2. 山西农业大学动物医学学院, 晋中 030801
2. College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, China
全身骨骼肌占机体体重的40%左右，身体任何一个姿势都由一系列的肌群协调完成，它们是运动系统的重要组成部分[1-2]。骨骼肌损伤为外科常见病，多发于负重、不当运动、交通事故以及自然灾害中，是日常生活中的常见损伤[3]。虽然骨骼肌有一定自愈能力，但通常过程缓慢，且愈合不完全，容易形成瘢痕组织，引发二次损伤[4]。其发病率高、预后不良，会严重影响人和动物的正常生活和生长[5]。因此，促进肌肉损伤后的修复进程和提高其修复质量具有重要的理论与实践意义。
骨骼肌损伤后再生修复是极其复杂的过程，起初表现为肌纤维坏死断裂，肌组织出血、水肿、炎症细胞浸润，刺激机体启动修复[6]，随后肌卫星细胞(muscle satellite cells，MSCs)被激活，表达生肌调节因子(myogenic regulatory factors，MRFs)，如MyoD(Myogenic differentiation 1)、Myf-5(myogenic factor 5)等，大量增殖为成肌细胞，最终分化、融合为肌纤维[7]。肌肉再生的同时会合成肌动蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)等重要的功能蛋白。再生纤维的特点是横截面积小，且有中间核[2]。此后，再生骨骼肌成熟，成纤维细胞及胶原纤维出现，后期弹性纤维出现，形成瘢痕组织[8-9]。因此，受损肌肉再生以及瘢痕组织形成趋于平衡才能保证最终的愈合质量。
目前，治疗骨骼肌损伤的方式繁多，包括传统的冰敷[10]、针灸[11]、推拿[12]，以及抗炎西药[13]、射频热凝[14]、手术治疗[15]等，这些方法尽管可以影响修复过程，但是大多价格昂贵，疗效参差不齐，伴随副作用且不能完全改善症状。中医学认为筋络破损，脉络受阻，血瘀气滞是创伤部位的基本病理变化，可以通过促进血液循环，消除瘀血，补充气血进行治疗[16]。近年来，由于人们健康意识的提高以及对部分抗生素的管控，中草药因其天然高效、毒副作用小而受到欢迎，越来越多的人利用中草药治疗骨骼肌损伤[17-18]。目前，犬、猫运动造成的损伤在宠物医疗方面也有中医疗法的介入，包括骨骼肌的损伤等。
有研究表明，丹参能够有效地促进MyHC Ⅱb(myosin, heavy polypeptide 4)表达[19]，降低Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ)表达[20]。并且可以加快肌肉力量恢复的速度，缩短伤口愈合时间[21]，改善受损肌肉的生物力学指标，从而最终提高愈合质量。丹参注射液也可减轻创面炎症，促进伤口愈合[22]。还可减轻线粒体损伤，抑制炎性因子释放，加快病灶清除，促进损伤细胞修复[23]。丹参素(Danshensu，DSS)是运用现代先进生产工艺从传统中药丹参中分离提纯的一种高纯度芳香酸类化合物，是丹参水溶性成分中的主要药效成分之一，也是目前研究最热的丹参单体成分之一[24]。丹参素在体内可被快速吸收，且消除速率比较慢，在临床上主要用于心血管疾病，并且疗效显著[25]。研究证明，丹参素具有减少血小板粘附和聚集以及清除自由基、抗炎、抗纤维化等作用[26-27]。关于丹参素能否促进骨骼肌再生，目前没有报道。
本研究建立小鼠骨骼肌损伤模型，并使用丹参素进行治疗，通过对组织形态学以及促进骨骼肌修复、再生和抑制纤维化的相关因子分析，探讨丹参素对骨骼肌损伤后修复的影响，为丹参素这种中药单体改善肌肉修复速度和质量的临床应用提供理论依据，这也将为治疗犬、猫和赛马在运动过程中造成的损伤提供药物治疗依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物及处理清洁级6周龄C57BL/6雄性健康小鼠购于山西省人民医院实验动物中心。按要求分笼饲养，自由采食饮水，光照周期为白天黑夜交替，12 h: 12 h。试验过程中严格按照动物伦理规范执行。
随机选取体重相近的21只小鼠分为损伤对照组(9只，每组3只)，损伤治疗组(9只，每组3只)，空白对照组(3只)。氯化钡试剂购自天津市风船化学试剂科技有限公司，分子式为BaCl2·2H2O，纯度≥99.5%。小鼠骨骼肌损伤模型的建立参考文献[28]，给予小鼠0.05 mg·kg-1丁丙诺啡，异氟醚麻醉小鼠，将无菌1.2% BaCl2溶液以剂量为3.2 mL·kg-1注入小鼠腓肠肌(gastrocnemius, GAS)。将小鼠放回到笼中，直至可以移动为止，6~8 h后给小鼠0.025 mg·kg-1丁丙诺啡。损伤2 h后治疗组进行丹参素注射治疗(大连美仑生物技术有限公司，纯度≥95%，批号：J0509A，剂量为30 mg·kg-1，丹参素用生理盐水进行溶解)，连续注射3、5和7 d，损伤对照组与空白对照组进行生理盐水注射，分别在连续治疗3、5和7 d后分离损伤组与治疗组的腓肠肌，制作石蜡切片，提取总蛋白和RNA备用。
