, GAO Yulong, LI Kai
鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法囊病病毒(IBDV)引起的主要感染雏鸡的一种急性、高度接触性和免疫抑制性传染病[1-3]。该病于1957年首发于美国甘布罗地区，又被称为“甘布罗病”。60多年来，该病一直威胁着养禽业的发展，世界动物卫生组织认为IBD已成为影响社会经济的重要疾病[4-6]。抗原变异、免疫抑制，特别是超强毒株(vvIBDV)的出现，使得该病的防控形势更加严峻[7-9]。IBDV基因组由两个双股RNA节段组成，分别为A节段和B节段。A节段编码的VP2蛋白构成病毒的外衣壳，是IBDV的主要结构蛋白。VP2可以诱导机体产生中和抗体，是IBDV主要的宿主保护性抗原[10]。目前，IBD主要通过传统活疫苗和灭活疫苗进行防控，但活疫苗免疫效果易于受到母源抗体干扰，中毒力活疫苗会造成接种鸡法氏囊损伤，引起免疫抑制；灭活疫苗免疫持续期较短，需多次加强免疫[11]。因此研制安全性好、不受母源抗体干扰、免疫持续期长的新型基因工程疫苗对IBD的防控具有重要意义。
鸡马立克病(MD)是由马立克病病毒引起的一种鸡的传染性肿瘤病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征，该病是鸡的主要疾病之一，也是国内外20世纪50年代以来最受重视的鸡病[12-14]。火鸡疱疹病毒(HVT)在国内外被广泛用于MD的防控。HVT基因组较大，可供外源基因插入的复制非必需区多，是构建重组活载体疫苗的理想载体[15-18]。本研究利用HVT多片段黏粒拯救系统和LR重组技术，将IBDV VP2基因表达框架插入HVT基因组，构建了表达VP2基因的重组病毒rHVT-VP2，并对其体外生物学特性进行了分析，为研制IBD重组HVT活载体疫苗奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 质粒、菌株和病毒pCI载体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存；pENTR入门载体、克隆有Kan/ccdB基因的重组黏粒H3-Kan/ccdB、克隆有HVT-FC126株基因组片段的5个重组黏粒H1、H2、H3、H4、H5由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建并保存。大肠杆菌EPI300株购自EPICENTRE公司；IBDV超强毒株HLJ0504株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所鉴定并保存。
1.2 主要试剂常规PCR反应酶、限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa公司；Gateway®LR ClonaseTM II Enzyme Mix和磷酸钙转染试剂盒均购自Invitrogen公司；质粒中提试剂盒购自QIAGEN公司；细胞裂解液，购自碧云天公司；细胞培养基及胎牛血清购自Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)购自BioFroxx公司；鼠抗兔IgG-FITC、IRDye-800标记的羊抗兔IgG，购自Licor公司；VP2单克隆抗体(MAb)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备并保存。
1.3 引物的设计与合成根据IBDV超强毒HLJ0504株VP2基因序列，利用Oligo 7.0软件设计扩增VP2基因的引物VP2F：5′- GAA TTC GCC ACC ATG ACA AAC CTG CAA GAT CAA ACC -3′和VP2R：5′- ATC GAT TCA CCT CCT TAA GGC CCG AAT TAT GTC -3′，预期扩增片段长度为1.4 kb。根据HVT FC126株基因组序列设计1条引物H45R：5′- ATA AAT AAA ACA CAG TAA CCG TTA-3′，VP2F和H45R组成1对引物，用于鉴定重组黏粒及重组病毒，预期扩增片段长度为1.6 kb。引物均由吉林省库美生物公司合成。
