2. 重庆市畜牧技术推广总站, 重庆 401121
, WANG Kai1, HUANG Ziqing1, LIN Hailan1, WANG Naixiu1, LI Yuhang1, LIU Yanqing1, LIU Yuxuan1, ZHU Yan2, HE Daoling2, CHEN Hongyue2, GAN Ling1
2. Chongqing Animal Husbandry Technology Promotion Station, Chongqing 401121, China
氧化应激被定义为动物机体自由基产生和抗氧化反应之间的失衡[1]，它与众多疾病的发生和发展密切相关。其主要原因在于过量的活性氧(ROS)将通过破坏组织细胞的脂质、蛋白质和DNA而诱发组织细胞的病理变化[2]。在养猪生产中，仔猪生长发育过程中可能会遭受营养水平及环境条件改变等应激因素的刺激，从而产生过量的ROS，诱发氧化应激。例如，热应激条件下，断奶仔猪发生氧化应激，具体表现为血清丙二醛升高、半腱肌中超氧化物歧化酶降低，生长性能下降，脏器发育受到抑制[3]。由于内源性抗氧化剂的相对缺乏，新生仔猪尤其容易遭受氧化应激，从而阻碍仔猪的生长发育，增加仔猪的发病率[4]。而补充外源性抗氧化剂有助于弥补内源性抗氧化剂的不足，减轻氧化应激[5]，并防止自由基介导性疾病的发生[6]。研究表明，壳寡糖(chito-oligosaccharide, COSs)具有多种生物学活性，包括清除自由基[7]，提高动物生长性能[8]，以及抑制乙醇和过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激等[9-10]。此外，COSs对大鼠皮质神经元具有抗凋亡作用[11]，并能保护大鼠大脑皮质神经元免受铜离子诱导的氧化损伤[12]，课题组前期研究也发现，氧化应激状态下大鼠海马神经元CART基因的表达水平显著下调，而COSs能在上调CART基因表达水平的同时抑制氧化应激(数据待发表)。同时，添加外源性CART能抑制大鼠海马神经元的氧化应激[13]，脑组织的海马体，由于具有高耗氧量、高氧化还原反应、高多不饱和脂肪酸含量和低抗氧化能力等特点，对ROS的积累尤其敏感[14]，是监测生理环境和调节应激反应的重要组织位点[15-16]。以前的报道表明，脑海马是表达具有抗氧化特性神经肽的核心部位[17-18]。其中，神经肽CART已被报道在摄食、能量代谢、神经保护和抵抗脑组织氧化损伤方面发挥着重要的调节作用[18-19]。此外，神经肽CART也被报道参与了雌激素和淫羊藿苷的神经保护作用[13, 20-22]。然而，神经肽CART是否参与了COSs抑制仔猪脑海马氧化应激的作用过程尚未见相关报道。
以往研究表明，铁参与了过氧化氢的催化分解，因此，FeDex可诱导细胞中大量ROS的产生，从而导致细胞氧化应激。肌肉注射FeDex已被报道是诱导新生仔猪和大鼠氧化应激的有效方法[23-24]。因此，本研究基于肌注FeDex诱导构建的氧化应激仔猪模型，以考察COSs防治仔猪脑海马氧化应激的作用效果。并通过检测神经肽CART及凋亡相关蛋白基因在仔猪脑海马的表达水平及相关性分析，以探索神经肽CART是否参与了COSs调节凋亡信号通路防治仔猪脑海马氧化应激的作用过程，为COSs在仔猪养殖生产中的进一步应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试剂COSs(脱乙酰浓度≥93%；分子量(MN)：800~ 1 000；聚合度：2~8)购自大连美伦生物(批号：J0705A)，FeDex购自江西创欣药业集团有限公司(批号：20180704)，水合氯醛(10%)购自中国达茂化学试剂厂(批号：1362)，总蛋白检测试剂盒(BCA法)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)检测试剂盒(羟胺法)、还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、细胞丙二醛(MDA)检测试剂盒(比色法)、过氧化氢(H2O2)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，ECL试剂盒和山羊抗兔免疫球蛋白二抗(H+L)购自维百奥生物科技有限公司，EZ-Buffers H 10×TBST缓冲液和脱脂奶粉购自Sangon Biotech(上海)，RIPA裂解缓冲液和苯甲基磺酰氟(PMSF)购自合肥白鲨生物公司，Bcl-2一抗、Bax一抗和Cleaved Caspase-3一抗均购自中国武汉三鹰公司(批号分别为10003222、00066213、10005594)，山羊抗兔(H+ L)(二抗)购自Affinity公司(批号：56 J9958)，FITC Affi-nipure Goat Anti-mouse IgG(H+L)购自美国Earthox公司(中国)(批号：E032110)，DAPI染色液购自北京四正柏公司(批号：0100-20)。
