2. 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization, Chengdu 610041, China
嵴病毒(kobuvirus, KoV)是微RNA病毒科的一个新的属。国际病毒分类委员会根据KoV种成员的分类标准：多聚蛋白质(polyprotein)的氨基酸相似性大于70%，结构蛋白P1(VP0、VP3和VP1)的氨基酸相似性大于70%，非结构蛋白2C和3CD的氨基酸相似性大于80%，将KoV分为A型爱知病毒~F型爱知病毒6个种，以及未分类的挪威鼠嵴病毒、灰松鼠嵴病毒和蝙蝠嵴病毒3个种。通过KoV VP1基因系统发育分析，进一步将KoV划分为20个基因型[1]。
目前，A型爱知病毒有6个成员，包括人爱知病毒(Aichi virus 1, AiV-1)[2]、犬嵴病毒(canine kobuvirus, CaKoV)、猫嵴病毒(feline kobuvirus, FeKoV)、鼠嵴病毒(murine kobuvirus, MuKoV)、欧洲鹞嵴病毒(roller kobuvirus, RoKoV)和污水嵴病毒(sewage kobuvirus, KoV-Sew)[1]；B型爱知病毒有3个成员，分别为牛嵴病毒(bovine kobuvirus，BKoV)、雪貂嵴病毒(ferret kobuvirus, FKoV)和绵羊嵴病毒(ovine kobuvirus, OKoV)[1]；C型爱知病毒有2个成员，分别为猪嵴病毒(porcine kobuvirus，PKoV)[3]和山羊嵴病毒(caprine kobuvirus，CKoV)[4]；而D型爱知病毒~F型爱知病毒均只有1个成员，分别为BKoV、兔嵴病毒(rabbit kobuvirus, RaKoV)和蝙蝠嵴病毒(bat kobuvirus, BaKoV)[1]。
该病毒最早在日本从患有急性胃肠炎人的腹泻粪便样本中检测到，之后从狗、猫、猪、老鼠、土拨鼠、大鼠、雪貂、山羊、兔、蝙蝠、鸟类以及污水等中都发现KoV[5-6]，目前，已从人、牛和猪身上分离得到该病毒[2, 7-8]。研究表明，KoV可以感染人、牛和猪[7, 9-10]，也与狗、猫、猪和山羊等多种动物腹泻有密切联系[11]。A型爱知病毒成员AiV-1能引起人类急性胃肠炎[9, 12]，B型爱知病毒成员BKoV能引起犊牛严重腹泻[7]，另外BKoV能在牛鼻拭子中检出，表明BKoV可能具有消化道和呼吸道双嗜性[13]。C型爱知病毒成员PKoV引起仔猪严重腹泻[8, 14]。另外A型爱知病毒成员的FeKoV和CaKoV也与动物腹泻相关[15-16]。2020年，作者实验室首次证实KoV在我国的存在，随后又证实该病毒在我国山羊和藏绵羊中广泛流行[17-18]，致病性试验证实KoV是羔羊的腹泻病原，并能引起羔羊全身感染[19]。目前，KoV已经在美国、中国、日本、巴基斯坦、巴西、德国、法国、突尼斯等17个国家检出，其危害也受到越来越广泛的重视。因此本文综述了KoV在生物学特性、流行病学、致病性、检测技术等方面的国内外最新进展，以期为后续科学研究以及该病的有效防控提供参考。
1 KoV的基因组结构及其编码蛋白 1.1 基因组结构和作用KoV为微RNA病毒科KoV属的成员，病毒粒子直径为30~40 nm，为无囊膜球形单股正链RNA病毒，其表面有很多凸起[6, 20]。KoV基因组由病毒的末端结合蛋白(viral protein genome-liked，VPg)、5′端非编码区(untranslated regions，UTRs)、1个开放阅读框(open reading frame，ORF)以及3′端非编码区(untranslated regions，UTRs)和聚(A)尾组成(图 1)。ORF包括氨基端的非结构蛋白L(leader protein)，3种结构蛋白P1(VP0、VP3和VP1)、7种非结构蛋白P2(2A~2C)和P3(3A~3D)。基因组大小高达8 280 nt(5′-UTR：高达744 nt；ORF：7 299~7 467 nt；3′-UTR：136~240 nt)，GC的含量高达59%[21-22]。
