猪圆环病毒2型(PCV2)是二十面体、无包膜的环状单链DNA病毒，直径17 nm，是迄今为止世界上发现最小的动物病毒之一[1]。PCV2是引起猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease，PCVAD)的主要病原体[2-4]。该病毒优先靶向淋巴组织，导致猪发生淋巴衰竭和免疫抑制。不同年龄段和不同猪群都易感染PCV2，临床症状的表现方式有多种[5-6]，包括断奶后多系统衰竭综合征、猪皮炎和肾病综合征、猪呼吸系统疾病综合征、母猪繁殖障碍、肠炎或这些疾病的组合等[7]，严重影响了养猪业的健康发展。
CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated sequence)即规律成簇的间隔短回文重复序列，是当前应用极为广泛的基因编辑工具之一，其中普遍应用的CRISPR/Cas9是II型CRISPR/Cas系统[8-10]。现在广泛应用的CRISPR/Cas9系统由两部分组成，一部分是小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)；另一部分则是Cas9蛋白(一种核酸内切酶)[11]。这个系统根据原间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)设计一段由20~24个碱基对组成的sgRNA序列，sgRNA识别并结合到靶基因序列上，Cas9对靶序列进行切割，自身修复系统修复被切割的DNA序列[12]，进而引起基因组DNA发生缺失、插入或移码突变等，对目的基因进行有效的编辑[13]。
甘露糖受体是一种循环内吞受体，具有多种功能，包括清除内源性分子，促进抗原呈递，调节细胞活化和运输等[14-17]。甘露糖受体C1基因(CD206/MRC1)是甘露糖受体家族的同名成员，猪MRC1基因位于10号常染色体上，由118 809个碱基对组成，包含30个外显子，编码由1 455个氨基酸组成的蛋白质，大小约为175 ku[18-21]。在哺乳动物中，MRC1是一种多功能分子，作为一种病原体相关的识别受体，它可以摄取并呈递抗原，在先天性和获得性免疫反应中起关键作用，同时它也具有清除激素和调节细胞因子水平的作用[7]。实验室前期研究发现，我国优良地方品种莱芜猪相较于商品猪具有抗PCV2的优势。而且猪MRC1基因转录起始位点上游-864 bp位点处存在14 bp的片段插入或缺失的多态，14 bp片段的插入可以显著提高启动子区活性。在不同猪品种间，14 bp片段纯合子的基因型频率不同，莱芜猪高于西方猪种，这种差异与猪抗PCV2感染有关[22-27]。
本研究成功构建pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体和稳定表达该载体的细胞株；同时在该载体上插入MRC1基因同源臂构建同源重组载体，利用CRISPR/Cas9系统将莱芜猪MRC1基因转录起始位点上游的14 bp敲入到PK15细胞MRC1基因的相同位置处，增加了PK15细胞中MRC1蛋白表达量，并提高了抗PCV2的能力，利用Cre-LoxP系统删除CRISPR/Cas9介导的基因编辑中的筛选标记基因，降低外源基因插入导致的生物安全风险。
1 材料与方法 1.1 试验中的材料及来源载体：PLV-mCherry(Cat：36084)、pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)(Cat：62988)、psPAX2(Cat：12260)、pCMV-VSV-G(Cat：8454)、LentiCRISPR V2(Cat：52961)购于Addgene公司，Cre质粒来自石河子大学。
菌株：DH5α感受态购于康为世纪。
猪肾细胞系(PK15)由山东农业大学动物临床病理学研究室惠赠。人肾上皮细胞系(293T)由山东农业大学动物分子病原实验室惠赠。PCV2-SD毒株由山东农业大学动物科技学院动物分子病原学实验室分离馈赠。
1.2 主要试剂与仪器Kpn Ⅰ、Fse Ⅰ、Cla Ⅰ、Sal Ⅰ、Xho Ⅰ、Spe Ⅰ、Eco47 Ⅲ、Bsp 119Ⅰ购于ThermoFisher，Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)试剂、SDS-PAGE电泳液(Tris-Gly, Power)、BeyoGel Plus PAGE预制胶、Western及IP细胞裂解液、α-Tubulin Rabbbit Polyclonal Antibody、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购于碧云天生物公司(Beyotime，Shanghai)，通用型抗体稀释液、快速转膜液(20×)、快速封闭液、Protein ladder购于新赛美生物公司(Suzhou，JiangSu)，Mannose Receptor/CD206 Rabbit pAb购于Abclonal公司，Porcine circovirous type 2/PCV2 replicase antibody购于GeneTex公司，Lipofectamine 3000购于美国Invitrogen公司。
BD LSRFortessa流式细胞分析仪购于美国BD公司，稳压电泳仪JY600C、凝胶成像系统购于北京君意东方电泳设备有限公司，水平摇床WD-9405B型购于沃德生物医学仪器公司，移液器、Mastercycler gradient PCR仪、台式离心机L-13型购于Eppendorf公司。
