2. 青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109
2. College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
我国是全球规模最大的生猪养殖国，也是全球最大猪肉进口国，占全球猪肉进口量近四成[1]。猪是我国最重要的经济动物之一[2]，猪肉占我国国内猪牛羊禽肉总产量的60%，然而近年来，猪传染病对我国养猪业造成了巨大危害，如非洲猪瘟、口蹄疫和蓝耳病等。其中，蓝耳病是指猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，是我国重点防控的一类动物疫病。
1987年PRRS在美国被首次发现。随后在1992年美国明尼苏达州圣保罗举行的第一届SIR/PRRS国际研讨会上，“猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)”及其病毒“猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)”被正式冠名。PRRSV被归列为尼多病毒目(Nidovirales)，动脉炎病毒科(Arteriviviridae)，动脉炎病毒属(Arterivirus)[3]，是一种单股正链RNA病毒[4]，具有高度的遗传多样性，因此被进一步分为两种，即PRRSV-1(原欧洲Ⅰ型)和PRRSV-2(原北美Ⅱ型)[5]，每个基因型包含数千种遗传和抗原异源毒株。目前研究发现，PRRSV只对猪造成感染，主要靶向猪肺泡巨噬细胞(pulmonary alveolar macrophages, PAMs)及其衍生细胞系。由于病死猪呈特征性耳朵发绀现象，因此该病又被称为蓝耳病。自1995年PRRS在中国爆发以来，流行毒株复杂多样，给我国养猪业带来了巨大损失。2006年6月爆发的高致病性蓝耳病(HP-PRRS)给我国造成的经济损失高达100亿人民币，成为危害我国乃至全球养猪业的重要疫病之一[6-7]。目前，针对PRRSV的研究尚不够透彻，疫苗等防治方法有限，导致PRRS治疗效果不佳，因此本文旨在回顾并总结目前PRRS抗病育种的研究进展，为深入研究PRRSV致病机制和未来开发PRRS抗病品种提供理论依据。
1 临床症状与致病机制 1.1 临床症状与病理变化PRRS主要表现为严重的生殖与呼吸系统症状，常引发高热、精神沉郁、厌食等症状，感染猪群表现高死亡率和高发病率。不同年龄猪均表现出对PRRS的易感性，但临床症状表现不同，并且对仔猪和怀孕母猪影响最严重[8]。仔猪感染后几乎均会发病，主要表现为体温升高、腹泻、贫血和黄疸，病情发展到后期皮肤发绀、呼吸不畅，病死率可达85%[9-10]；母猪急性感染后体温升高，精神不振，出现心跳、脉搏加速以及呼吸症状，怀孕母猪发病3~5 d后即可终止妊娠，出现流产或早产现象，流产率高达50%~70%，生出的也多为死胎、木乃伊胎等[8]；母猪慢性感染后逐渐消瘦、体质变差，且伴随呼吸症状，病程较长者耳朵、四肢发绀，发病母猪若缺乏科学护理，会导致病情加重甚至死亡。公猪症状较轻，持续时间短，主要表现为咳嗽、打喷嚏，食欲降低、昏睡、呼吸不畅，并可见精液质量下降。
致病猪病理剖检有明显病变，气管及肺部病变最为严重，胸腔内大量积液[11]。肺部肉眼可见水肿、出血，肺门淋巴结肿大，气管、支气管充满泡沫性物质，呈特征性弥漫性间质性肺炎和肺水肿[12-13]；脾肿大，边缘及表面有发黑、变硬、梗死；肾有肿大，表面有坏死灶，包膜下有大量点状出血，颜色异常；心脏内膜充血，心包内大量积液；扁桃体及身体各处淋巴结出血和肿大。细菌性感染常继发于PRRS，可在肺、脾、肝等处发现黏连或菌斑等。
1.2 致病机制动脉炎病毒科的成员以生物体内的特定细胞为宿主，猪是PRRSV已知的唯一动物宿主[14]，PRRSV通过呼吸道、接触或交配等多种途径进入猪体内，PAMs是其主要靶细胞[15]。感染后PRRSV立即在体内大量复制，12 h左右即可进入血液引发病毒血症，继而扩散到全身，感染机体各器官及免疫系统内的单核-巨噬细胞，使机体出现临床症状。