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图 1 嵴病毒基因组结构示意图 Fig. 1 Diagram of KoV genome structure |
KoV 5′-UTR末端的42 nt形成了稳定的茎环结构(SL-A、SL-B和SL-C)，5′-UTR复杂的二级结构和L蛋白涉及RNA复制和衣壳化[23]，具有内部核糖体进入位点(IRES)，可以直接翻译多蛋白和病毒基因组蛋白(VPg)，代替甲基化核苷酸帽结构，不同种的KoV其IRES型不一样。与其他微RNA病毒相比不发生裂解，VP0衣壳蛋白在KoV成熟粒子中表达，另外，2A和L蛋白没有蛋白酶或自催化的基序，2A蛋白包含H-rev107家族特有的保守基序，该家族参与细胞增殖，但其具体功能仍不清楚[24-25]。P3蛋白的3ABC与基因组的5′末端区域比3′UTR端长，最长可达240 nt，其作用与负链合成有关，KoV的3B蛋白(VPg)比同一家族的其他病毒的长，3C蛋白是一种半胱氨酸蛋白酶，该蛋白酶能切割所有的酶切位点[6]。3D区域含有编码病毒复制所需的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的氨基酸基序，在病毒RNA复制中起重要作用[23]。病毒RNA复制位点是由2B、2BC、2C、3A和3AB蛋白、高尔基体蛋白ACBD3和磷脂酰肌醇4-激酶IIIb(PI4KB)组成的复合物，增强PI4KB依赖性磷脂酰肌醇4-磷酸(PI4P)的产生，对KoV复制至关重要[26-27]。
1.2 KoV的编码蛋白1.2.1 VP0蛋白 KoV VP0完整基因全长为813~1 143 bp，有1个开放阅读框，编码271~381个氨基酸。来自不同基因型KoV毒株VP0基因的核苷酸序列相似性为50.0%~98.0%，而来自同一基因型KoV毒株VP0基因的核苷酸序列相似性为98.0%~100%。分析表明，不同基因型的部分KoV毒株VP0基因之间出现了多个点突变，同一基因型KoV毒株VP0基因之间相对保守。选取不同时间、不同地区、不同物种和不同型代表毒株构建进化树分析表明，同种型毒株独立聚在一小支上，同种型不同成员遗传关系较近，不同种KoV遗传关系很大，C型爱知病毒毒株VP0与B型爱知病毒毒株VP0遗传关系相对较近[17]。
大多数微RNA病毒粒子将VP0裂解为VP2和VP4，成熟的病毒粒子VP4亚基常附着在其衣壳内表面的肽段第70—80 aa处[28-29]。许多微RNA病毒的粒子均含有VP2和VP4，然而在KoV中VP0缺少切割位点而不会发生裂解，因此在成熟的病毒粒子中保留完整的VP0，这是KoV与其他微RNA病毒间的不同之处，被认为是RNA酶催化的结果。目前，尽管KoV VP0的N末端有经典的肉豆蔻酰化基序(GXXXT)，但还不清楚VP0是否被肉豆蔻酰化[30]。
AiV-1 VP0蛋白可能参与细胞受体识别[28]、病毒感染致病过程[31]，其核心结构域CD-loop位于其氨基酸序列的第195—253区域，明显暴露在病毒粒子的表面，形成凹陷，可能在受体结合中起作用，认为是一个具有显著抗原性的表位[30]。
1.2.2 VP3蛋白 KoV VP3完整基因全长为129~669 bp，有1个开放阅读框，编码43~223个氨基酸。来自不同基因型KoV毒株VP3基因的核苷酸序列相似性为54.3%~94.2%，而来自同一基因型KoV毒株VP3基因的核苷酸序列相似性为94.2%~100%。分析表明，不同基因型KoV毒株VP3基因之间出现了多个点突变，同一基因型KoV毒株VP3基因之间相对保守。选取不同时间、不同地区、不同物种和不同型代表毒株构建进化树分析显示，A型爱知病毒KoV分散在不同种的分支上，其他种型KoV毒株大多数独立聚在一小支上，不同种KoV遗传关系相对较大，其中，B型爱知病毒和D型爱知病毒的KoV VP3遗传关系相对较近[18]。