1.3 方法1.3.1 pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体的构建 以pLV-mCherry载体为模板扩增CMV-mCherry片段，连接到pSpCas9(BB)-2A-Puro载体中，将其命名为pSpCas9(BB)-2A-Puro-mCherry。pSpCas9(BB)-2A-Puro-mCherry载体为模板扩增CMV-mCherry-NLS-T2A-puro片段，两端加上同向LoxP片段，构成LoxP-mCherry-puro-LoxP片段。
根据pLV-mCherry载体序列和LoxP-mCherry- puro-LoxP片段序列利用Primer Premier 5软件设计出含有12个限制性内切酶位点(Cla Ⅰ，Nhe Ⅰ，Bsp 119Ⅰ，Bcl Ⅰ，Spe Ⅰ，PspOM Ⅰ，Xho Ⅰ，Nde Ⅰ，Apa Ⅰ，Eco47 Ⅲ，Nsi Ⅰ，Sal Ⅰ)的多克隆位点，将其连接到pLV-mCherry载体中，构成新的载体命名为pLV-mCherry-MCS，最后将LoxP-mCherry-puro-LoxP片段插入到该载体多克隆位点中，构成pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体(载体构建流程见图 1，具体引物见表 1)。
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图 1 载体构建流程 Fig. 1 Vector construction process |
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表 1 引物列表 Table 1 The primers sequence |
1.3.2 pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体慢病毒包装及浓缩纯化 将目的质粒与慢病毒包装辅助质粒psPAX2和pCMV-VSV-G共转染293T细胞，转染48 h后收取细胞上清液放入-80 ℃冰箱保存，培养皿中重新加入10 mL无双抗培养基继续培养，转染96 h后收取细胞和细胞上清液放入-80 ℃冰箱保存。将收集的细胞和细胞上清液反复冻融3次。用0.22 μm滤器过滤，并且每30 mL液体加入7.5 mL的5×PEG8000。放入4 ℃，每20~30 min颠倒混匀一次，共做3~5次，4 ℃过夜放置。4 ℃，10 000 r·min-1离心1 h。弃上清，加适量PBS吹打混匀，分装放于-80 ℃保存(避免反复冻融)。
1.3.3 慢病毒滴度及MOI值测定 将生长良好的293T细胞消化，转至96孔板培养，使每孔细胞大约为1×104。对慢病毒进行10倍梯度稀释。准备8个1.5 mL离心管，做好标号在每个离心管中加入90 μL无双抗培养基，在第一个管中加入10 μL慢病毒液，吹打混匀后，取10 μL加入第二个管中，以此类推，做3组重复。弃掉板中原有培养基，缓慢加入稀释好的慢病毒液，注意不要将细胞吹起。24 h后，再加入100 μL无双抗培养基，72 h后观察每孔细胞荧光数。病毒滴度(TU·mL-1)=细胞数×荧光百分比×103/病毒原液体积(μL)。将PK15细胞转至96孔板培养，使每孔细胞大约为1×104。分别设置3个不同梯度的MOI值(1、10、40)进行感染。根据MOI值计算每孔需要加入的病毒量，每孔病毒量(μL)=MOI×细胞数/病毒滴度(TU·mL-1)×103。感染24 h后更换为新鲜的完全培养基继续培养，感染72~96 h后观察细胞中红光的表达情况，确定最适MOI值。
1.3.4 pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP稳转株构建 试验前1 d将PK15细胞转至24孔板培养。感染前将慢病毒从-80 ℃冰箱中拿出，放在冰上融化。弃掉原有培养基，PBS清洗两遍，加入500 μL无双抗培养基，根据最适MOI值加入适当慢病毒。观察细胞状态24 h后更换新鲜培养基，等细胞长满后传到6孔板中培养，之后再传至10 cm培养皿中培养，待细胞长至70%左右，用含有适当嘌呤霉素的培养基进行筛选。当形成单克隆细胞且单克隆细胞团较大时，挑取单克隆细胞。扩大培养后进行验证，并将其命名为PK15-mCherry细胞。
1.3.5 MRC1同源重组载体构建 根据NCBI官网上猪MRC1基因序列和实验室前期研究的启动子差异序列设计同源臂，以莱芜猪基因组为模板分别扩增长臂和短臂片段(引物见表 1)，连接到pLV-LoxP-mCherry -puro-LoxP载体的多克隆位点中，构建完整的同源重组载体，命名为pLV-LA-LoxP-mCherry-puro-LoxP-SA。
1.3.6 靶向载体构建 根据猪MRC1基因启动子区的差异，将长臂差异区域和短臂作为打靶区域，利用CRISPR RGEN Tools和E-CRISPR网站对打靶区域进行评分，从候选序列中选择6个合适的向导RNA(sgRNA)分别命名为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5、sgRNA6(其中前3个是长臂的打靶位点，后3个是短臂打靶位点)，在sgRNA上添加BsmB I酶切位点同源序列，将该序列以引物形式发往公司合成，sgRNA序列见表 2，将正、反序列用Annealing Buffer for DNA Oligos试剂进行退火。连接到BsmB I酶切后的LentiCRISPR v2载体中。
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表 2 sgRNA序列 Table 2 The sequence of sgRNA |