经证明，硫酸乙酰肝素(heparan sulphate，HS)[16]、CD163(cluster of differentiation 163)和唾液酸黏附素(sialoadhesin，Sn)[17]是介导PRRSV入侵猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的主要表面受体[18]。PRRSV在感染靶细胞时，先黏附并聚集于受体细胞表面，通过细胞膜胞吞过程进入受体细胞。HS主要促进PRRSV在PAMs表面的黏附、富集[19]，完成富集后的病毒与Sn共价结合，被内吞入受体细胞形成包涵体，并在CD163蛋白的介导下完成衣壳裂解，在胞内完成病毒基因组RNA的释放[17, 20]。被释放的病毒基因组首先在胞内合成多种非结构蛋白(non-structural proteins，Nsps)[21]，这些Nsps合成的基因组RNA和信使RNA，用于翻译为病毒主要结构蛋白和次要结构蛋白，其中最重要的N蛋白与基因组RNA装配为新的核衣壳复合物[22-23]，经内质网或高尔基体包被囊膜蛋白，最终通过胞吐扩散出去，继续黏附下一个受体细胞。
PRRSV感染后在机体内大量复制，机体呈多种反应。首先，PRRSV复制可引发体内炎性因子活性增强，通过血液循环到达中枢神经体温调节中枢，引发机体产热，体温异常升高。第二，PRRSV引起的肺泡毛细血管内皮细胞死亡脱落，肺部气体交换功能受损，致使呼吸急促[24]。第三，血液中血红蛋白含量增多引发血液循环异常，致使皮肤出现发红发绀。第四，内皮细胞感染还会引发怀孕母猪的脐动脉炎，造成胎猪营养不良、早产及死胎[25]。此外，PRRSV对肺部的感染和损害使机体产生免疫抑制，容易引发例如猪瘟、猪圆环病毒等其它病毒性或细菌性的继发感染[23]，从而进一步增进症状的发展，提高死亡率。
2 猪PRRS抗病育种抗病性是指动物体内抑制入侵病原体生长的能力，它受宿主免疫系统、宿主遗传和病原体相互作用的影响。抗病育种，是通过定向选择或改变家畜某个特定基因型以产生对某些疾病具有抗性的新品种。
2.1 猪PRRS抗病性遗传差异猪不同品种或种群对PRRS抗性具有天然遗传差异。1998年，Meng等[26]初次发现猪对PRRS的抗性具有遗传差异的证据，他们发现与梅山猪相比，杜洛克猪在感染PRRSV后表现出较低的性能以及肺部病变严重程度和抗体滴度的增加。Petry等[27-28]发现瘦肉型猪种(杜洛克和汉普夏)比选育的高繁品系更容易感染PRRSV。Ait-Ali等[29]通过对比5种商业猪品系发现，长白猪肺泡巨噬细胞在体外对PRRSV感染具有先天免疫反应。并且在上述研究中发现CD169、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL)-8的表达水平和分布是影响猪对PRRSV抗性的关键因素。这些研究证明PRRS抗性在不同品种或者种群猪之间存在显著遗传差异。因此，选择或培育对PRRSV具有更高抵抗力的新品种猪，以替代常规抗PRRS疗法，是帮助解决疫苗低效和大量使用抗生素问题的有效手段。
2.2 定向选择最为常见的抗病育种手段是通过资源库筛选培育抗逆性和抗病性强的个体，经人工选育获得抗病新品种。但是迄今为止这种基于自然抗性而进行遗传选择的成功案例十分有限，PRRS宿主遗传学联盟(PHGC)自2007年成立起，就通过对保育猪进行大型试验性感染来研究宿主对PRRSV感染反应的遗传基础[30]，但是尚未鉴定出对PRRS具有完全天然抗性的猪[31]，这可能是由于病毒具有较高的遗传多样性[32-33]。此外，大量证据表明猪在应对病原体入侵或免疫系统受到挑战时会发生遗传变异[34-36]。因此，可以将选择后的表型与经过筛选追踪到的SNP位点，在基因型上筛选出编码对某些病原体具有抗性的候选基因[27]。
最初，数量性状基因座(QTL)分析和全基因组关联研究(GWAS)用于识别与PRRS表型相关的染色体区域、相关基因及其关键SNP突变位点，然后研究PRRSV感染后抗体反应和差异表达基因(DEG)，通过在易感和抗病猪中的基因表达水平差异来筛选基因。这种技术可能有助于我们更加深入理解宿主与PRRSV的相互作用，对抗病基因型选择提供新的思路。