PKoV VP3结构蛋白可能会影响复合物STAT2-IRF9和STAT2-STAT2形成与入核，从而抑制INF-β诱导的信号通路来逃避细胞免疫[32]。到目前为止，还未见报道VP3蛋白的其他功能。
1.2.3 VP1蛋白 KoV VP1完整基因全长为756~863 bp，有1个开放阅读框，编码252~288个氨基酸。来自不同基因型KoV毒株VP1基因的核苷酸序列相似性为26.6%~96.1%，而来自同一基因型KoV毒株VP1基因的核苷酸序列相似性为96.1%~100%。分析表明，不同基因型KoV毒株VP1基因之间出现了多个点突变，同一基因型KoV毒株VP1基因之间相对保守。选取不同时间、不同地区、不同物种和不同型代表毒株构建进化树分析显示，大多数同种型毒株独立聚在一小支上，然而C型爱知病毒成员PKoV和CKoV遗传关系相对较远，CKoV毒株与B型爱知病毒毒株遗传关系较近[17]。另外，VP1基因适用于KoV分型[33]。
尽管已经鉴定出微RNA病毒的受体[34-35]，但是KoV的受体仍然未知。某些微RNA病毒在VP1的C末端具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)或赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(KGD)基序，参与受体的识别[36-37]和病毒的致病[28]。AiV-1 VP1蛋白与病毒致病有关[31]，VP1蛋白潜在的受体识别位点为P232、P233、L234、P235、P236、L237和P238。VP1蛋白暴露于病毒粒子的表面，承受的环境压力较大，导致其基因容易发生较大突变，该蛋白是KoV中最可变的免疫决定蛋白[12, 38]，AiV-1 VP1蛋白受体识别序列(氨基酸残基PRPPPPLPPLPTP)位于其氨基酸序列的第228—240区域可能参与受体识别[28]。AiV-1 VP1蛋白抗原表位基序(氨基酸残基DNSPQPRTTFDYTDNPLPPDTKL)位于其氨基酸序列的第21—43区域，可能在抗原多样性中起关键作用[12]，VP1基因常用于KoV的分型，根据VP1基因进化树，BKoV、AiV-1和PKV划分为不同的谱系[39-41]。然而，为更好地了解不同VP1家族的抗原性，还需要深入的研究。
2 流行概况 2.1 A型爱知病毒2.1.1 AiV-1 自1989年，Yamashita和Kobayashi用电镜首次从日本爱知县的急性胃肠炎病人粪便样本中发现AiV-1，到目前为止，该病毒已在美国、日本、巴基斯坦、巴西、德国、法国、突尼斯、匈牙利和芬兰等国家中发现，地域涵盖南美洲、北美洲、亚洲、非洲、欧洲，具有地域分布广的特点，胃肠炎病人的腹泻粪便样本中AiV-1的检出率为0.5%~3%[10, 42-43]。
AiV-1只有1个血清型，血清学检测结果表明该病毒已在欧洲国家广泛流行，而且AiV-1抗体阳性率随年龄的增长而上升。在德国，0~3岁儿童的AiV-1抗体阳性率为51%，而40岁以上患者的AiV-1抗体阳性率几乎为100%[39]。在法国也取得了类似的结果，7个月至9岁的婴儿的AiV-1抗体阳性率为25%，稳步上升到40岁患者的AiV-1抗体阳性率为85%~90%[44]。在西班牙，直到30岁才能检测到AiV-1抗体阳性率的显著增加，30岁以后没有显著的增加[45]。
2.1.2 CaKoV 2011年，美国在腹泻和无症状的狗腹泻粪便样本中首次检测到CaKoV[46]。迄今为止，该病毒已经在美国、中国、意大利和韩国等国家发现，CaKoV的检出率为2.34%~50.46%[16, 47-48]。研究表明，CaKoV已在中国西北和西南地区广泛存在[16, 49-50]，2018年，本实验室在中国西南地区腹泻狗的粪便样本中发现了CaKoV，检出率为50.46%[50], 高于之前中国其他地区的报道[16, 49]。CaKoV不仅在狗腹泻粪便样本中检出，并且在狼、红狐、金豺、侧条纹豺和斑点鬣狗粪便样本中也有检出[51]，表明CaKoV存在于野生和家养食肉动物中，且CaKoV与AiV-1关系最密切[47, 52]。