1.3.7 靶向载体切割效率验证 将构建好的打靶载体进行慢病毒包装及浓缩纯化，分别感染PK15细胞，之后用含有适当浓度的嘌呤霉素培养基进行筛选，在细胞长满后提取细胞基因组，跨打靶位点设计引物进行扩增(引物见表 1)，胶回收目的片段，加入NEB Buffer 2退火(95 ℃ 5 min，每90 s下降1 ℃，降温到25 ℃)，产物中加入0.5 μL T7E1酶，37 ℃反应30 min，反应结束后，将酶切产物用2%凝胶进行分析。
1.3.8 单克隆细胞的获得与鉴定 将同源重组载体和两个靶向载体分别进行慢病毒包装，共感染PK15细胞，加入含有适当嘌呤霉素的培养基进行筛选，挑取单克隆细胞，提取单克隆细胞基因组，进行PCR扩增和测序验证是否准确敲入(引物见表 1，引物位置见图 2)。
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图 2 引物的位置 Fig. 2 The location of primers |
1.3.9 Cre/LoxP系统验证 将阳性克隆细胞铺于24孔板培养，转染Cre质粒。将PK15细胞、阳性克隆细胞、转染Cre质粒的阳性克隆细胞用胰酶消化下来，制成细胞悬液，用一次性筛网过滤，上机进行流式细胞验证。
1.3.10 Western blotting分析 将PK15细胞和阳性克隆细胞分别铺于24孔板中，接种PCV2病毒原液300 μL，孵育1 h后，更换含2% FBS的维持培养基培养，48 h后提取细胞蛋白。每孔细胞加入60 μL细胞裂解液，室温静置5 min。用枪头将24孔板中细胞刮下，加入离心管中，4 ℃，12 000 r·min-1离心5 min。将上清加入新离心管中，加入适当蛋白上样缓冲液，100 ℃，10 min。加入蛋白样品以及蛋白Marker，110 V，200 mA进行电泳，当蛋白跑完至底时，停止电泳。而后进行转膜，设置电压200 V，电流400 mA，进行快速转膜。将膜放入快速封闭液中，水平摇床上封闭10 min。用TBST洗膜3次，在水平摇床上快摇，每次10 min。将膜放入一抗(1∶1 000稀释)中4 ℃过夜孵育。用TBST洗膜3次，在水平摇床上快摇，每次10 min。将膜放入二抗(1∶1 000稀释)中，水平摇床慢摇90 min。洗膜3次，显影。根据蛋白条带，用分析软件Image J对条带灰度值进行分析，从而计算出相对表达量。
1.3.11 PCV2病毒拷贝数测定 将PK15细胞和阳性克隆细胞分别铺于24孔板中，待细胞长至70%左右，接种PCV2原液300 μL，培养箱中孵育1 h后，更换含2% FBS的维持培养基，培养48 h后收集细胞，将细胞放入-80 ℃冰箱中，在-80 ℃与4 ℃冰箱中反复冻融3次，提取细胞病毒基因组，通过qRT-PCR测定PCV2病毒拷贝数(引物见表 1)。
1.3.12 数据分析 该研究中的试验均为3次重复试验，试验数据均以“Mean±SD”的形式呈现。采用单尾检测的方法统计其差异性。
2 结果 2.1 载体构建及验证以pLV-mCherry载体为骨架，插入多克隆位点、嘌呤霉素抗性基因以及同向的LoxP序列构成pLV- LoxP-mCherry-puro-LoxP载体，pLV-LoxP- mCherry-puro-LoxP载体进行双酶切验证，结果见图 3，完整载体图谱见图 4。
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M. DNA相对分子质量标准；1. pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体酶切结果 M. DNA marker 5000; 1. Digestion result of pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP vector 图 3 pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体双酶切电泳图 Fig. 3 Double enzyme digestion electrophoretogram of pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP vector |
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图 4 pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体图谱 Fig. 4 The map of pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP vector |
用三质粒系统包装pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体的慢病毒，图 5A为pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体慢病毒包装48和72 h时的细胞发红光情况，证明慢病毒包装成功。对包装的pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体的病毒滴度进行测定，结果如图 5B所示，根据公式计算得出病毒滴度为8×107 TU·mL-1，并且最适MOI为10。