1.4 表达VP2基因的重组粘粒的构建及鉴定以IBDV HLJ0504株基因组为模板，利用引物VP2F、VP2R经RT-PCR扩增获得VP2基因。将纯化后的VP2基因经EcoRⅠ、KpnⅠ酶切后克隆入pCI载体，构建重组质粒pCI-VP2。将该重组质粒经BglⅡ、BamHⅠ酶切后获得VP2表达框架，将其克隆入pENTR入门载体的BglⅡ、BamH1位点，获得含有VP2表达框架的重组入门质粒pENTR-VP2。将pENTR1-VP2与重组黏粒H3-Kan/ccdB均稀释至300 ng·μL－1，各取1与2 μL的Gateway LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix混合，置于室温作用1 h。将反应产物转化大肠杆菌EPI300并涂布在氯霉素抗性LB平板上，37 ℃过夜培养。挑取平板上的单个菌落加入氯霉素抗性LB液体培养基中扩大培养，提取黏粒，用引物VP2F、H45R经PCR鉴定重组黏粒是否插入VP2表达框架，并对PCR产物测序鉴定，鉴定正确的重组黏粒命名为H3-VP2。
1.5 表达VP2基因的重组HVT的拯救及鉴定利用质粒提取试剂盒提取VP2重组黏粒H3-VP2以及其他4个克隆有HVT基因组片段的亲本黏粒H1、H2、H4、H5，通过磷酸钙法将5个经SbfⅠ酶切线性化的黏粒共转染CEF细胞，4 ~5 d后，观察转染的细胞是否出现HVT特异性蚀斑病变。出现蚀斑后收获病毒，并在CEF细胞中连续传20代。利用试剂盒提取第5、10、15、20代重组病毒的基因组DNA，同时设亲本病毒基因组DNA对照，利用引物VP2F/H45R经PCR鉴定，并测序鉴定，鉴定正确的重组病毒命名为rHVT-VP2。
1.6 重组病毒rHVT-VP2表达VP2蛋白的检测将第20代重组病毒rHVT-VP2与亲本病毒分别接种CEF，培养3~4 d出现蚀斑病变后，用无水乙醇固定细胞，并以VP2蛋白MAb(1∶400)作为一抗，以FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶200)作为二抗，采用间接免疫荧光试验(IFA)鉴定VP2蛋白的表达。同时，以VP2蛋白MAb(1∶500)作为一抗，以IRDye-800标记的羊抗鼠IgG(1∶10 000)作为二抗，采用蛋白质印迹试验(Western blot)鉴定VP2蛋白的表达。以上试验均以亲本病毒接毒的CEF作阴性对照。
1.7 重组病毒rHVT-VP2体外生长曲线的测定将重组病毒rHVT-VP2和亲本病毒HVT-FC126株以100个蚀斑形成单位(PFU)的剂量接种于48孔板中的CEF上，感染后每隔24 h收集含毒细胞，持续至感染后144 h。将各个时间点所收集病毒接种CEF，测定各时间点病毒液的蚀斑数目，绘制生长曲线，分析重组病毒rHVT-VP2和亲本病毒在CEF中的体外复制特性。
1.8 重组病毒rHVT-VP2免疫原性检测取1日龄SPF鸡40只，分成4组，每组10只。组1和组2分别以4 000 PFU·只-1剂量颈部皮下接种重组病毒rHVT-VP2和亲本病毒HVT-FC126；组3和组4不接种，作为对照组。免疫后28 d，组1~组3试验鸡分别采血，分离血清，检测IBDV中和抗体[11]；组1~组3试验鸡经滴鼻、点眼途径接种IBDV超强毒HLJ0504株(0.1 mL·只-1)，组4不攻毒作为健康对照。攻毒后观察7 d，统计各组鸡存活情况。
2 结果 2.1 表达VP2基因的重组黏粒的构建及鉴定将RT-PCR扩增获得的VP2基因插入到pCI载体，构建获得重组真核表达质粒pCI-VP2。通过酶切获得VP2基因表达框架并将其克隆至pENTR入门载体，构建获得重组入门质粒pENTR-VP2。通过LR重组反应，使VP2表达框架替换H3-Kan/ccdB中的Kan/ccdB筛选基因并克隆至HVT重组黏粒H3中，构建获得在HVT基因组UL45和UL46基因之间插入VP2基因表达框架的重组黏粒H3-VP2。用VP2F、H45R对重组黏粒进行PCR及测序鉴定，结果显示，获得的PCR产物长度为1.6 kb(图 1)，测序结果显示，PCR产物包含VP2基因和VP2表达盒下游polyA序列。而阴性对照样品(亲本黏粒H3)无VP2基因插入序列，PCR结果为阴性。以上结果表明，重组黏粒H3-VP2构建正确。
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M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1.H3-VP2; 2.H3; 3.ddH2O M.DL2000 DNA marker; 1.H3-VP2; 2.H3; 3.ddH2O 图 1 重组黏粒H3-VP2 PCR鉴定 Fig. 1 Identification of recombinant fosmid H3-VP2 by PCR |