CaKoV只有1个血清型，目前，只有1篇文献报道了该病毒的血清流行病学调查，2013年, Carmona-Vicente等[47]在英国以AiV-1病毒为抗原，在198份犬血清标本中检测到74份抗该病毒的IgG抗体，提示AiV-1与CaKoV混合感染犬，或能检测具有交叉反应性的KoV感染犬。
2.1.3 FeKoV FeKoV最初于2013年在韩国腹泻猫的粪便中发现[53]，随后，从意大利、韩国和中国猫的腹泻粪便样本中检测到FeKoV，检出率为9.9%~15.4%[15, 47, 54]。2018年，首次在中国南方地区腹泻猫的粪便样本中检测到FeKoV，但在健康猫中未检测到该病毒[55]，随后2019年在中国东北地区猫的粪便样本中也检测到了FeKoV，其腹泻样本中FeKoV阳性率(19.1%，20/105)显著高于非腹泻样本(8.7%，8/92)，提示FeKoV可能与国内猫腹泻有联系[54]。研究表明，FeKoV与CaKoV、MuKV和AiV-1有较近的遗传关系。FeKoV、CaKoV、MuKoV和AiV-1的3D基因核苷酸序列的相似性分别为82.1%、79.9%和80.4%[47, 52]。
FeKoV同样只有1个血清型，目前，也只有1篇文献报道该病毒的血清流行病学调查研究，2013年Carmona-Vicente等[4]在英国以AiV-1病毒为抗原，在97份猫血清标本中检测到67份抗该病毒的IgG抗体，提示AiV-1与FeKoV混合感染猫，或能检测具有交叉反应性的KoV感染猫。
2.1.4 MuKoV MuKoV最初于2011年在美国的1只峡谷鼠的粪便中被发现[56]。随后，在匈牙利、越南、美国和中国的几种啮齿动物的粪便样本中均有发现，MuKV检出率为12.6%~55.5%[57-58]。2020年，首次在中国广东褐家鼠的粪便样本中检测到了MuKoV[59]，随后在福建、湖南、云南等地区黄毛鼠、黄胸鼠、褐家鼠啮齿动物的粪便样本中均发现了该病毒，检出率分别为10.2%、23.7%和28.1%，总阳性率为23.0%[60]。研究发现，MuKoV与AiV-1最密切[56]。然而，目前关于MuKV血清流行病学调查资料不清。
2.1.5 RoKoV 目前，关于RoKoV的报道只有1篇文献。研究者从匈牙利采集了18份欧洲鹞粪便样本，RoKoV检出率为17%，RoKoV与AiV-1有较近的遗传关系[61]。关于RoKoV血清流行病学调查仍不清楚。
2.1.6 KoV-Sew 自2010年，研究者首次在水中发现KoV-Sew后，该病毒已在美国、日本、南非、伊朗、尼泊尔、泰国、意大利、荷兰、委内瑞拉、法国、西班牙和突尼斯等12个国家检出[5]，地域分布涵盖北美洲、南美洲、欧洲、亚洲、非洲，分布十分广泛[10]。KoV-Sew在世界各地的废水样本中的检出率为3.2%~100%[5, 10]。
目前，KoV-Sew在污水、河水、地下水等各种环境样本中经常检测到。研究表明，在日本、荷兰、突尼斯和意大利等国的污水中KoV-Sew的检测率为6%~100%[10, 62-63]，对处理后的污水样本进行分析，KoV-Sew检出率为91.7%[64]。污水中KoV-Sew的检出没有季节性，全年均可检测到该病毒[65]；据报道，在伊朗、尼泊尔、法国、荷兰、委内瑞拉和日本等国的河水中KoV-Sew检出率为45%~60%[10, 64]；另外，在美国和尼泊尔等国的地下水中KoV-Sew检出率为29.7%~58.3%[66]。水是人类和动物生存不可或缺的物质，水中KoV-Sew较高的阳性检出率是值得注意的公共卫生问题。