1.2 试验动物、分组和处理试验动物为25头经产荣昌母猪分娩的25窝(150头)健康新生仔猪。仔猪与母猪在分娩栏中按常规饲养管理进行。室内温度22 ℃±2 ℃，相对湿度60%~70%，光照/黑暗周期12 h/12 h。将25窝荣昌仔猪，共计150头仔猪，随机分为5组(对照组、FeDex组、FeDex+10 mg·kg－1 COSs组、FeDex+50 mg·kg－1 COSs组和FeDex+100 mg·kg－1 COSs组)。每个处理组30头仔猪，每个处理组设置5个重复组(窝)，每个重复组有6头仔猪，其中，雄性3头，雌性3头。仔猪初生重各组间差异不显著。根据前人报道的方法[23, 25-26]，FeDex组以及FeDex+COSs组的仔猪在产后第1天肌肉注射200 mg·kg－1 FeDex，在产后第3天肌肉注射400 mg·kg－1 FeDex以诱导氧化应激。对照组仔猪注射与FeDex组相同剂量的灭菌生理盐水。同时，参考文献[27-28]报道的方法，对FeDex+COSs组仔猪从出生到28日龄，分别灌胃不同剂量的COSs(10、50和100 mg·kg－1 COSs，按体重给予)。每日一次，每次1 mL。对照组和FeDex组仔猪给予相同剂量的无菌生理盐水。每周称一次仔猪体重，以计算平均日增重。仔猪的剖杀已获得西南大学实验动物伦理审查委员会的批准。
1.3 血液和组织采集在出生后第7天，所有仔猪在禁食过夜后对25头仔猪采集前腔静脉血液。其中，每个重复组1头仔猪(雄性，体重接近雄性的平均体重)，每组5头。在4 ℃条件下离心(3 000 r·min-1，10 min)分离的血清立即进行氧化和抗氧化相关指标的检测，以确定对抗氧化效果较好的COSs组仔猪进行麻醉后屠宰取样。随后，于第8天将对照组、FeDex组和FeDex+50 mg·kg－1 COSs组中15头采血仔猪采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后进行剖杀，采集肝、肺、大脑皮质和左侧脑海马，液氮速冻后，于-80 ℃保存备用。其中，对照组、FeDex组和FeDex+50 mg·kg-1 COSs组仔猪的肝、肺和大脑皮质，共15头仔猪进行氧化和抗氧化相关指标的检测。对照组、FeDex组和FeDex+50 mg·kg－1 COSs组仔猪左侧脑海马，共9头仔猪进行细胞凋亡相关基因蛋白水平的研究。对照组、FeDex组、FeDex+50 mg·kg－1 COSs组的9头仔猪右侧脑海马在用磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4，0.1 mol·L-1)冲洗2次后，在4 ℃下用4%多聚甲醛固定，并快速冷冻切片后进行免疫组织化学染色。
1.4 氧化和抗氧化相关指标的测定将待测组织用生理盐水按1∶9的比例在4 ℃下打磨匀浆，离心(3 000 r·min-1，10 min)后取上清液。然后用相应试剂盒比色法测定组织总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)的水平。
1.5 免疫组织化学将仔猪脑海马进行梯度脱水(10%、20%、30%蔗糖)后，包埋于冰冻恒温仪(Lecia CM 1850，Nussloch，德国)上，连续切片，进而将约10 μm厚的切片用于免疫荧光分析。每个冰冻切片用PBS冲洗两次后，在10%正常山羊血清中封闭30 min，在4 ℃条件下与CART (CART山羊抗鼠)抗体(1∶100)孵育过夜。随之，用PBS漂洗3次，每次5 min，然后与FITC亲和山羊抗鼠抗体(1∶200)在室温下孵育2 h，再用4，6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)暗室条件下染色5 min。最后，采用倒置荧光显微镜(IX 53，Center Valley, 美国)观察拍照，并使用Image J软件统计分析整体灰度值。