将重组黏粒H3-VP2与其他4个克隆有HVT基因组片段的重组黏粒H1、H2、H4、H5共转染CEF，转染后4 d出现HVT特异性蚀斑病变，拯救获得重组病毒rHVT-VP2。将重组病毒在CEF上进行连续传代，每隔5代提取病毒基因组DNA进行PCR鉴定及测序。结果表明，PCR产物长度均为1.6 kb，与预期结果相符(图 2)，测序结果显示，插入序列与预期一致。亲本病毒HVT-FC126株基因组DNA扩增结果为阴性。以上结果表明，VP2基因正确插入HVT基因组中且能够稳定存在，重组病毒rHVT-VP2构建正确。
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M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1.rHVT-VP2_F05; 2.rHVT-VP2_F10; 3.rHVT-VP2_F15; 4.rHVT-VP2_F20; 5.HVT-FC126; 6.ddH2O M.DL2000 DNA marker; 1.rHVT-VP2_F05; 2.rHVT-VP2_F10; 3.rHVT-VP2_F15; 4.rHVT-VP2_F20; 5.HVT-FC126; 6.ddH2O 图 2 不同代次重组病毒rHVT-VP2 PCR鉴定 Fig. 2 PCR identification of different generations of recombinant virus rHVT-VP2 |
将第20代重组病毒rHVT-VP2与亲本病毒分别接种CEF，培养3~4 d出现蚀斑病变后进行IFA和Western blot，检测VP2蛋白表达情况。结果显示，重组病毒rHVT-VP2感染的细胞与VP2单克隆抗体反应，可见绿色荧光信号；HVT亲本病毒以及没有接毒的对照细胞未见荧光(图 3)。Western blot试验结果显示，重组病毒rHVT-VP2感染的细胞中可以检测到VP2蛋白的表达，表达蛋白大小约50 ku，大小与预期相符(图 4)。HVT亲本病毒以及没有接毒的对照细胞未检测到VP2蛋白表达，对照蛋白β-actin在重组病毒rHVT-VP2、亲本病毒以及未接毒对照中均检测到表达。以上结果表明重组病毒rHVT-VP2可在感染细胞中稳定表达VP2蛋白。
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图 3 间接免疫荧光试验检测重组病毒(rHVT-VP2)和亲本病毒(HVT-FC126)感染CEF中VP2蛋白表达情况 Fig. 3 The VP2 expression results in CEFs infected with recombinant virus rHVT-VP2 or parental virus HVT-FC126 using IFA test |
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M.蛋白质相对分子质量标准；1.HVT-FC126;2.rHVT-VP2;3.细胞对照 M.Protein marker; 1.HVT-FC126;2.rHVT-VP2;3.Mock 图 4 蛋白质印迹试验检测重组病毒(rHVT-VP2)和亲本病毒(HVT-FC126)VP2蛋白表达情况 Fig. 4 The VP2 expression from recombinant virus HVT-VP2 or the parental virus HVT-FC126 by Western blot test |
将重组病毒rHVT-VP2和亲本病毒HVT-FC126以100 PFU接种CEF，每隔24 h收集细胞，滴定病毒的体外复制动力学曲线。结果显示，重组病毒rHVT-VP2与亲本病毒HVT-FC126均在感染后120 h复制滴度达到最高峰，分别为1.96×106 PFU·mL－1和2.10×106 PFU·mL－1，感染CEF后各个时间点重组病毒的滴度与亲本病毒均无明显差异(P＞0.05)(图 5)。以上结果表明重组病毒rHVT-VP2株在CEF中的复制特性与亲本病毒一致。
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图 5 重组病毒(rHVT-VP2)和亲本病毒(HVT-FC126)在CEF上的复制动力学曲线 Fig. 5 Growth curve of recombinant virus rHVT-VP2 and parental virus HVT-FC126 in CEFs |