1.2 EB(伊文思蓝, Evans blue)染色取材前20~24 h，试验组小鼠腹腔注射0.5% EB染料0.005 mL·g-1，每组3只小鼠，注射后，动物放回笼中，随意进食和饮水，之后采用颈脱法处死小鼠，取腓肠肌组织进行观察，并拍照。
1.3 石蜡切片制备和染色石蜡切片制备：将取得的腓肠肌组织进行固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片与贴片。
HE (苏木精-伊红)染色：将切片置于染缸内进行脱蜡、复水后，苏木精染色2 min，伊红染色2 s，梯度酒精脱水，中性树胶封片观察。
Masson染色：将切片置于染缸内进行脱蜡、复水、温热水漂洗后，使用核染液染色60 s，浆染液染色40 s，黄色分色液分色8 min，直至观察到胶原纤维部分褪成淡粉红色，弃去分色液，蓝色复染液染色5 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。
1.4 RNA提取和qRT-PCR(quantitative real-time PCR)Trizol法提取样品总RNA，测定其浓度后反转录。在NCBI上检索小鼠MyoD、MyoG(myogenin)、MSTN(myostatin)、Pax7(paired box 7)、IL-6(interleukin 6)、IL-10(interleukin 10)、PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor gamma)、F4/80(adhesion G protein-coupled receptor E1，ADGRE1/ F4/80)、Collagen Ⅰ(collagen, type I alpha 1)、α-SMA(actin alpha 2, smooth muscle, aorta)和β-actin序列，利用Premier 5.0软件设计PCR扩增引物，送北京华大基因公司合成。引物序列如表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Sequence of primers |
按照SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒说明书进行QRT-PCR，通过2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA相对表达量变化。
1.5 蛋白提取和Western blot根据RIPA Lysis Buffer试剂盒说明书提取腓肠肌组织的总蛋白，BCA法测量蛋白浓度，用loading buffer进行蛋白变性，蛋白上样，待SDS-PAGE电泳结束后转移至NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入eMyHC(Santa Cruz，1∶500)、α-Actinin(Abcam，1∶1 000)、MyoD(Abcam，1∶1 000)、MyoG(Abcam，1∶500)、MSTN(Proteintech，1∶500)、Pax7(Abcam，1∶1 000)、F4/80(Abcam，1∶1 000)、Collagen Ⅰ(Abcam，1∶1 000)、α-SMA(Abcam，1∶1 000)、PPARγ(Abcam，1∶1 000)以及GAPDH(Abcam，1∶2 000)一抗4 ℃过夜孵育，次日NC膜用TBST摇洗3次，HRP(Horseradish Peroxidase)标记的二抗(1∶10 000)37 ℃恒温水平摇床孵育1 h。TBST摇洗6次，使用ECL试剂盒显色后进行胶片曝光，扫描获取目的图像，用Image-ProPlus 6.0软件对目的蛋白和GAPDH免疫印迹结果进行分析。蛋白含量=条带面积×平均灰度；目的蛋白半定量值=目的蛋白含量/GAPDH蛋白含量。数据均用“x±s”表示，用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。
1.6 数据处理数据使用SPSS软件进行t检验和单因素方差分析，所有试验数据均用“x±s”表示，用GraphPad Prism 9.3进行分析作图。结果显示*表示P＜0.05，差异为显著；**表示P＜0.01，差异为极显著；***表示P＜0.001，差异为极其显著。
2 结果 2.1 丹参素促进肌肉损伤后修复再生EB染料的积累可以识别肌纤维的损伤情况。结果显示，损伤组与治疗组肌纤维均于第1天就受到一定的损伤。第3天颜色最深、损伤最严重，随后颜色慢慢变浅，损伤组自愈直至第9天，颜色也较对照组深。丹参素治疗组，治疗初期EB积累与损伤组无差别，从第5天开始，与损伤组相比，治疗组明显对EB摄取量更少，治疗后第9天EB摄取量与空白对照组相近(图 1A)。