2.2 B型爱知病毒2.2.1 BKoV 2003年，日本首次在胎牛血清中鉴定出了B型爱知病毒BKoV，到目前为止该病毒已在美国、意大利、埃及、巴西、泰国、韩国、比利时、匈牙利和荷兰等13个国家中检出[11, 67-68]，涵盖北美洲、南美洲、欧洲、亚洲、非洲，具有广泛的地域分布，BKoV在健康牛和腹泻牛粪便样本中均能检出，其中健康牛粪便样本中的检出率为4.8%~59.7%[11, 69]，腹泻牛粪便样本中的检出率为1%~82.6%[11, 67, 70]。2014年，首次在中国北京、内蒙古、黑龙江和新疆的奶牛腹泻粪便样本中检测到B型爱知病毒BKoV，检出率为34.90%[67]。随后，2019年本实验室对辽宁、河南、山东和陕西96份牛腹泻粪便和77份非腹泻粪便样本进行B型爱知病毒BKoV检测，结果显示腹泻样本中阳性率(35.42%)显著高于非腹泻样本(11.69%，P＜0.001)，提示B型爱知病毒BKoV可能与国内牛腹泻有关[43]。
BKoV主要感染犊牛，调查研究显示韩国腹泻犊牛粪便中BKoV检出率高达66.7%[71-72]。巴西腹泻牛粪便中BKoV平均检出率为14.4%(31/216)，犊牛(≤1个月)检出率高达82.6%(19/23)[11, 68]。
BKoV只有1个血清型，目前该病毒的血清流行病学调查只有1篇文献报道，2003年Yamashita等[69]在日本以BKoV U-1病毒为抗原，在72份牛血清标本中检测到42份抗该病毒的IgG抗体样品。
2.2.2 FKoV 目前，关于FKoV只有1篇文献报道。2013年在荷兰和瑞典的雪貂粪样品中发现FKoV[22]，其均可在健康和腹泻动物粪样品中检出，平均检出率为15%，腹泻动物粪样品中FKoV的阳性率为67%，显著高于健康动物粪样品中的阳性率(11%)，由于样本数量小，同时也没有排除其他腹泻原因，因此需进一步深入研究，以证明这些病毒可导致雪貂腹泻。目前关于FKoV的血清流行病学情况尚不清楚。
2.2.3 OKoV 2010年，首次在匈牙利的家养绵羊中检测到了OKoV[73]，之后在巴西从1~7个月的绵羊中发现了OKoV，并发现其与AiV-1关系更为密切[74]。目前，关于OKoV血清流行病学调查资料不清。
2.3 C型爱知病毒2.3.1 PKoV 早在2007年，研究者在匈牙利的腹泻仔猪粪便样本中检测到PKoV[75]，随后相继在中国、匈牙利、意大利、西班牙、荷兰、中国、巴西、韩国、泰国、日本、越南、美国、肯尼亚、捷克、塞尔维亚、斯洛伐克和东非等多个国家/地区的猪中广泛检测到PKoV，其阳性率为3.9%~100%[20, 62, 74, 76-77]。2008年，首次在中国河北仔猪粪便样本中检测到PKoV[77]，随后该病毒陆续在江苏、上海、四川、山东、广西、河南等地区被检出，检出率为29.9%~82.1%[78-80]，仔猪腹泻粪便样本中PKoV的阳性率高达87.8%[81]，表明仔猪更容易感染PKoV[79]。PKoV不受地域限制，呈地方性感染流行，并且其可能跨国界传播[82]。国外研究者Barry等[74]和Reuter等[83]在健康猪粪便及血清中都检测到了PKoV，其中，粪便中的PKoV阳性率为53%，血清样品中PKoV阳性率为76.7%。我国胡军勇等[84]在血清样品中也检测到PKoV核酸。这表明PKoV不仅作用于肠道细胞，可能还能穿过血管壁到达血液中。来自日本的一项研究表明，北海道猪粪便样本中检测到PKoV，遗传进化分析发现该毒株与BKoV的关系比GenBank数据库中其它PKoV的关系更为密切。这一发现暗示BKoV可能向猪种间传播，反之亦然[85]。另外，PKoV在匈牙利野猪中的流行率高达100%，这个发现表明野猪也是PKoV的宿主[86]。
PKoV只有一个血清型。在我国四川、甘肃、湖南、湖北、河南、河北等省的猪血清样品中检出了PKoV，血清学阳性率为6.53%~81.25%[78, 87-88]。
2.3.2 CKoV 2012年，在韩国腹泻黑山羊粪便样本中首次检测到CKoV[89]，到目前为止，该病毒已在美国、意大利和中国发现，从健康和腹泻动物粪便样本中均能检出CKoV，健康动物样本中CKoV的检出率为2%~5.8%[90-91]，腹泻动物粪便样本中CKoV的检出率为6.5%~77.8%[4, 17, 91]。另外，在意大利的鹿中也检测到了CKoV，并与韩国黑山羊中检测到的CKoV有较近的遗传关系[90]，表明CKoV可能具有跨种间传播的能力。