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A.慢病毒包装48和72 h后的293T细胞荧光图像(100×)；B.慢病毒梯度稀释100~10-7倍荧光图(100×) A. Fluorescent images of 293T cells transfected 48 and 72 h; B. Fluorescent images of lentivirus with gradient dilution of 100-10-7 times 图 5 pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体慢病毒包装 Fig. 5 The packaging map of pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP lentivirus |
根据最适MOI浓度计算慢病毒感染量，加入适当慢病毒感染PK15细胞，并用终浓度为6 μg·mL-1的嘌呤霉素培养基进行筛选，挑取单克隆细胞并扩大培养，细胞发光状况见图 6。
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A.荧光显微镜视野；B.光学显微镜视野 A. Fluorescent microscope field; B. Optical microscope field 图 6 同一视野下细胞图片(100×) Fig. 6 Cell images in the same field of view (100×) |
以莱芜猪基因组为模板分别扩增长臂和短臂片段连接到pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体的多克隆位点中，构成pLV-LA-LoxP-mCherry-puro-LoxP-SA同源重组载体。图 7A为长臂的扩增，图 7B为短臂的扩增, 图 7C为同源重组载体图谱。
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A.长臂序列扩增电泳图；B.短臂序列扩增电泳图；C.同源重组载体图谱。M.DNA相对分子质量标准；1.长臂序列扩增结果；2.短臂序列扩增结果 A. PCR amplification electrophoretograms of long arm sequence; B. PCR amplification electrophoretograms of short arm sequence; C. The map of homologous recombinant vector. M. DNA marker 2000; 1. Amplification result of long arm sequence; 2. Amplification result of short arm sequence 图 7 同源重组载体构建 Fig. 7 Construction of homologous recombinant vector |
对6个打靶载体分别进行慢病毒包装，再分别感染PK15细胞，用终浓度为6 μg·mL-1嘌呤霉素培养基进行筛选，在细胞长满后提取细胞基因组。以基因组为模板，跨打靶位点进行扩增，用T7E1酶切检测sgRNA的打靶效率，结果见图 8，经计算发现sgRNA 3 (D3)和sgRNA 4 (L1)效率最高，分别为48%和49%，最终选用这两个打靶载体进行后续研究。
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M.DNA相对分子质量标准；D1-D3. sgRNA1-3; L1-L3. sgRNA4-6 M. DNA marker 2000; D1-D3. sgRNA1-3; L1-L3. sgRNA4-6 图 8 打靶效率结果 Fig. 8 The result of sgRNA targeting efficiency |
将同源重组载体和两个靶向载体(sgRNA3和sgRNA4)分别进行慢病毒包装，将3个载体的慢病毒一同感染PK15细胞，并用6 μg·mL-1嘌呤霉素培养基进行筛选，挑取了17组单克隆细胞培养。提取17组细胞的基因组，并以此为模板进行扩增，验证目的片段是否正确插入。用KI-1引物进行扩增时均出现条带，如图 9A所示，由于仅敲入14 bp通过PCR扩增电泳图难以区分，所以进行测序，测序结果见图 9B，发现仅3组单克隆细胞成功敲入14 bp目的序列，再用KI-2引物进行扩增，仅这3组阳性克隆细胞出现条带，见图 9C。
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A.PCR扩增电泳图(以KI-1为引物)；B.测序结果；C.PCR扩增电泳图(以KI-2为引物)。M.DNA相对分子质量标准；1~3.阳性克隆细胞；4.阴性克隆细胞；#3，#9，#10.阳性克隆细胞；剩余是阴性克隆细胞 A. PCR amplification electrophoretogram (Taking KI-1 as primer); B.DNA sequencing; C. PCR amplification electrophoretogram (Taking KI-2 as primer). M. DNA marker 2000; 1-3. Positive cloned cells; 4. Negative cloned cells; #3, #9, #10. Positive cloned cells; the rest are negative cloned cells 图 9 单克隆细胞鉴定结果 Fig. 9 Results of monoclonal cell identification |
用Cre质粒处理阳性克隆细胞，处理前后细胞荧光明显减少，如图 10A所示；用流式细胞仪检测发现荧光细胞减少13.8%，结果见图 10B，证明Cre质粒处理成功。