2.3 分子遗传育种分子生物学和基因工程技术飞速发展，分子遗传育种成为猪抗病育种的新方法。PRRS的高致病性和高致死率不仅影响生产效益，对食品安全和公众健康也具有重大威胁，并且传统药物治疗和疫苗预防都无法产生良好疗效。因此随着研究不断深入，PRRSV感染机制逐渐清晰，结合分子遗传学进行抗病育种的效果更为显著。近年来，利用RNA干扰(RNAi)、抗病毒酶转基因技术、基因编辑技术对PRRS抗病进行了研究[37-38]。例如，对已确定的在PRRS发病机制中占据关键位置的关键基因进行修饰。
2014年，Whitworth等[39]首次使用CRISPR/Cas9技术对猪细胞进行基因编辑，生产出敲除CD163的基因编辑猪，并发现它们能完全抵抗PRRSV分离株NVSL 97-7895的感染[32]，这被视为现代猪育种的一个里程碑。
2.3.1 CD163 CD163是富含半胱氨酸的清道夫受体(SRCR)超级家族的成员，在来自单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞上限制性表达[40-41]，仅在活化的组织巨噬细胞中表达。多项研究报道，CD163是PRRSV感染的必需受体[42]，而清道夫受体富含半胱氨酸的结构域5(SRCR5)是病毒识别的核心结构域[43-46]。CD163最主要的一个功能是其作为受体介导的内吞作用，将细胞外底物输送到清道夫细胞的内切酶体和溶酶体，以进行细胞内代谢和激活配体特异性信号通路，诱导促炎细胞因子的产生[47]。
细胞水平上的研究发现，在BHK-21、PK-15等多种不易感PRRSV的细胞系中过表达CD163，均使此细胞系对PRRSV变得易感[43, 48]，同样的，易感细胞中CD163下调，能够完全阻断PRRSV感染[49]。2016年，CD163的作用率先在Whitworth等[32]的基因编辑试验中得到证实，他们利用CRISPR/Cas9技术生成靶向CD163基因SRCR5域敲除猪，该猪对Ⅱ型PRRSV感染具有完全抗性。随后，许多实验室针对CD163进行编辑，均产生了多种PRRSV抗性猪。例如，用人CD163L1的SRCR8结构域替换猪CD163的SRCR5域对Ⅰ型PRRSV产生了抗性[50]；删除SRCR5结构域使猪对两种基因型PRRSV均产生了抗性[51]，抑或是产生了能抗HP-PRRSV的杜洛克猪[52]；还有报道，删除SRCR5的LBP区域产生了Ⅱ型PRRSV抗性猪[53]。这些研究充分证明了CD163基因是猪抗PRRS的关键基因，有助于产生抗PRRSV的猪新品种，从而减轻猪患病症状、充分减少经济损失。
2.3.2 HDAC6 组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一组能够诱导组蛋白去乙酰化来调控一系列生物学效应的酶[54]，包括染色质重组、转录活化与抑制、细胞分化与调亡等过程。HDACs通常仅有一个催化结构域，能对细胞核内与染色体结合的组蛋白去乙酰化，从而调控基因的表达。HDAC6是组蛋白HDACs家族一个重要成员，但与普通HDACs不同，结构上，HDAC6蛋白分子含有2个催化结构域和一个锌指结构域，使其拥有了功能上的特殊性，即除了调控组蛋白的乙酰化水平外，对胞质中非组蛋白例如α-微管蛋白等的去乙酰化过程同样具有调节作用，从而对细胞的迁移、抗病毒等方面发挥重要作用[55-57]。可以通过多种机制阻止病毒入侵[58]、抑制病毒包装、加速被感染细胞的清除[59]以及促进干扰素表达[60]等过程，实现对多种病毒的抗性。并且，体外及体内试验证实，HDAC6过表达增强了细胞及小鼠抗病毒能力。
有研究者通过体细胞核移植(SCNT)生产出了过表达HDAC6的转基因猪，并且体外和体内试验均证实了其对PRRSV具有较强的抗性，这种过表达可以稳定遗传至下一代[38]。值得一提的是，HDAC6过表达抑制了由PRRSV感染的MARC-145和PAMs中α-微管蛋白(actub)乙酰化水平升高，这表明HDAC6和细胞骨架可能确实参与了PRRSV体内免疫反应，这为抗PRRS提供了一种全新的思路。
2.3.3 CD169 唾液酸粘附素Sn，又名SIGLEC1或CD169，是一种跨膜蛋白，属于与免疫球蛋白样凝集素结合的唾液酸家族。CD169在巨噬细胞上表达，通过与红细胞、中性粒细胞、单核细胞、NK细胞、B细胞、T细胞等细胞上的唾液酸配体结合，在细胞的相互作用中发挥作用。