2020年，在明尼苏达州送检的严重腹泻羔山羊粪便样本中也检测到CKoV，该病毒感染山羊的结肠，其固有层明显浸润中性粒细胞，表明CKoV可能与山羊腹泻有密切联系[92]。作者实验室从四川、云南和重庆山羊中检出CKoV，检出率为8.6%~100%，致病性试验证实CKoV是羔山羊的腹泻病原，并能引起羔羊全身感染[17, 19, 93]，随后在我国川西北高原地区藏绵羊中检测到KoV，阳性率为8.7%，平均场阳性率66.7%，并从藏绵羊样本中鉴定出KoV基因D型爱知病毒毒株[18, 93]。可见KoV已经在国内羊群中存在和流行，未来应进一步关注该病毒在牛腹泻中的生物学意义。目前，关于CKoV血清流行病学调查资料不详。
2.4 D型爱知病毒目前，D型爱知病毒只有1个成员，即BKoV，有关D型爱知病毒BKoV的报道只有1篇文献。2016年，有研究者在日本黑牛腹泻粪便中发现2种基因型的D型爱知病毒BKoV，分别命名为D1型爱知病毒BKoV cattle/Kagoshima-1-22-KoV/2014/JPN和D2型爱知病毒BKoV cattle/Kagoshima-1-24-KoV/2015/JPN，这2种基因型的D型爱知病毒BKoV的阳性率分别为16.9%和10.4%[21]，这表明同一宿主可同时存在两种不同基因型的KoV。目前，关于D型爱知病毒BKoV血清流行病学调查资料尚不清楚。
2.5 E型爱知病毒目前，E型爱知病毒只有1个成员，为RaKoV，关于RaKoV的流行情况只有1篇文献报道。2016年，在匈牙利的两个兔场(1个商业农场和1个家庭农场)的56只临床健康兔粪便样本中，鉴定出1种新的微RNA病毒，阳性率为16/56(28.6%)，毒株具有典型的KoV基因组结构，序列和系统发育分析表明Rabbit01/2013/HUN可能是一种新嵴病毒属的物种[94]。因此，ICTV把这种KoV鉴定为E型爱知病毒种类。目前，关于RaKoV血清流行病学调查资料不清。
2.6 F型爱知病毒目前，F型爱知病毒只有1个成员，为BaKoV，只有1篇文献报道了BaKoV。2015年，有研究者通过宏基因学在蝙蝠肛拭子样本中发现了2种基因型的BaKoV[95]，这表明同一宿主可同时存在两种不同基因型的KoV。目前关于RaKoV血清流行病学调查资料仍不清楚。
3 KoV的生物学特性 3.1 KoV的一般理化特性在体外，KoV在低至pH 2的酸性条件下表现出稳定性，并能抵抗传统的灭活方法，包括醇、热、氯仿、非离子洗涤剂和乙醚[24, 96]。更重要的是，KoV在4 ℃条件下的酒精(pH 3.0)中21 d后仍具有传染性[97]。
3.2 KoV的跨种间传播特性一些证据表明，遗传高度相似的KoV在不同物种间传播：(1)在山羊直肠拭子中发现了一种与BKoV密切相关的KoV(91.2%~97.4%的3D氨基酸序列相似性)[89]；(2)匈牙利研究表明，野猪中检测到了PKoV[86]；(3)在雪貂的直肠拭子中发现的KoV与BKoV密切相关(80.8%~89.5% 3D氨基酸序列相似性)；(4)在不同的野生食肉动物物种中也检测到类似CaKoV，包括红狐、秃鹫[98]、金豺、侧纹豺(金豺)和斑点鬣狗[99]；(5)在意大利的鹿中检测到了CKoV[90]；(6)在鸟类粪便样本中检测到的KoV与AiV-1密切相关。使用贝叶斯系统发育分析表明，KoV从偶蹄类(绵羊)宿主传播到食肉类(雪貂)，从蝙蝠传播到兔，或从食肉类传播到鸟类和人类[57]。此外，从牛传播到猪[100]，表明不同动物物种之间的密切接触可能会增加种间传播的可能性[61]。关于KoVs的多样性和宿主种类谱的信息仍然有限，尽管越来越多的文献报道了KoVs新的潜在宿主，但仍然需要对更大的地理范围和其他宿主物种进行深入调查，以阐明进化关系和宿主谱[86]。
3.3 KoV的致病性3.3.1 KoV的传播方式 研究表明，KoV可以通过直接接触传播，也通过粪口途径，食用受污染的食物和水传播[2, 5-6]，A型爱知病毒成员AiV-1引起的几起疫情与食用牡蛎或海鲜有关[5]。