1.6 Western blot将脑海马提取总蛋白后，用BCA蛋白分析试剂盒进行定量测定。经SDS-PAGE分析后转移到细胞膜上。用5%脱脂奶粉封闭膜，在4 ℃条件下与抗Bcl-2(1∶4 000)、抗Bax(1∶10 000)、抗Cleaved Caspase-3(1∶1 000)一抗孵育过夜，再与山羊抗兔Ig G(H+L)二抗(1∶10 000)在室温下孵育1 h。在荧光成像系统上观察蛋白质水平，并用图像分析工具进行定量分析。
1.7 统计分析所有数值结果均以“平均值±标准差(x±s)”表示。试验数据用SPSS20.0统计软件(IBM; New York City, NY, USA) 进行分析。单因素方差分析(ANOVA)用于组间差异比较分析。双因素方差分析用于考察日期与COSs对仔猪平均日增重的交互效应。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 不同浓度COSs对仔猪血清氧化及抗氧化相关指标的影响与对照组相比，FeDex组仔猪血清的H2O2和MDA水平极显著升高(图 1A、B, P < 0.01)，而GSH和T-AOC水平极显著降低(图 1C、D，P < 0.01)，这表明FeDex诱导了仔猪的氧化应激。与FeDex处理组相比，FeDex和COSs联合处理组仔猪体内的H2O2和MDA水平均极显著低于FeDex组(图 1A、B，P < 0.01)；而FeDex+50 mg·kg－1 COSs组和FeDex+100 mg·kg－1 COSs组的GSH和T-AOC水平(除FeDex+100 mg·kg-1 COSs组GSH)极显著高于FeDex组(图 1C、D，P < 0.01)，但与FeDex组相比，10 mg·kg－1COSs组的GSH和T-AOC水平没有显著性差异(P＞0.05)。FeDex+50 mg·kg－1和FeDex+100 mg·kg－1 COSs组中H2O2水平均极显著低于FeDex+10 mg·kg－1 COSs组，而T-AOC水平均极显著高于10 mg·kg－1 COSs组(图 1A、D，P < 0.01)。且FeDex+50 mg·kg－1 COSs组的GSH水平极显著高于FeDex+ 100 mg·kg－1 COSs组(图 1C，P < 0.01)。由此可见，不同剂量的COSs对仔猪的氧化应激都有不同程度的缓解作用，而灌胃50 mg·kg－1的COSs效果整体优于其他组，因此后续试验主要考察该剂量COSs的作用效果及机制。
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A.H2O2水平；B.MDA水平；C.GSH水平；D.T-AOC水平。柱上标注的字母，a, b, c.P < 0.05，A, B, C.P < 0.01 A. H2O2 level; B. MDA level; C. GSH level; D. T-AOC level. On the column, a, b, c.P < 0.05, A, B, C.P < 0.01 图 1 仔猪血清中的氧化和抗氧化相关指标(n=5) Fig. 1 Oxidation and anti-oxidation related indicators in serum of piglets(n=5) |
与对照组相比，在第1阶段(第1~8天)、第2阶段(第8~14天)、第3阶段(第15~28天)和整个试验期(第1~28天)，FeDex组仔猪的日增重显著低于对照组(P < 0.01)，而FeDex+50 mg·kg－1 COSs组的仔猪日增重显著高于FeDex组(P < 0.01)。双因素方差分析结果显示，日期与COSs处理效应对日增重无显著交互作用(P>0.05)(图 2)。以上结果显示，灌胃50 mg·kg-1的COSs可抑制氧化应激引起的仔猪日增重降低。
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柱上的A、B、C.P < 0.01 On the column A, B, C.P < 0.01 图 2 仔猪平均日增重(n=5) Fig. 2 Average daily gain of piglets (n=5) |
为进一步考察灌胃50 mg·kg－1 COSs防治仔猪氧化应激的作用效果，本研究考察了COSs对仔猪肝、肺、大脑皮质和海马氧化及抗氧化相关指标的影响。表 1结果表明，FeDex组仔猪肝、肺、大脑皮质和海马的GSH和T-AOC水平均显著低于对照组(P < 0.01)，而H2O2和MDA水平显著高于对照组(P < 0.01和P < 0.05)，表明肌注FeDex诱发了仔猪肝、肺、大脑皮质和海马氧化应激。
