2. 广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室, 广州 510642;
3. 广东省宠物工程技术研究中心, 广州 510642
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Prevention and Control for Severe Clinical Animal Diseases, Guangzhou 510642, China;
3. Guangdong Technological Engineering Research Center for Pets, Guangzhou 510642, China
慢性疼痛为持续或者反复发作时间超过3个月，与潜在或实际组织损伤有关的不良情感体验。因发生率高，病因复杂，机制尚未明晰，目前尚无科学有效的干预措施，慢性疼痛已成为威胁健康的关键因素之一[1-3]。科学干预是使“疼痛最小化”唯一途径[4]，药物干预是兽医临床慢性疼痛治疗的主要方法，虽可抑制疼痛反应，但尚存在不同程度的不良反应。
慢性疼痛过程涉及多种介质[5]，Nav1.8作为电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channels, VGSC)的一种亚型，在慢性疼痛过程参与度较高，优先分布于外周感觉系统的小直径神经元中，参与钠离子内流过程，在外周神经敏化中作为重要的离子通道发挥作用[6-7]。VGSC阻滞剂镇痛效果明显[8]，但广谱钠通道阻滞剂并非仅阻滞与疼痛相关的亚型，同时会阻滞与骨骼肌、心肌相关的亚型并产生严重的副作用。阻滞Nav1.8后不会影响机体主要的生理功能，且Nav1.8结构和功能的改变在慢性疼痛的发展中发挥关键作用，因此已成为治疗慢性疼痛备受关注的靶点[9-10]。
海因类化合物作为钠离子通道阻滞剂或一种非肽类生长抑制素，受体配体可高度选择性作用于SSTR2，具有良好的镇痛作用[11]，通过结构改造或修饰可以克服现有不足[12]，有望成为治疗慢性疼痛的先导化合物[13]。MH作为哺乳动物的代谢产物，属海因类最简单的小分子化合物，价廉、易得，若MH可通过选择性阻滞Nav1.8的表达而起到镇痛效果，其成药潜力巨大。因此本文通过MH对坐骨神经慢性压迫模型(chronic constriction injury, CCI)大鼠慢性疼痛的作用，探究MH镇痛的可能性。
1 材料与方法 1.1 材料Nav1.8通道的CHO细胞系(中国SCOPE公司)；1-甲基海因(CATO)；氨溴索(上海甄准生物科技有限公司)；二甲基亚砜(北京索莱宝科技有限公司)；水合氯醛(天津大茂化学试剂厂)；兔多克隆抗体to Nav1.8、山羊抗兔IgG抗体(英国Abcam公司)。
1.2 方法1.2.1 实验动物分组及建模 SPF级SD大鼠60只，体重(250±10)g，广东省医学实验动物中心提供[生产许可证号：SCXK(粤)2016-0041]，饲养于华南农业大学实验动物中心。伦理批文号：2018B092。大鼠按雌、雄各半随机分为正常对照组(N组)、假手术组(P组)、模型对照组(M组)、1-甲基海因组(MH组)、氨溴索组(A组)、利多卡因组(L组)，每组10只。参照Bennett等[14]的方法建立CCI模型；假手术组暴露坐骨神经但不结扎；正常对照组不作任何处理。MH组、A组和L组大鼠在建模后第10天开始，直至第21或28天取DRG为止，分别接受肌注MH(25 mg ·kg-1)、口服氨溴索(1 000 mg ·kg-1)以及肌注2%利多卡因(0.2 mg ·kg-1)治疗。
1.2.2 蛋白免疫印迹 经NCBI查询获得Nav1.8的蛋白序列，根据序列通过Expasy计算出通道分子量。从分离出的大鼠背根神经节中提取总蛋白并测定蛋白浓度，蛋白样品经电泳后转至聚偏二氟乙烯膜于4 ℃封闭2 h，用TBST缓冲液1 ∶4 000配制兔多克隆抗体to Nav1.8，4 ℃孵育12 h，山羊抗兔IgG抗体按1 ∶5 000稀释，4 ℃避光孵育6 h，洗膜后利用红外荧光扫面成像仪器进行扫膜，以β-actin为内参，分析相关蛋白的表达水平。
1.2.3 全细胞膜片钳技术 根据全细胞膜片钳技术检测经MH孵育的CHO细胞电生理变化，选用利多卡因作为阳性对照化合物，检测其对Nav1.8电流的抑制率。
1.2.4 数据处理与分析 使用Clampex 10.5记录全细胞膜片钳技术原始数据，经pCLAMP 10.5软件采集数据并分析；采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，数据以“x±s”表示，各组数据采用单因素方差分析，以P<0.05为差异显著，具有统计学意义；作图采用GraphPad Prism8软件。