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A.荧光显微镜下细胞荧光情况：a.阳性克隆细胞；b.Cre质粒处理的阳性克隆细胞。B.流式检测结果：a.PK15细胞；b.阳性克隆细胞；c.Cre质粒处理的阳性克隆细胞 A. Cell fluorescence in the fluorescent microscope field: a.Positive cloned cells; b.Cre plasmid-treated positive cloned cells. B. Folw cytometry results: a. PK15 cells; b. Positive cloned cells; c. Cre plasmid-treated positive cloned cells 图 10 Cre质粒处理前后细胞荧光情况(100×) Fig. 10 Cell fluorescence before and after Cre plasmid treatment (100×) |
向PK15细胞和阳性克隆细胞接种PCV2病毒，48 h后提取两种细胞内的总蛋白，测定蛋白浓度后利用Western blotting检测两种细胞内的MRC1和PCV2蛋白的表达情况，结果如图 11A和11B所示，阳性克隆细胞的MRC1蛋白表达量显著增高(图 11A)(P < 0.05)，PCV2蛋白表达量显著降低(图 11B)(P < 0.05)，说明MRC1基因启动子区插入14 bp片段后可以显著提高MRC1蛋白表达量，并抑制PCV2蛋白表达。
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A.MRC1蛋白表达变化；B.PCV2蛋白表达变化；C. PCV2病毒拷贝数的检测结果。*. P < 0.05；**. P < 0.01 A.Expression changes of MRC1 protein; B. Expression changes of PCV2 protein; C. The expression of PCV2 DNA copies. *. P < 0.05; **.P < 0.01 图 11 抗病毒能力鉴定 Fig. 11 Identification of antiviral ability |
向PK15细胞和阳性克隆细胞接种PCV2病毒，48 h后提取两种细胞内的病毒基因组，利用实验室前期构建的标准曲线，通过绝对定量检测两种细胞攻毒后的病毒拷贝数，结果如图 11C所示，与PK15细胞相比，阳性克隆细胞中PCV2病毒载量极显著降低(P < 0.01)，表明MRC1基因启动子区插入14 bp片段后可以显著抑制PCV2的复制。
3 讨论甘露糖受体(MR)可以识别并吞噬多种病原体，当MR的表达量下调时会使机体抵抗力下降，对这些病原体的易感性增加。Chakraborty等[28]发现，用过氧化氢处理巨噬细胞后，会抑制该种细胞中MR的表达，进而抑制其对杜氏利什曼原虫的摄取，降低其对该原虫的抵抗力，增加易感性。Sukegawa等[29]发现，人MRC1基因可以识别HIV病毒，并抑制病毒粒子从细胞表面脱落。实验室前期研究发现，MRC1基因主要在莱芜猪和商品猪上参与炎症反应的组织中表达，并且在感染PCV2病毒后MRC1基因表达量发生变化。对猪MRC1基因启动子区分析发现，在转录起始位点上游-864 bp位点处存在14 bp的片段插入或缺失多态，插入该片段可以显著提高MRC1基因启动子区活性；同时发现，不同猪品种间14 bp片段纯合子的基因型频率不同，莱芜猪高于商品猪，与猪抗PCV2感染能力有关[28]。但该研究仅从MRC1基因启动子区活性和群体检测不同猪种间14 bp片段纯合子的基因型频率来说明MRC1基因与PCV2有关，并未直接验证两者之间的关系，所以本研究基于此，利用CRISPR/Cas9系统验证了MRC1基因与PCV2之间的直接关系。将莱芜猪MRC1基因转录起始位点上游的14 bp片段插入到PK15细胞MRC1基因相同位置，增加了MRC1蛋白表达量，对正常PK15细胞和定点敲入14 bp片段的PK15细胞进行PCV2攻毒处理，发现敲入14 bp片段的PK15细胞会显著抑制PCV2的复制，这表明增加MRC1蛋白表达量可以抑制PCV2的复制。
当前，CRISPR/Cas9技术已经是最有效的基因组编辑工具之一。CRISPR/Cas9系统结构简单，容易设计，只需要改变sgRNA序列，就可以实现不同位点的基因编辑。与ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率更高，特异性更强。实验室前期已成功利用CRISPR/Cas9系统对PK15细胞的MX1基因进行了编辑，提高了MX1基因表达量，降低了PK15细胞对PCV2的敏感性[30]。本研究基于此，利用CRISPR/Cas9系统研究了猪MRC1基因与PCV2之间的关系，将莱芜猪MRC1基因转录起始位点上游多出的14 bp插入到PK15细胞的MRC1基因启动子相同区域，增加了MRC1蛋白的表达量，进而提高了抗PCV2能力。
虽然CRISPR/Cas9系统可以对目的基因进行有效的编辑，但筛选标记基因的存在可能会干扰内源基因的正常表达，其编码的蛋白质也有可能使宿主动物对抗生素产生耐药性[31]，进而对受体动物产生生物安全风险。如Bcl-X基因在小鼠性腺发育过程中可以维持生殖细胞的存活，Rucker等[32]利用同源重组将新霉素基因引入Bcl-X基因启动子前，产生了具有严重生殖缺陷的小鼠，使用Cre酶介导的重组载体去除新霉素基因后，Bcl-X基因恢复正常功能，小鼠也恢复正常的生殖功能。因此有必要删除筛选标记基因。在本研究中，为了方便阳性克隆细胞的观察和筛选，不仅引入了可视化报告基因红色荧光蛋白基因，还引入了抗性标记基因嘌呤霉素，当阳性克隆细胞筛选出来后，这些标记基因便完成了自身任务。在构建载体时，在这些筛选标记基因的两端引入了同向LoxP序列，利用Cre重组酶介导的重组来删除标记基因，减少潜在的生物安全隐患。对于是否成功删除标记基因，本研究是利用显微镜观察红色荧光细胞数目以及通过流式细胞术检测红色荧光蛋白表达量来确定。