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A.损伤组及治疗组腓肠肌的EB染色；B. 损伤组及治疗组腓肠肌的HE染色，标尺为100 μm；C. α-Actinin的蛋白相对表达水平；D. eMyHC的蛋白相对表达水平。*. P＜0.05；**. P＜0.01； . 损伤组； . 治疗组
A. EB staining of GAS in injure and treatment group; B. HE staining of GAS in injure and treatment group, Bar=100 μm; C. Relative expression levels of α-Actinin protein; D. Relative expression levels of eMyHC protein. *.P < 0.05; **.P < 0.01; . Injure; . Treatment
图 1 丹参素促进肌肉损伤后修复再生
Fig. 1
Danshensu promotes repair and regeneration after muscle injury
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HE染色结果显示，治疗组在第3天时，已有少数再生肌纤维，且肌纤维溶解不明显，炎性细胞浸润相较损伤组显著减少。第5天时，治疗组较损伤组细胞再生更多，且再生细胞排列更紧密，炎性细胞较少。当第7天损伤组肌纤维大量再生时，治疗组大部分细胞核已迁移至胞膜边界，只能观察到极少数炎性细胞与再生肌纤维，且新生肌纤维直径大于损伤组，已基本完成损伤后修复再生(图 1B)。
以上两种染色结果显示，BaCl2注射导致肌肉受损，通过丹参素治疗，受损肌肉修复更快、效果更理想。骨骼肌损伤后修复过程伴随肌纤维的再生，Western blot结果显示，治疗后第5天辅肌动蛋白(α-actinin)含量明显高于损伤组(图 1C)，说明注射丹参素可以使细胞黏附作用更强，有利于损伤后细胞快速修复，使得再生时细胞形态更整齐、细胞之间更紧密。观察发现，治疗组的再生肌纤维标志物eMyHC蛋白表达在第5天时迅速上升(图 1D)，与损伤组相比有显著增加，与α-Actinin趋势保持一致。因此，丹参素治疗使肌肉再生更加迅速，并且第5天时修复效果显著。
2.2 丹参素影响损伤后肌肉再生相关因子的表达骨骼肌损伤后修复过程伴随成肌分化与肌纤维的成熟，试验进一步检测了肌肉再生相关因子的表达。Western blot结果显示，第5天时，丹参素治疗后，治疗组生肌决定因子MyoD、肌细胞分化标志物MyoG以及肌卫星细胞标志物Pax7的蛋白表达水平与损伤组相比，表达量显著增高(图 2A、B、D)，治疗组MSTN的表达明显低于损伤组(图 2C)。这表明丹参素促进肌卫星细胞增殖和分化，成肌相关蛋白在第5天达到峰值，丹参素加快受损肌肉修复再生进程。
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A. MyoD的蛋白相对表达水平；B. MyoG的蛋白相对表达水平；C. MSTN的蛋白相对表达水平；D. Pax7的蛋白相对表达水平；E. MyoD的mRNA相对表达水平；F. MyoG的mRNA相对表达水平；G. MSTN的mRNA相对表达水平；H. MSTN的mRNA相对表达水平。*. P＜0.05；**. P＜0.01；***. P＜0.001；.损伤组；.治疗组
A. Relative expression levels of MyoD protein; B. Relative expression levels of MyoG protein; C. Relative expression levels of MSTN protein; D. Relative expression levels of Pax7 protein; E. Relative expression levels of MyoD mRNA; F. Relative expression levels of MyoG mRNA; G. Relative expression levels of MSTN mRNA; H. Relative expression levels of Pax7 mRNA; *. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001; . Injure; . Treatment
图 2 丹参素对肌肉再生相关因子蛋白的影响
Fig. 2
Effect of Danshensu on muscle regeneration related factor protein