2 结果 2.1 蛋白免疫印迹试验建模后第21和28天，与P组相比，手术各组大鼠DRG中Nav1.8的表达均提高，未用药的M组Nav1.8表达最多。用药各组DRG中Nav1.8表达量依次为MH组、L组、A组。用药各组与M组比较，Nav1.8表达量均显著降低(图 1和图 2，P<0.05)。N组与P组比，差异不显著(图 1和2，P>0.05)。
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A. Nav1.8表达量；B.灰度相对值(x±s)。分组介绍: N. 正常对照组; P. 假手术组; M. 模型对照组; MH. 1-甲基海因组; A. 氨溴索组; L. 利多卡因组，各组均与N组比较，*. P<0.05；用药组与M组比较，#. P<0.05 A. Expression of Nav1.8; B. Relative grayscale value(x±s). Group introduction: N. Normal control group; P. Sham surgery group; M. Model control group; MH. 1-methylhyne group; A. Ambroxol group; L. Lidocaine group, all groups were compared with group N, *. P<0.05; The treatment groups compared with group M, #. P<0.05 图 1 第21天大鼠DRG中Nav1.8的表达量及灰度相对值(x±s) Fig. 1 The expression of Nav1.8 and relative brightness value(x±s)in DRG of rats on the 21st day |
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A. Nav1.8表达量；B.灰度相对值(x±s)。分组介绍: N. 正常对照组; P. 假手术组; M. 模型对照组; MH. 1-甲基海因组; A. 氨溴索组; L. 利多卡因组，各组均与N组比较，*. P<0.05；用药组与M组比较，#. P<0.05 A. Expression of Nav1.8; B.Relative brightness value(x±s). Group introduction: N. Normal control group; P. Sham surgery group; M. Model control group; MH. 1-methylhyne group; A. Ambroxol group; L. Lidocaine group, all groups were compared with group N, *. P<0.05; The treatment groups compared with group M, #. P<0.05 图 2 第28天大鼠DRG中Nav1.8的表达量及灰度相对值(x±s) Fig. 2 The expression of Nav1.8 and relative brightness value(x±s)in DRG of rats on the 28th day |
10和100 μmol ·L-1 MH对Nav1.8的电流抑制率分别为6.34%±3.13%和14.6%±1.52%，阳性对照化合物100 μmol ·L-1利多卡因对Nav1.8的抑制率为57.2%±2.23%(图 3和4)，因此抑制Nav1.8通道电流抑制强度依次为100 μmol ·L-1利多卡因、100 μmol ·L-1 MH、10 μmol ·L-1 MH。
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Control为正常外液记录的电流，然后依次灌流10、100 μmol ·L-1 MH，洗脱后给予100 μmol ·L-1利多卡因 Control was the current recorded from the normal external fluid, and then 10 and 100 μmol ·L-1 MH were successively perfused, and 100 μmol ·L-1 lidocaine was administered after elution 图 3 抑制Nav1.8通道电流图 Fig. 3 Pattern of inhibition of current of Nav1.8 channel |