用CD169转染CD169阴性细胞(例如PK-15)足以介导病毒内化，但细胞与抗CD169单克隆抗体(mAb)一起孵育可阻断PRRSV的结合和内化[61]，并且从病毒体表面去除唾液酸或将病毒与唾液酸特异性凝集素预孵育也可阻断感染[62-64]。因此，Van Breedam等[65]基于体外PRRSV表面唾液酸的结合，假设CD169是巨噬细胞表面上PRRSV附着和内化为巨噬细胞所需的受体。然而，2013年Prather等[66]的研究结果证明了CD169基因的表达不是感染PRRSV所必需的，并且通过基因敲除引起CD169缺失获得的猪，在感染PRRSV后发生PRRSV病毒血症的程度与野生型猪相似，被证明不具备抗蓝耳病的能力。
3 基因组编辑 3.1 基因编辑工具及其优势与局限基因编辑是一种可以精确修改几乎任何特定基因序列的生物技术。目前，基因编辑工具主要包括锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)和成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)3种系统。ZFN制备成本高、技术困难、所需时间长，应用一直较为局限，相比而言TALENs制备过程更简单，特异性更高[67]。而Cas9蛋白被发现能在CRISPR RNA(crRNA)引导下造成特异性的双链DNA断裂(doublestrand break, DSB)，并且可以同时靶向多个位点[68-69]。麻省理工和哈佛大学的张锋团队首次展示了CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞基因组编辑中的应用，其构建与使用十分简便，仅需Cas9蛋白和向导RNA(sgRNA)，载体构建时间短，基因编辑效率很高[70]。CRISPR/Cas9系统改变了畜牧业中转基因动物生产的困境，其高效、稳定、成本低的优势开启了这项技术在哺乳动物基因组编辑中的应用。
3.2 基因组编辑对猪育种的意义中国家猪驯化已有近一万年历史，对其品种的改良一以贯之。传统的人工选择通过杂交培育动物新品种所需周期长、内容繁琐，主要被用于猪生产性能改良。而基因修饰技术的成功建立大大缩短了动物育种时间。与啮齿类模式动物相比，猪在体型及器官大小、解剖学、生理学和代谢水平等方面均与人更相近，而与非人类灵长动物相比，以猪为动物模型成本低、世代间隔短，胚胎操作技术相对成熟，可以弥补啮齿动物与非灵长动物作为模式动物的不足。
遗传修饰育种缩短了产生稳定遗传新品种猪的时间，并且可以引入物种本身不具有的基因或性状，是传统的品种改良无法实现的。在高效的基因编辑技术建立之前，传统的引发同源重组的方式效率低，产生的基因编辑猪较少，而基因编辑技术的建立加速了猪新品种制备，在提高产肉量、饲料转化率、产仔数、肉质以及抗病能力等方面取得了大量成果，这项技术在特定位点引发的DSB将同源重组概率提高了上百倍[71]，快速影响目标性状关键基因，大大缩短了育种时间。目前，基因编辑在猪育种中主要应用在改良生产性状和生物医学研究两大方面[72]，而近年来，基因编辑猪的研究为正等待器官移植患者的器官供体提供了更多可能性[73]。
4 PRRS抗病育种的不足与发展方向培育抗病猪可能是抵抗PRRS的最终途径，PRRS抗病品种可以有效降低种群内和种群间的感染，进而降低发病率、提高生产性能和产品质量、减少抗生素使用以及增加动物福利。然而，在抗病育种技术发展的早期阶段，社会对基因编辑产品接受程度普遍较低，监管薄弱，道德和法律层面也会出现例如专利等许多未知的问题。因此，目前对诸如CD163基因敲除猪等抗PRRS的成功案例，需要更多研究深入验证其对猪体内平衡、防御和免疫等方面的影响。可以清楚知道的是，无论何种技术的应用，都将改善感染猪群的大范围死亡状况，对动物福利、生产性能、抗生素使用和消费者保护产生重大影响[74]。
5 结语尽管现有的PRRS抗病育种研究还不够透彻，但与疫苗接种和传统人工选育的效果相比，它仍具有高效的优势并取得了显著成果。随着PRRS致病机制研究的深入、基因编辑技术的准确率和安全性的提高，将有望产生对PRRS具有抗性的新品种猪。
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(编辑 郭云雁)