3.3.2 KoV感染的宿主范围 目前，KoV能感染人、牛和猪[7, 9-10]，也与狗、猫、猪和山羊等多种动物的腹泻密切相关[11]。A型爱知病毒成员AiV-1能引起人类急性胃肠炎[9, 12]，在人类免疫缺陷病毒患者粪便样本中AiV-1的流行率很高，表明AiV-1可能是X-连锁无丙种球蛋白血症慢性感染的一个病原[101-102]。B型爱知病毒成员BKoV能引起犊牛严重腹泻[7]，另外BKoV能在牛鼻拭子中检出，表明BKoV可能具有消化道和呼吸道双嗜性特性[13]。C型爱知病毒成员PKoV引起仔猪严重腹泻[8, 14]。CKoV是羔山羊的腹泻病原，并能引起羔羊全身感染[17, 19, 93]，另外A型爱知病毒成员的FeKoV和CaKoV也与动物腹泻相关[50, 55]。同时研究表明，KoV可能也与其他病毒混合感染动物[103-104]。
3.3.3 KoV所致疾病的临床症状与病理变化 据报道，KoV引起人和动物腹泻早期症状比较轻微，持续48~72 h[10, 105]。A型爱知病毒成员AiV-1与多种临床疾病有关，包括腹泻、呕吐、发烧、化脓性结膜炎和呼吸系统症状[2, 106]。此外，大多数携带有PKoV、BKoV和CKoV的动物可能表现为腹泻、消瘦、恶心等临床症状[7-8, 92]。我国研究者进行仔猪攻毒试验发现，PKoV可引起肺、胃、肠等组织的细胞脱落、淋巴细胞聚集等炎症反应[8]。由此可见，KoV在机体的定植范围较为广泛，并且PKoV可发生二次感染[74]。研究表明，在自然感染CKoV山羊的结肠中发现病变，其固有层明显浸润中性粒细胞[92, 107]，试验山羊也出现十二指肠和空肠黏膜上皮细胞脱落等现象[19]。在自然感染BKoV犊牛的回肠中也发现病变，大部分绒毛上皮细胞脱落，隐窝扩张，固有层被少量淋巴细胞、浆细胞和中性粒细胞浸润[7]。
4 KoV的致病机制KoV复制时会破坏覆盖肠绒毛上三分之一的肠细胞层，造成成熟细胞的功能性损伤，从而影响肠道对水的重吸收，导致腹泻产生。另外，绒毛缩回导致吸收表面积减小，隐窝细胞经过快速分裂，在绒毛中重新生成抵抗感染的未成熟细胞，但待成熟的细胞无法取代受感染细胞的功能，需要时间成熟，从而导致了腹泻[105]。并且KoV感染淋巴细胞可能会损害肠道的免疫反应，使动物更容易受到其他病原微生物的影响，从而导致腹泻[108]。研究表明，X-连锁无丙种球蛋白血症患者CD4+T细胞缺陷，CD4+CD45RO+和CD4+CD45RO+CXCR5+记忆T细胞减少，皮肤迟发性超敏反应受损，从而使患者容易感染AiV-1[102]。另外，T细胞缺陷的艾滋病患者也容易感染AiV-1[101]。
5 KoV的检测技术 5.1 病原学检测技术5.1.1 病毒分离培养 在2003年的一项研究中表明，AiV-1能够在BSC-1和Vero细胞中增殖且有细胞病变[9, 12]，但在HeLa、HEL、RD细胞及乳鼠中不能增殖[109]。BKoV能使HeLa细胞产生明显的细胞病变(CPE)，但不能分离到该病毒[69]。而PKoV感染PK-15细胞、HeLa细胞、Mac-145细胞、MDBK细胞、RD细胞、ST细胞等细胞系，但不产生CPE[20]。2013年，国内研究者将PKoV在Vero细胞系盲传6代或者11代后，均未检测到PKoV[110]，然而，2015年，PKoV在Vero细胞上盲传5~10次后，未观察到CPE，但RT-PCR检测结果为阳性，通过空斑纯化和电子显微镜获得了2株细胞适应的PKoV毒株[8]。最近的研究表明，PKoV和CKoV也能引起Vero细胞出现稳定的CPE[19, 111]。其他KoV只是在粪便样本中检测到，没有适应的细胞系，也未分离到相应的毒株。
5.1.2 病毒电镜观察 1989年，日本学者用电镜首次从日本爱知县的急性胃肠炎病人粪便样本中观察到微RNA病毒，并根据其所在地命名为爱知病毒(GenBank登录号：AB040749)[2]。由于病毒粒子的形状在电镜下呈直径约30 nm的球形，Kobu一词来源于日语，意思是“球形”或“突起”，又命名KoV病毒[112]。2003年，日本学者采用磷钨酸负染的电镜方法发现牛粪便样本的分离株U-1病毒粒子与爱知病毒粒子极其相似，并结合基因组序列和血清学将U-1株病毒确认为KoV新的种，命名为BKoV。