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表 1 壳寡糖对仔猪组织中氧化和抗氧化相关指标的影响(x±s，n=5) Table 1 Effect of COSs on oxidation and anti-oxidation related indicators in tissues of piglets (x±s, n=5) |
与肌注FeDex的仔猪相比，FeDex和COSs联合处理组仔猪肝、肺、大脑皮质和海马的GSH和T-AOC水平均极显著升高(P < 0.01)，MDA和H2O2水平极显著降低(P < 0.01)。结果表明，灌胃50 mg·kg－1 COSs能显著抑制仔猪肝、肺、海马区和大脑皮层的氧化应激。
2.4 COSs对仔猪脑海马细胞凋亡相关蛋白基因表达的影响为进一步考察50 mg·kg－1 COSs改善仔猪日增重、保护仔猪脑海马免遭氧化应激损伤的分子机制，本研究采用Western blot技术检测了仔猪脑海马Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表达水平(图 3A)。与对照组相比，FeDex组仔猪脑海马Cleaved Caspase-3和Bax的表达水平显著上调(图 3B、C，P < 0.01)，而Bcl-2的表达水平显著下调(图 3D，P < 0.01)。COSs显著降低FeDex处理组仔猪海马Bax和Cleaved Caspase-3的水平，而显著升高了Bcl-2的表达水平(P < 0.01)。以上结果表明，50 mg·kg－1 COSs可下调FeDex诱导的仔猪脑海马凋亡信号通路。
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A.Western blot技术检测Cleaved Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平，β-actin用作内参；B.Cleaved Caspase-3的蛋白质水平；C. Bax的蛋白质水平；D. Bcl-2的蛋白质水平。图柱上的a, b, c.P < 0.05，A, B, C.P < 0.01 A. The expression level of Cleaved Caspase-3, Bax and Bcl-2 genes were measured by Western blot, β-Actin was used as an internal control to normalize protein loading; B: The Cleaved caspase-3 protein level was calculated and plotted. C. The Bax protein level was calculated and plotted; D. The Bcl-2 protein level was calculated and plotted. On the column a, b, c.P < 0.05, A, B, C.P < 0.01 图 3 仔猪海马细胞凋亡蛋白相关基因的表达水平(n=3) Fig. 3 Expression levels of apoptosis relative protein genes in hippocampus of piglets(n=3) |
为了考察神经肽CART是否参与了COSs防治仔猪脑海马氧化应激的作用过程，本研究采用组织免疫荧光技术检测了神经肽CART基因在仔猪脑海马的表达水平。免疫荧光结果显示，如图 4，在FeDex组中(图 4D、E和F)，仔猪脑海马的CART水平(绿色荧光信号)弱于对照组(图 4A、B和C)；而FeDex+50 mg·kg－1 COSs组的CART水平强于FeDex组(图 4G、H和I)。其荧光值量化结果显示，与FeDex组相比，仔猪脑海马的CART水平极显著低于对照(P < 0.01)；而FeDex+50 mg·kg－1 COSs组的CART水平极显著高于FeDex组(P < 0.01)(图 5)。以上结果表明，COSs能有效抑制氧化应激仔猪脑海马CART表达水平的降低。