将重组病毒rHVT-VP2以4 000 PFU·只－1剂量接种1日龄SPF鸡，免疫后28 d采血，分离血清，检测IBDV中和抗体。结果如图 6所示，重组病毒rHVT-VP2免疫鸡血清中IBDV中和抗体平均滴度可以达到26.4，免疫亲本病毒HVT-FC126的鸡以及不免疫对照鸡IBDV中和抗体为阴性。以上结果表明，重组病毒rHVT-VP2免疫雏鸡后诱导产生了良好的免疫反应。免疫后28 d，对免疫组和对照组分别攻毒，结果显示免疫重组病毒rHVT-VP2的10只鸡攻毒IBDV后有9只鸡健康存活，亲本病毒HVT-FC126免疫组和对照组攻毒IBDV后均表现出明显临床症状，10只鸡死亡8只(图 7)。以上结果表明，重组病毒rHVT-VP2免疫后对IBDV强毒攻击能够提供90%的免疫保护。
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图 6 重组病毒rHVT-VP2免疫后IBDV中和抗体检测 Fig. 6 IBDV Virus neutralization antibody titers induced by rHVT-VP2 in chickens |
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图 7 重组病毒rHVT-VP2免疫鸡攻毒IBDV强毒的存活率 Fig. 7 Survival rate of rHVT-VP2-vaccinated chickens after IBDV challenge |
IBD是一种严重危害养禽业的高致死性和免疫抑制性传染病，自1957年发现以来，已有60多年历史[1-3]。目前，用于预防IBD的疫苗主要是传统活疫苗和灭活疫苗，其中弱毒活疫苗免疫效果易于受到母源抗体干扰，中毒力活疫苗副作用大，能够引起接种鸡法氏囊损伤和免疫抑制，影响其他疫苗免疫保护效果[19]。全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗不适于早期免疫且免疫持续期短，需要多次加强免疫，造成养殖环节免疫负担过重[20]。因此，研制安全性好、适于孵化场出壳免疫且免疫持续期长的新型疫苗对我国IBD的防控意义重大。活载体疫苗诱导机体产生的免疫比较广泛，可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，是当今和未来疫苗研发的主要方向之一[16]。HVT作为一种疱疹病毒，具有基因组大、复制非必需区多且能容纳较大外源片段的优势，是研制活载体疫苗的理想载体。然而，目前我国还没有自主知识产权的IBD重组HVT活载体疫苗。
以往构建重组HVT大多采用同源重组法或细菌人工染色体(BAC)法[21]。同源重组法以及近年来新兴的CRISPR/Cas9方法在构建重组病毒过程中均需要引入筛选标记基因，且需要蚀斑纯化，难以短时间内获得纯净的重组病毒，多次细胞传代纯化蚀斑也会影响重组病毒免疫原性。BAC技术虽然能够在细菌中利用Red/ET重组技术对病毒基因组进行改造，进而拯救重组病毒，但后期需要采取一定的手段去除残留的BAC序列[13]。本研究在拯救表达VP2基因的重组HVT时采用了新型Fosmid黏粒拯救系统，该系统与BAC相比，具有稳定性好、无偏向性、构建周期短等诸多优点。由于HVT基因组分为不同节段克隆入黏粒中，在构建重组病毒时便于对不同的基因组片段分别进行操作，因此该系统更加适于插入多个外源基因的重组病毒的构建。
本研究将IBDV保护性抗原VP2基因表达框架插入HVT基因组UL45、UL46基因之间，构建获得重组病毒rHVT-VP2。rHVT-VP2在CEF传代20代后仍然能够高效表达VP2蛋白，且插入序列未见突变发生，表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。体外复制动力学曲线显示，rHVT-VP2在CEF上具有良好的复制能力，复制特性与亲本病毒无显著差异，表明VP2基因的插入不会对亲本病毒的复制造成显著影响。将重组病毒rHVT-VP2免疫雏鸡后可以诱导产生IBDV中和抗体，且能够对IBDV超强毒株攻毒造成的死亡提供90%免疫保护，表明该重组病毒具有良好的免疫原性。以上研究表明，重组病毒rHVT-VP2有望开发为一种预防IBD的新型疫苗。
4 结论本研究应用HVT新型Fosmid黏粒拯救系统，构建获得表达IBDV保护性抗原VP2的重组病毒rHVT-VP2。rHVT-VP2插入序列正确，能够稳定表达VP2蛋白，在CEF上具有良好的复制能力，免疫鸡后能够诱导产生IBDV中和抗体，并对IBDV强毒攻击提供良好免疫保护。重组病毒rHVT-VP2的成功构建为IBD重组HVT活载体疫苗的研制奠定了基础。
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(编辑 白永平)