5.1.3 病毒PCR检测 针对KoV的检测主要依靠RT-PCR和Real-time RT-PCR方法[11, 113-114]，主要的靶基因为3D基因和5′-UTR[93, 112]，也有研究者选择VP0、VP3、VP1、3C基因和3CD连接区设计引物[39, 115]。由于3D和5′-UTR是KoV最为保守的基因，适宜作为检测靶基因，常用于KoV的流行病学调查[11, 39, 116]。在3C/3D区域设计引物，建立的RT-PCR方法，能鉴定出AiV-1和BKoV，但无法扩增出PKoV[33]。针对VP0-VP3区域的基因型特异性引物，用于PKoV基因分型[117]。然而，VP0和VP1蛋白常暴露于病毒粒子的最表面，受外界环境压力最大，从而导致不同程度的基因突变，不适用于设计检测引物，但这两个蛋白与病毒抗原多样性有关，常用于KoV基因分型[43, 63]。针对3C、VP1和VP3设计的嵌套PCR主要用于检测水中的KoV[115]。早期研究者根据A型爱知病毒、B型爱知病毒和C型爱知病毒保守的3D基因序列设计了通用引物，能检测到以上3个种的KoV[3]，随后大量研究者采用该检测方法[4, 89]，但病毒的检出率低，经分析发现该通用引物序列与2009年以后上传的3D基因序列相比有不同程度的核苷酸突变，这些核苷酸的突变可能会影响PCR扩增效率。Kitajima等[64]开发了一个靶向VP0区的荧光RT-PCR系统，该方法能实时定量检测AiV-1并区分其基因亚型A和基因亚型B。
与RT-PCR方法相比，Real-time RT-PCR方法的灵敏度高于RT-PCR方法，PCR反应时间短，短时间内能用于实时定量检测，但RT-PCR方法比Real-time RT-PCR方法引物所扩增片段相对较长，既能用于检测又能用于遗传进化分析，既能用于检测又能用于遗传进化分析基因型。
5.2 血清学检测技术目前，只有一种基于酶联免疫吸附试验的抗体检测方法。日本学者利用AiV-1标准株(A846/88)制备了单克隆抗体(Ai/2)，建立了用于检测血清中AiV-1特异性的IgA、IgG和IgM的ELISA方法，但尚没有商品化的试剂盒[106]。研究者通过电镜和SDS-PAGE等方法纯化得到BKoV作为抗原，以牛抗KoV血清为一抗，建立了检测BKoV抗体的竞争ELISA检测方法[69]。朱庆贺等[88]基于PKoV重组VP3蛋白建立了间接ELISA检测方法，与RT-PCR方法的符合率为90.3%。VP1蛋白具有良好的反应原性，国内研究者以VP1重组蛋白作为抗原，建立了间接ELISA检测方法，并对我国华北地区的猪血清进行PKoV抗体检测，结果检出率高达81.25%[87]。
6 防控暂无针对KoV的疫苗和有效的治疗方法[118-119]。必须加强对该病的流行动态监测，做好该病的相关防制工作[120]。由于发病人和动物是主要的传染源，因此，隔离病人和动物并做好环境消毒是预防该病的重要措施[121]。该病主要引起人和动物腹泻，因此初生动物应及时获得母源抗体保护，可有效减少发病。对脱水严重的人和动物应及时补液，调节酸碱平衡和电解质平衡，防止继发感染。
7 问题与展望KoV是一种引起人和动物腹泻的新病原，已在世界范围内广泛存在。国外对KoV在人、牛和猪等不同宿主中的流行病学调查研究较多，但国内外在该病毒的基础研究和应用开发方面仍存在诸多空白。首先，在病毒分离鉴定、生物学特性研究和疫苗研制方面仍存在诸多不足，特别是KoV的细胞培养体系仍不成熟，需进一步筛选到最适的病毒分离和培养的细胞系，这是当前必须攻克的难关。其次，KoV引起消化道疾病的致病机制仍不明确，需要进一步研究解析。此外，在我国关于KoV的流行病学调查数据少，有必要进行系统的病原检测和流行病学调查。因此，对这些方面的深入研究有助于掌握我国动物KoV的流行情况以及与腹泻的关系，为该病毒的发现以及疫病的早期预警和防控奠定基础。
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(编辑 白永平)