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A、D和G. DAPI染为蓝色；B、E和H. CART染为绿色；C、F和I. 合并图；A、B和C. 对照组；D、E和F.FeDex组；G、H和I.FeDex + 50 mg·kg－1 COSs组 A, D and G. DAPI staining in blue; B, E and H. CART staining in green; C, F and I. The images are merged; A, B and C. Control group; D, E and F. FeDex group; G, H and I. FeDex + 50 mg·kg－1 COSs group 图 4 免疫荧光图 Fig. 4 Immunofluorescence graph |
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柱上的A、B、C.P < 0.01 On the column A, B, C.P < 0.01 图 5 CART基因的荧光值量化图(n=3) Fig. 5 Fluorescence quantification graph of CART gene (n=3) |
为了考察CART基因的表达水平是否与COSs对凋亡信号通路的调控作用相关，本研究考察了CART基因的表达水平与凋亡相关蛋白基因表达水平之间的相关性。结果显示，在FeDex组(图 6A~6D)，CART基因的表达水平与Cleaved Caspase-3的表达水平呈显著负相关(Pearson系数=-0.991 7；P=0.040 9)，与Bax基因的表达水平呈显著负相关趋势(Pearson=-0.972 4；P=0.074 9)；在COSs组(图 6E~H)，CART基因的表达水平与Cleaved Caspase-3的表达水平呈显著负相关趋势(Pearson=―0.9601；P=0.090 2)，与Bcl-2基因的表达水平呈显著正相关趋势(Pearson=0.984 6；P=0.055 9)，与Bax基因的表达水平则显著负相关(Pearson=－0.995 6；P=0.029 7)，与Bcl-2/Bax的表达水平显著正相关(Pearson=0.995 3；P=0.030 8)。以上结果表明，CART与凋亡相关蛋白基因的表达水平相关，进一步提示CART在COSs调节凋亡信号通路，抑制氧化应激中的介导作用。
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A~D. 在FeDex组，CART与Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax在蛋白表达水平的相关性；E~H.在COSs组，CART与Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax在蛋白表达水平的相关性 A-D. In FeDex group, the correlation between CART and Cleaved Caspase-3, Bcl-2, Bax and Bcl-2/Bax at protein level; E-H. In COSs group, the correlation between CART and Cleaved Caspase-3, Bcl-2, Bax and Bcl-2/Bax at protein level 图 6 神经肽CART与凋亡相关蛋白基因表达水平的相关性分析(n=3) Fig. 6 Correlation between CART and apoptotic related protein gene expression level (n=3) |
由于环境条件的改变、微量元素的补充和病原微生物的感染等常常会破坏自由基产生和抗氧化反应之间的平衡[29-31]，因此，仔猪生长过程中容易受到氧化应激。其中，铁与H2O2的催化分解联系在一起会导致反应性羟基自由基的形成，从而对组织和细胞造成严重的氧化应激[30]。基于自由基介导的氧化应激的生物标记物与体重指数的相关性，已经积累了大量关于铁诱导氧化应激发生的证据[32-33]。作为一种经典的促氧化剂，H2O2水平的增加可以指示氧化应激水平的增加[34]。MDA是ROS攻击嵌入在质膜中的多不饱和脂肪酸的分解产物[35]，因此，MDA水平是脂质过氧化和氧化应激最常用的指标之一。抗氧化防御系统存在于所有生物体中，以减少或防治ROS对组织和细胞造成的氧化损伤。其中，GSH作为主要的抗氧化剂，通过清除O2-、H2O2和其他代谢物，在大多数有氧细胞的抗氧化系统中发挥核心作用[36]。T-AOC水平可代表动物机体的总抗氧化状态。因此，GSH和T-AOC联合检测可以很好地反映细胞和组织的抗氧化状态。在本研究中，FeDex处理仔猪血清中T-AOC和GSH水平显著降低，而MDA和H2O2水平显著升高，表明FeDex处理成功地诱导了仔猪的氧化应激，这与先前的报道一致[21-22, 24, 30-31]。此外，据报道，肝、肺、脑海马和大脑皮质组织和细胞均容易受到不同应激源诱导的氧化应激[37-38]。本研究结果表明，肌肉注射FeDex对仔猪的肝、肺、海马区和大脑皮质均造成了氧化应激。