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Control为正常外液记录的电流，然后依次灌流10、100 μmol ·L-1 MH，洗脱后给予100 μmol ·L-1利多卡因 Control was the current recorded from the normal external fluid, and then 10 and 100 μmol ·L-1 MH were successively perfused, and 100 μmol ·L-1 lidocaine was administered after elution 图 4 抑制Nav1.8通道电流时程图 Fig. 4 The schedule chart of inhibition of current of Nav1.8 channel |
本试验通过MH和Nav1.8调节剂干预大鼠慢性疼痛后脊髓背根神经节的变化，使用蛋白免疫印迹技术检测大鼠L4~L6段DRG中Nav1.8的蛋白表达，采用全细胞膜片钳技术检测MH作用下的Nav1.8通道峰电流，初步探究MH对慢性疼痛大鼠Nav1.8的作用。
疼痛造成了动物DRG中Nav1.8蛋白表达量上调，可能是因为慢性疼痛造成DRG中传入感觉神经元上的Nav1.8表达增加，但随着时间推移，机体自身免疫系统参与抗炎，炎症减轻，蛋白表达下降[15-17]。
钠离子通道结构和功能的改变影响疼痛转归过程，利多卡因通过调节钠离子通道状态而产生镇痛效果，MH和利多卡因均抑制了Nav1.8的活性，表明这两种化合物的镇痛机制可能涉及钠离子通道，也说明抑制Nav1.8可能与镇痛反应有关，但也可能涉及多种复杂机制。本试验测得氨溴索抑制Nav1.8蛋白表达的效果强于利多卡因，但镇痛效果则是利多卡因最佳，其原因可能是氨溴索是Nav1.8高选择性阻滞剂，而造成疼痛的机制复杂，抑制Nav1.8的表达只是其中的一个通道，利多卡因还可拮抗其它通道如Nav1.9的表达而起到更好的镇痛效果[18]。
神经或组织损伤后，Nav1.8直接参与DRG神经元异常电活动，产生异常的钠离子电流，这可能是因为吸引交感神经纤维包裹成篮状结构，继续产生异常的细胞膜电位[19]。MH对Nav1.8通道电流具有抑制作用，且呈现浓度依赖性。将暴露于100 μmol ·L-1 MH的CHO细胞洗脱，该细胞的Nav1.8通道几乎可以从失活状态恢复到静息状态，说明100 μmol ·L-1 MH对Nav1.8的抑制作用基本可逆。相较于100 μmol ·L-1酚那酸类药物作用于CHO细胞洗脱后，CHO细胞的Nav1.8通道难以从失活状态恢复到静息状态，抑制作用不完全可逆[20]。证明了在用药后MH对Nav1.8通道电流具有抑制作用，且基本不影响疼痛恢复期Nav1.8的功能，说明MH在治疗慢性疼痛过程中的安全性。
目前，已有Nav1.8阻滞剂进入临床试验，但数量十分有限。本研究证明，当浓度从10 μmol ·L-1升至100 μmol ·L-1，MH对Nav1.8抑制率仅从6.34%±3.13%增长到14.6%±1.52%，表明MH对Nav1.8抑制效果较弱，但由于MH结构简单，廉价易得，通过结构改造或修饰可以克服现有不足，因此仍然具有成为动物镇痛药物的潜力。目前，已确定磺胺类镇痛药与钠离子通道蛋白的结合位点，并且与经典的小分子钠通道阻滞药如利多卡因等物不同，后者作用于钠离子通道的孔隙区域，所以通常对不同的钠通道亚型选择性很小，故后续可能通过利用磺胺类化合物的高特异性结合位点，对海因类化合物类镇痛药进行筛选设计和改造。
本试验对1-甲基海因治疗大鼠CCI模型致慢性疼痛的进行了初步研究，发现MH可以抑制Nav1.8蛋白表达，同时抑制钠离子电流。但本研究具有一定的局限性，Nav通道各亚型之间具有高度相似性[21]，后续可检测模型动物DRG中Nav1.8基因的表达情况，分析MH对其余钠通道亚型的阻滞作用和选择性，为后期基于MH结构进行改造或修饰，从而进一步研发出特异性高、副作用少的新型镇痛药提供依据。
4 结论MH通过下调慢性疼痛大鼠DRG中Nav1.8的表达，同时抑制Nav1.8通道电流，进而产生的镇痛作用，故MH具有成为动物镇痛药物的潜力，本试验为临床科学治疗慢性疼痛和基于MH进行动物专用新型镇痛药物的研发提供理论依据。
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(编辑 白永平)