4 结论该研究构建了pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体和稳转细胞株，利用CRISPR/Cas9系统将莱芜猪MRC1基因转录起始位点上游的14 bp敲入到PK15细胞中，结果表明，MRC1编辑的PK15细胞中MRC1蛋白表达量显著升高，并有效的提高了该细胞对PCV2病毒的抵抗能力。
| [1] |
庞培, 董伟, 刘沅, 等. PCV2疫苗免疫效力评价体系的构思[J]. 经济动物学报, 2016, 20(2): 118-124. PANG P, DONG W, LIU Y, et al. Conception of evaluation system for efficacy of PCV2 vaccination[J]. Journal of Economic Animal, 2016, 20(2): 118-124. DOI:10.13326/j.jea.2016.1129 (in Chinese) |
| [2] |
WANG Y, NOLL L, LU N Y, et al. Genetic diversity and prevalence of porcine circovirus type 3 (PCV3) and type 2 (PCV2) in the Midwest of the USA during 2016-2018[J]. Transbound Emerg Dis, 2020, 67(3): 1284-1294. DOI:10.1111/tbed.13467 |
| [3] |
XU T, ZHANG Y H, TIAN R B, et al. Prevalence and genetic analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) and type 3 (PCV3) between 2018 and 2020 in central China[J]. Infect Genet Evol, 2021, 94: 105016. DOI:10.1016/j.meegid.2021.105016 |
| [4] |
WANG Z Y, CHEN J, WU X C, et al. PCV2 targets cGAS to inhibit type I interferon induction to promote other DNA virus infection[J]. PLoS Pathog, 2021, 17(9): e1009940. DOI:10.1371/journal.ppat.1009940 |
| [5] |
MO X B, LI X D, YIN B, et al. Structural roles of PCV2 capsid protein N-terminus in PCV2 particle assembly and identification of PCV2 type-specific neutralizing epitope[J]. PLoS Pathog, 2019, 15(3): e1007562. DOI:10.1371/journal.ppat.1007562 |
| [6] |
ZHENG G M, LU Q X, WANG F Y, et al. Phylogenetic analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) between 2015 and 2018 in Henan Province, China[J]. BMC Vet Res, 2020, 16(1): 6. DOI:10.1186/s12917-019-2193-1 |
| [7] |
ROSE N, OPRIESSNIG T, GRASLAND B, et al. Epidemiology and transmission of porcine circovirus type 2 (PCV2)[J]. Virus Res, 2012, 164(1-2): 78-89. DOI:10.1016/j.virusres.2011.12.002 |
| [8] |
ZHANG S, SHEN J T, LI D L, et al. Strategies in the delivery of Cas9 ribonucleoprotein for CRISPR/Cas9 genome editing[J]. Theranostics, 2021, 11(2): 614-648. DOI:10.7150/thno.47007 |
| [9] |
LEIBOWITZ M L, PAPATHANASIOU S, DOERFLER P A, et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing[J]. Nat Genet, 2021, 53(6): 895-905. DOI:10.1038/s41588-021-00838-7 |
| [10] |
NAHMAD A D, REUVENI E, GOLDSCHMIDT E, et al. Frequent aneuploidy in primary human T cells after CRISPR-Cas9 cleavage[J/OL]. Nat Biotechnol, 2022. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35773341/.