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QRT-PCR结果显示，损伤后第3天时，生肌决定因子MyoD、肌细胞分化标志物MyoG以及肌卫星细胞标志物Pax7的基因表达水平都显著高于正常对照组(图 2E、F、H)，而肌肉生长抑制素MSTN mRNA表达呈下降趋势(图 2G)。治疗组Pax7 mRNA表达水平较损伤组更高、MSTN mRNA含量也更低，说明丹参素治疗在损伤最严重时，促进受损肌纤维修复，此情况持续到第7天受损肌肉基本恢复前。第5天，治疗组MyoG mRNA水平明显高于损伤组，MSTN mRNA水平显著低于损伤组，说明丹参素治疗可以促进肌卫星细胞激活，同时对MSTN产生拮抗作用，从而加快修复进程。
2.3 丹参素抑制肌肉损伤后炎症巨噬细胞是损伤区域内的主要炎症细胞，在肌肉再生过程中表达有一定规律性。QRT-PCR结果显示，损伤组与治疗组的促炎因子IL-6基因表达水平早期均急剧上升，之后呈明显下降趋势。第3、7天时，治疗组IL-6 mRNA表达显著低于损伤组(图 3A)。抗炎因子IL-10初期表达量较低，治疗组第5天时，IL-10 mRNA达到峰值，表达水平显著高于损伤组(图 3B)。巨噬细胞特异性标志物F4/80不论是转录水平还是蛋白表达水平均在损伤后急剧升高，治疗后，第3天时F4/80表达高于损伤组，第7天时表达显著低于损伤组，第5天的F4/80蛋白表达低于损伤组(图 3C、D)。以上结果表明，肌肉损伤刺激巨噬细胞产生炎症因子，吞噬组织碎片和坏死肌纤维。丹参素治疗后炎性因子水平受到抑制，炎症程度明显降低，抗炎性因子显著增加，丹参素可以加快M1型巨噬细胞向M2型转变进程。
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A. IL-6的mRNA相对表达水平；B. IL-10的mRNA相对表达水平；C. F4/80的mRNA相对表达水平；D. F4/80的蛋白相对表达水平。*. P＜0.05；**. P＜0.01；***. P＜0.001；.损伤组；.治疗组
A. Relative expression levels of IL-6 mRNA; B. Relative expression levels of IL-10 mRNA; C. Relative expression levels of F4/80 mRNA; D. Relative expression levels of F4/80 protein; *. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001; . Injure; . Treatment
图 3 丹参素对炎症相关因子的影响
Fig. 3
Effects of Danshensu on inflammation-related factor genes
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Masson染色结果显示，第7天时，治疗组细胞间胶原纤维明显少于损伤组(图 4A)。为进一步检测丹参素治疗对损伤肌肉愈合后纤维化的影响，对肌肉纤维化标志性因子Collagen Ⅰ以及α-SMA的蛋白表达水平进行测定。结果显示，丹参素治疗第3天纤维化相关因子表达与损伤组无明显差异，当治疗5、7 d后，治疗组Collagen Ⅰ以及α-SMA的蛋白表达水平均显著低于损伤组(图 4B、C)。与对照组相比，损伤组和治疗组的Collagen Ⅰ mRNA和α-SMA mRNA在后期均显著升高。在第5、7天时，治疗组纤维化基因表达均显著低于损伤组(图 4D、E)。因此，丹参素治疗可能通过抑制Ⅰ型胶原过度分泌以及减少成纤维细胞增生，从而抑制小鼠骨骼肌损伤后肌纤维化。
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A.第7天损伤组和治疗组的腓肠肌Masson染色，标尺为100 μm; B. Collagen Ⅰ的蛋白相对表达水平；C. α-SMA的蛋白相对表达水平；D. Collagen Ⅰ的mRNA相对表达水平；E. α-SMA的mRNA相对表达水平。*. P＜0.05；**. P＜0.01；.损伤组；.治疗组
A. Masson staining of GAS in injure and treatment groups on 7 days, bar=100 μm; B. Relative expression levels of Collagen Ⅰ protein; C. Relative expression levels of α-SMA protein; D. Relative expression levels of Collagen Ⅰ mRNA; E. Relative expression levels of α-SMA mRNA; *. P < 0.05, **. P < 0.01; . Injure; . Treatment
图 4 丹参素对肌肉纤维化相关因子蛋白表达的影响
Fig. 4
