作用[35-36]。Hengstschläger-Ottnad等[35]通过在母鸡肝中对LCAT mRNA表达模式的研究，发现其在胚胎期肝中表达量最高，在母鸡产蛋期(20~24周龄)肝中LCAT几乎不表达。在母鸡体内，LCAT生成的胆固醇酯的逆向运输不仅只是在肝中，在卵巢中也发挥重要作用，对卵母细胞的正常发育尤为重要[35]。本研究结果表明，肝组织中LCAT mRNA的表达量在D1时显著高于D168(P＜0.05)，因此推断在无量山乌骨鸡母鸡产蛋期LCAT有可能在卵巢中对RCT发挥作用。而对表达量下调最多的基因LPIN1分析发现，LPIN1富集在脂肪酸分解代谢过程，参与甘油磷脂代谢通路。LPIN1是一种Mg2+依赖性的磷脂酸磷酸酶，对催化合成甘油三酯和磷脂发挥关键作用，是脂代谢的重要调节因子[37]。Van Harmelen等[38]发现, 人体脂肪组织中LPIN1 mRNA的表达量与脂肪沉积量呈负相关，且随着肥胖程度的增加脂肪组织中LPIN1 mRNA的表达量呈下降趋势，与本研究中无量山乌骨鸡生长发育时期肝组织中LPIN1 mRNA的表达量趋势一致，推测LPIN1对鸡肝组织内脂质沉积起负调控作用。

4 结论

本研究通过RNA-Seq技术对D1和D168的无量山乌骨鸡肝组织进行测序分析，筛选出50个与脂代谢相关的差异表达基因。通过对差异表达基因的GO富集、KEGG通路分析和编码蛋白基因互作分析，确定42个差异表达基因之间存在相互作用关系，SCD、ACSBG2、SQLE、HSD17B7、LCAT和LPIN1等可能是影响鸡肝脂代谢的候选基因。这些结果为无量山乌骨鸡肝脂代谢相关基因及其分子调控机制研究提供了理论依据。

参考文献
[1]
TAN W B, ZHENG H, WANG D D, et al. Expression characteristics and regulatory mechanism of Apela gene in liver of chicken (Gallus gallus)[J]. PLoS One, 2020, 15(9): e0238784. DOI:10.1371/journal.pone.0238784
[2]
ZHANG H, DU Z Q, DONG J Q, et al. Detection of genome-wide copy number variations in two chicken lines divergently selected for abdominal fat content[J]. BMC Genomics, 2014, 15: 517. DOI:10.1186/1471-2164-15-517
[3]
LORENZETTI A S, DOMINI C E, LISTA A G. A simple and new reverse liquid-liquid microextraction for the automated spectrometric determination of doxycycline in chicken fat[J]. Food Chem, 2017, 237: 506-510. DOI:10.1016/j.foodchem.2017.05.132
[4]
ZHANG Y H, GUO F, NI Y D, et al. LPS-induced inflammation in the chicken is associated with CCAAT/enhancer binding protein beta-mediated fat mass and obesity associated gene down-regulation in the liver but not hypothalamus[J]. BMC Vet Res, 2013, 9: 257. DOI:10.1186/1746-6148-9-257
[5]
XU E, ZHANG L, YANG H, et al. Transcriptome profiling of the liver among the prenatal and postnatal stages in chickens[J]. Poult Sci, 2019, 98(12): 7030-7040. DOI:10.3382/ps/pez434
[6]
REN J X, TIAN W H, JIANG K R, et al. Global investigation of estrogen-responsive genes regulating lipid metabolism in the liver of laying hens[J]. BMC Genomics, 2021, 22(1): 428. DOI:10.1186/s12864-021-07679-y
[7]
LAN X, HSIEH J C F, SCHMIDT C J, et al. Liver transcriptome response to hyperthermic stress in three distinct chicken lines[J]. BMC Genomics, 2016, 17(1): 955. DOI:10.1186/s12864-016-3291-0
[8]
LIU X Q, KUMAR MISHRA S, WANG T, et al. AFB1 induced transcriptional regulation related to apoptosis and lipid metabolism in liver of chicken[J]. Toxins (Basel), 2020, 12(5): 290. DOI:10.3390/toxins12050290
[9]
杨丕才, 曹海月, 张忠新, 等. 无量山乌骨鸡肉质性状及养分含量的性别差异分析[J]. 中国畜牧杂志, 2021, 57(2): 80-83.