|
| [11] |
CONG L, ZHANG F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system[M]//PRUETT-MILLER S M. Chromosomal Mutagenesis. 2nd ed. New York: Humana, 2015: 197-217.
|
| [12] |
SAVIĆ N, SCHWANK G. Advances in therapeutic CRISPR/Cas9 genome editing[J]. Transl Res, 2016, 168: 15-21. DOI:10.1016/j.trsl.2015.09.008 |
| [13] |
张雨, 郭中坤, 付彬, 等. 利用CRISPR/Cas9技术构建Bpi基因敲除小鼠[J]. 中国比较医学杂志, 2020, 30(6): 39-46. ZHANG Y, GUO Z K, FU B, et al. Construction of Bpi gene-knockout mice using CRISPR/Cas9[J]. Chinese Journal of Comparative Medicine, 2020, 30(6): 39-46. (in Chinese) |
| [14] |
JAYNES J M, SABLE R, RONZETTI M, et al. Mannose receptor (CD206) activation in tumor-associated macrophages enhances adaptive and innate antitumor immune responses[J]. Sci Transl Med, 2020, 12(530): eaax6337. DOI:10.1126/scitranslmed.aax6337 |
| [15] |
NIELSEN M C, HVIDBJERG GANTZEL R, CLÀRIA J, et al. Macrophage activation markers, CD163 and CD206, in acute-on-chronic liver failure[J]. Cells, 2020, 9(5): 1175. DOI:10.3390/cells9051175 |
| [16] |
AZAD A K, RAJARAM M V S, SCHLESINGER L S. Exploitation of the macrophage mannose receptor (CD206) in infectious disease diagnostics and therapeutics[J]. J Cytol Mol Biol, 2014, 1(1): 1000003. |
| [17] |
XU Z J, GU Y, WANG C Z, et al. The M2 macrophage marker CD206:a novel prognostic indicator for acute myeloid leukemia[J]. Oncoimmunology, 2020, 9(1): 1683347. DOI:10.1080/2162402X.2019.1683347 |
| [18] |
刘浩. 猪SERPINA1和MRC1基因的表达调控及其与抗PCV2感染的关系[D]. 泰安: 山东农业大学, 2016. LIU H. Expression and transcriptional regulation of porcine SERPINA1 and MRC1 genes and their relationship with PCV2 resistance[D]. Tai'an: Shandong Agricultural University, 2016. (in Chinese) |
| [19] |
CUMMINGS R D. The mannose receptor ligands and the macrophage glycome[J]. Curr Opin Struct Biol, 2022, 75: 102394. DOI:10.1016/j.sbi.2022.102394 |
| [20] |
CAO H, VICKERS M A. Oxidative stress, malaria, sickle cell disease, and innate immunity[J]. Trends Immunol, 2021, 42(10): 849-851. DOI:10.1016/j.it.2021.08.008 |
| [21] |
FIANI M L, BARRECA V, SARGIACOMO M, et al. Exploiting manipulated small extracellular vesicles to subvert immunosuppression at the tumor microenvironment through mannose receptor/CD206 targeting[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(17): 6318. DOI:10.3390/ijms21176318 |
| [22] |