3.2 壳寡糖对仔猪氧化应激的抑制作用在本研究中，10、50及100 mg·kg－1 COSs灌胃均能抵抗仔猪机体的氧化应激，但仅50及100 mg·kg－1 COSs能显著提高仔猪机体的抗氧化能力。本研究进一步发现，50 mg·kg－1 COSs对仔猪的肝、肺、大脑皮质、脑海马的氧化应激均起到了很好的抑制作用，且能显著提高仔猪的日增重，表明该剂量浓度的COSs能通过抗氧化途径保护仔猪免受FeDex诱导的氧化应激，提高仔猪生长性能。这一结果与以前的报道相似，即COSs对谷氨酸诱导的大鼠海马神经元细胞损伤和铜诱导的大鼠大脑皮质神经元氧化损伤具有抑制作用[12]。饲料中添加COSs可提高断奶仔猪和肉鸡的生长速度[11-12]。
3.3 COSs对神经肽CART和和凋亡/抗凋亡途径相关蛋白基因表达的调节作用细胞凋亡与氧化应激密切相关。氧化应激已被证明通过激活核因子κB(NF-κB)途径在促进细胞凋亡中发挥重要作用[39]。海马神经元的凋亡参与了人类众多的神经系统疾病，如癫痫和抑郁症[40-43]。同时，猪的神经系统疾病也会导致仔猪行为迟缓，生长发育受阻，甚至死亡[44]。因此，为了探讨COSs对仔猪脑海马组织细胞凋亡的调控作用，本研究对仔猪脑海马线粒体相关的凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3的表达水平进行了检测。Caspase级联的激活是多种生物系统中启动细胞凋亡的关键步骤。其中，Caspase-3是导致细胞凋亡的主要执行者[45]。而Bcl-2和Bax可以通过阻止Caspase激活剂的释放和孔的形成来阻止caspase级联的激活和细胞的凋亡[46]。而抗细胞凋亡蛋白Bcl-2已被报道在防治缺氧和慢性应激源暴露引起的神经细胞死亡中发挥重要作用[47-48]。在本研究中，FeDex处理后仔猪脑海马Cleaved Caspase-3和Bax的上调以及Bcl-2的下调证实了氧化应激过程中线粒体相关的Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3通路发生了严重的细胞凋亡，而相似于以往的研究结果[12]，COSs处理抵抗了氧化应激诱导的海马神经元凋亡。中枢神经系统中抗氧化防御的保护系统也与氧化还原敏感基因表达的调节有关[49]。先前的研究表明，与对照组仔猪相比，氧化应激仔猪海马神经肽CART基因的表达下调[24]，表明仔猪脑海马抗氧化应激能力下降。而外源性神经肽CART的添加能通过增加Bcl-2的表达和抑制Cleaved Caspase-3的激活来减轻海马神经元的凋亡途径，从而发挥保护作用[50]。在本研究中，50 mg·kg－1 COSs阻碍了氧化应激引起CART基因表达水平下调，提示CART参与了COSs的抗氧化应激和抗凋亡过程，这与之前的相关报道相似，CART作为作用于海马神经元线粒体的潜在抗氧化剂，参与了淫羊藿苷对β-淀粉样蛋白神经毒性的抑制[21]。
4 结论灌胃50 mg·kg－1 COSs可抑制仔猪氧化应激，提高仔猪日增重。并显著提高脑海马神经肽CART基因的表达水平和减轻凋亡信号通路，且CART与凋亡/抗凋亡相关基因的表达水平显著相关。由此提示，COSs可能通过提高神经肽CART基因的表达水平来减轻海马组织细胞的凋亡，从而抑制氧化应激。
致谢: 本研究得到了中央高校基础研究基金(编号：XDJK2020B014)、重庆市留学人员创业创新支持计划(批准号：Cx2018096)、重庆市生猪产业技术体系创新团队和国家生猪技术创新中心(NCTIP-XD/C17)资助。
伦理声明
作者确认，该杂志的伦理政策，如杂志的作者指南页面上所述，已得到遵守，并已获得西南大学实验动物伦理审查委员会的批准。
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(编辑 白永平)