YANG P C, CAO H Y, ZHANG Z X, et al. Sex difference analysis of meat quality traits and nutrient contents in Wuliangshan Sooty chicken[J]. Chinese Journal of Animal Science, 2021, 57(2): 80-83. DOI:10.19556/j.0258-7033.20200502-04 (in Chinese)
[10]
OU Z M, SHI Y Y, LI Q Q, et al. Effects of sex on the muscle development and meat composition in Wuliangshan black-bone chickens[J]. Animals (Basel), 2022, 12(19): 2565.
[11]
李秋玉, 郭爱伟, 吴芸, 等. 无量山乌骨鸡胚胎期脂肪组织发育特征分析[J]. 中国家禽, 2021, 43(9): 17-22.
LI Q Y, GUO A W, WU Y, et al. Developmental characteristics of adipose tissue in the embryonic of Wuliangshan Sooty chicken[J]. China Poultry, 2021, 43(9): 17-22. DOI:10.16372/j.issn.1004-6364.2021.09.004 (in Chinese)
[12]
KIM D, LANGMEAD B, SALZBERG S L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements[J]. Nat Methods, 2015, 12(4): 357-360. DOI:10.1038/nmeth.3317
[13]
LANGMEAD B, SALZBERG S L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2[J]. Nat Methods, 2012, 9(4): 357-359. DOI:10.1038/nmeth.1923
[14]
LI B, DEWEY C N. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMC Bioinformatics, 2011, 12: 323. DOI:10.1186/1471-2105-12-323
[15]
LOVE M I, HUBER W, ANDERS S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2[J]. Genome Biol, 2014, 15(12): 550. DOI:10.1186/s13059-014-0550-8
[16]
DONCHEVA N T, MORRIS J H, GORODKIN J, et al. Cytoscape stringapp: Network analysis and visualization of proteomics data[J]. J Proteome Res, 2019, 18(2): 623-632. DOI:10.1021/acs.jproteome.8b00702
[17]
LI A, HUANG W L, ZHANG X X, et al. Identification and characterization of circRNAs of two pig breeds as a new biomarker in metabolism-related diseases[J]. Cell Physiol Biochem, 2018, 47(6): 2458-2470. DOI:10.1159/000491619
[18]
CHEN S J, LIAO D L, CHEN C H, et al. Construction and analysis of protein-protein interaction network of heroin use disorder[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 4980. DOI:10.1038/s41598-019-41552-z
[19]
MO X Q, SU Z X, YANG B S, et al. Identification of key genes involved in the development and progression of early-onset colorectal cancer by co-expression network analysis[J]. Oncol Lett, 2020, 19(1): 177-186.
[20]
李红. 转录组分析揭示鸡产蛋期肝脏脂质代谢调控的分子机制[D]. 郑州: 河南农业大学, 2016.
LI H. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanism of hepatic lipid metabolism regulation in egg-laying hen[D]. Zhengzhou: Henan Agricultural University, 2016. (in Chinese)
[21]
PIRANY N, BAKRANI BALANI A, HASSANPOUR H, et al. Differential expression of genes implicated in liver lipid metabolism in broiler chickens differing in weight[J]. Br Poult Sci, 2020, 61(1): 10-16. DOI:10.1080/00071668.2019.1680802
[22]
陈家辉, 任学义, 李丽敏, 等. 转录组测序揭示细胞周期通路参与鸡腹脂沉积[J]. 遗传, 2019, 41(10): 962-973.
CHEN J H, REN X Y, LI L M, et al. The cell cycle pathway regulates chicken abdominal fat deposition as revealed by transcriptome sequencing[J]. Hereditas, 2019, 41(10): 962-973. DOI:10.16288/j.yczz.19-098 (in Chinese)
[23]
蒋可人. RNA-seq与ChIP-seq整合分析揭示雌激素调控鸡肝脏脂质代谢的分子机制[D]. 郑州: 河南农业大学, 2021.
JIANG K R. RNA-seq and ChIP-seq integrative analvsis reveals the molecular mechanism of estrogen regulating liver lipid metabolism in chickens[D]. Zhengzhou: Henan Agricultural University, 2021. (in Chinese)
[24]
潘璐. 利用转录组测序技术分析发酵中草药对蛋鸡产蛋后期肝脏脂代谢的影响[D]. 乌鲁木齐: 新疆农业大学, 2021.