CICUÉNDEZ M, CASARRUBIOS L, FEITO M J, et al. Effects of human and porcine adipose extracellular matrices decellularized by enzymatic or chemical methods on macrophage polarization and immunocompetence[J]. Int J Mol Sci, 2021, 22(8): 3847. DOI:10.3390/ijms22083847 |
| [23] |
CHEN C, PERRY T L, CHITKO-MCKOWN C G, et al. The regulatory actions of retinoic acid on M2 polarization of porcine macrophages[J]. Dev Comp Immunol, 2019, 98: 20-33. DOI:10.1016/j.dci.2019.03.020 |
| [24] |
YE X, HOLLAND R, WOOD M, et al. Combination treatment of mannose and GalNAc conjugated small interfering RNA protects against lethal Marburg virus infection[J]. Mol Ther, 2022. DOI:10.1016/j.ymthe.2022.09.009 |
| [25] |
NIKOVICS K, MORIN H, RICCOBONO D, et al. Hybridization-chain-reaction is a relevant method for in situ detection of M2 d-like macrophages in a mini-pig model[J]. FASEB J, 2020, 34(12): 15675-15686. DOI:10.1096/fj.202001496R |
| [26] |
VAUTIER S, MACCALLUM D M, BROWN G D. C-type lectin receptors and cytokines in fungal immunity[J]. Cytokine, 2012, 58(1): 89-99. DOI:10.1016/j.cyto.2011.08.031 |
| [27] |
LIU H, WANG C Y, LIU G, et al. A 14 bp indel polymorphism in the promoter region is associated with different responses to porcine circovirus type 2 infection by regulating MRC1 transcription[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2021, 234: 110202. DOI:10.1016/j.vetimm.2021.110202 |
| [28] |
CHAKRABORTY P, GHOSH D, BASU M K. Modulation of macrophage mannose receptor affects the uptake of virulent and avirulent Leishmania donovani promastigotes[J]. J Parasitol, 2001, 87(5): 1023-1027. DOI:10.1645/0022-3395(2001)087[1023:MOMMRA]2.0.CO;2 |
| [29] |
SUKEGAWA S, MIYAGI E, BOUAMR F, et al. Mannose receptor 1 restricts HIV particle release from infected macrophages[J]. Cell Rep, 2018, 22(3): 786-795. DOI:10.1016/j.celrep.2017.12.085 |
| [30] |
石超群. 基于CRISPR/Cas9的猪Mx1基因编辑的研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2021. SHI C Q. Study on genomic edition of porcine Mx1 gene based on CRISPR/Cas9 technique[D]. Tai'an: Shandong Agricultural University, 2021. (in Chinese) |
| [31] |
BI Y Z, HUA Z D, LIU X M, et al. Isozygous and selectable marker-free MSTN knockout cloned pigs generated by the combined use of CRISPR/Cas9 and Cre/LoxP[J]. Sci Rep, 2016, 6: 31729. DOI:10.1038/srep31729 |
| [32] |
RUCKER E B, DIERISSEAU P, WAGNER K U, et al. Bcl-x and Bax regulate mouse primordial germ cell survival and apoptosis during embryogenesis[J]. Mol Endocrinol, 2000, 14(7): 1038-1052. DOI:10.1210/mend.14.7.0465 |
(编辑 郭云雁)