PAN L. Using transcriptome sequencing technology to analyze the effect of fermented Chinese herbal medicine on liver lipid metabolism in late laying hens[D]. Urumqi: Xinjiang Agricultural University, 2021. (in Chinese)
[25]
CHEN Z Z, XING Y, FAN X, et al. Fasting and refeeding affect the goose liver transcriptome mainly through the PPAR signaling pathway[J]. J Poult Sci, 2021, 58(4): 245-257. DOI:10.2141/jpsa.0200095
[26]
刘天义, 冯卉, YOUSUF S, 等. 多浪羊与小尾寒羊皮下脂肪组织转录组分析[J]. 畜牧兽医学报, 2021, 52(12): 3403-3412.
LIU T Y, FENG H, YOUSUF S, et al. Transcriptome analysis of subcutaneous adipose tissue of duolang sheep and small tail han sheep[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2021, 52(12): 3403-3412. DOI:10.11843/j.issn.0366-6964.2021.012.008 (in Chinese)
[27]
LI G X, CHEN Y, JIN W J, et al. Effects of miR-125b-5p on preadipocyte proliferation and differentiation in chicken[J]. Mol Biol Rep, 2021, 48(1): 491-502. DOI:10.1007/s11033-020-06080-4
[28]
XING S Y, LIU R R, ZHAO G P, et al. Time course transcriptomic study reveals the gene regulation during liver development and the correlation with abdominal fat weight in chicken[J]. Front Genet, 2021, 12: 723519. DOI:10.3389/fgene.2021.723519
[29]
BERTAGGIA E, JENSEN K K, CASTRO-PEREZ J, et al. Cyp8b1 ablation prevents Western diet-induced weight gain and hepatic steatosis because of impaired fat absorption[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2017, 313(2): E121-E133. DOI:10.1152/ajpendo.00409.2016
[30]
WANG D Q, LAMMERT F, COHEN D E, et al. Cholic acid aids absorption, biliary secretion, and phase transitions of cholesterol in murine cholelithogenesis[J]. Am J Physiol, 1999, 276(3): G751-G760.
[31]
WANG J, GÅFVELS M, RUDLING M, et al. Critical role of cholic acid for development of hypercholesterolemia and gallstones in diabetic mice[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 342(4): 1382-1388. DOI:10.1016/j.bbrc.2006.02.108
[32]
ZHANG D D, WANG D D, WANG Z, et al. Estrogen abolishes the repression role of gga-miR-221-5p targeting ELOVL6 and SQLE to promote lipid synthesis in chicken liver[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(5): 1624. DOI:10.3390/ijms21051624
[33]
LORBEK G, PERŠE M, HORVAT S, et al. Sex differences in the hepatic cholesterol sensing mechanisms in mice[J]. Molecules, 2013, 18(9): 11067-11085. DOI:10.3390/molecules180911067
[34]
WANG D, LI Y, ZHAI Q Q, et al. Quercetin ameliorates testosterone secretion disorder by inhibiting endoplasmic reticulum stress through the miR-1306-5p/HSD17B7 axis in diabetic rats[J]. Bosn J Basic Med Sci, 2022, 22(2): 191-204.
[35]
HENGSTSCHLÄGER-OTTNAD E, KUCHLER K, SCHNEIDER W J. Chicken lecithin-cholesterol acyltransferase.Molecular characterization reveals unusual structure and expression pattern[J]. J Biol Chem, 1995, 270(44): 26139-26145. DOI:10.1074/jbc.270.44.26139
[36]
YANG K X, WANG J M, XIANG H J, et al. LCAT- targeted therapies: Progress, failures and future[J]. Biomed Pharmacother, 2022, 147: 112677.
[37]
KIM J Y, KIM G, LIM S C, et al. IL-33-induced transcriptional activation of LPIN1 accelerates breast tumorigenesis[J]. Cancers (Basel), 2021, 13(9): 2174.
[38]
VAN HARMELEN V, RYDÉN M, SJÖLIN E, et al. A role of lipin in human obesity and insulin resistance: relation to adipocyte glucose transport and GLUT4 expression[J]. J Lipid Res, 2007, 48(1): 201-206.

(编辑   郭云雁)