The effect of Danshensu on muscle fibrosis related factor protein expression
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骨骼肌损伤初期，脂肪组织填充受损部位，为后续肌肉修复构建良好的再生环境。QRT-PCR结果显示，治疗组PPARγ mRNA水平于第5天达到高峰，且基因表达水平明显高于损伤组，5 d后表达下降，第7天治疗组的PPARγ mRNA水平仍然高于损伤组(图 5A)。蛋白结果显示，第3、5天时，治疗组PPARγ蛋白水平显著高于损伤组(图 5B)。综上所述，丹参素治疗能够在损伤初期增加肌间脂肪含量。
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A. PPAR-γ mRNA相对表达水平；B. PPAR-γ蛋白相对表达水平。*. P＜0.05；**. P＜0.01；***. P＜0.001；.损伤组；.治疗组
A. Relative expression levels of PPAR-γ mRNA; B. Relative expression levels of PPAR-γ protein; *. P < 0.05, **. P < 0.01, ***. P < 0.001; . Injure; . Treatment
图 5 丹参素对肌肉损伤后脂肪因子的影响
Fig. 5
Effects of Danshensu on fat factor after muscle injury
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在骨骼肌损伤后不同时间段，肌纤维会发生不同变化，因此对肌纤维形态结构的观察可以作为判断肌肉损伤及修复效果的依据。本试验通过进行HE染色发现，第3天时丹参素治疗组已有少量再生肌纤维形成，并且炎性细胞浸润弱于损伤组，说明治疗缩短了损伤后的炎性进程，促进新生肌纤维形成。并且7 d后，明显观察到治疗组肌纤维再生明显且排列更紧密，当损伤组还在大量再生时，治疗组已经进入损伤后期重塑阶段。
肌卫星细胞的激活决定了骨骼肌本身的修复能力，不论是转录水平还是蛋白表达水平，相关研究数据显示损伤后肌再生过程中，肌卫星细胞的增殖与分化扮演了重要的角色[29]。在本研究中，治疗组在第5天时Pax7含量达到峰值。肌增殖标记物MyoD 与分化标志物MyoGmRNA均于肌肉损伤第3天显著升高，后期呈下降趋势，而蛋白表达第5天到达峰值。对于肌再生负调控因子MSTN来说，治疗组表现出更明显的抑制作用。因此，丹参素促进了损伤后修复过程中肌卫星细胞的激活及分化。
试验前期从组织学角度以及分子层面研究发现，丹参素治疗组成肌纤维正调节因子均表达上升，证实丹参素治疗使肌肉肌卫星细胞更迅速激活。之后检测与新生肌纤维直接相关的蛋白表达情况，结果显示α-Actinin与eMyHC含量在第5天迅速上升，明显高于损伤组，说明在第5天时修复效果最好，这与HE染色在第5天观察到大量中心核细胞产生且细胞之间排列更加紧密的结果保持一致。
有研究表明中药可以减轻损伤后炎症反应，促进肌纤维生成与成熟，减少结缔组织增生[30-31]。这种说法与本试验丹参素治疗骨骼肌损伤时效果一致。自从Hough第一次提出延迟性肌肉酸痛概念，之后骨骼肌损伤发生原因受到国内外广泛研究，已经提出了肌细胞代谢能量紊乱学说、肌细胞内钙稳态失调学说、机械损伤学说、自由基和脂质过氧化学说以及炎性损伤假说[32]。本试验研究表明，治疗组与对照组相比，在肌肉再生过程中表达了更低的促炎因子与更高的抗炎因子，M1型巨噬细胞促进肌卫星细胞的激活，而M2型巨噬细胞促进肌卫星细胞融合与分化成熟。本试验中M1型巨噬细胞向M2型转变，符合骨骼肌损伤后再生规律。丹参素治疗组通过干预炎症反应，使得炎性因子表达降低或炎症进程加快，促进损伤肌肉再生。齐田田等[33]研究表示，丹参水溶性成分可以舒张冠脉、拮抗钙超载、调节能量代谢、活性氧代谢、保护内皮、抑制炎性反应、细胞凋亡和调控自噬抗心肌缺血及再灌注损伤。因此，丹参素推动了骨骼肌损伤后修复过程中的炎症进程。
朱文辉等[34]研究发现损伤部位注射黄芪、丹参治疗，MyHC Ⅱb表达明显高于自然愈合组，且Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显下降[19]。所以，丹参素可能是促进骨骼肌损伤后的修复再生，延缓骨骼肌纤维化的重要成分。本试验研究表明，肌肉损伤后胶原纤维标志性因子Collagen Ⅰ以及成纤维细胞标志性因子α-SMA均呈缓慢上升趋势，而丹参素治疗后两个因子表达明显下降，说明丹参素抑制了肌肉纤维化，有助于减少瘢痕组织。PPARγ主要表达于脂肪组织及免疫系统，参与前脂肪细胞分化成脂肪细胞以及单核细胞分化为巨噬细胞，与脂肪细胞分化和机体免疫关系密切。本试验研究发现，治疗后PPARγ水平上升，且与损伤组存在明显差异。推测PPARγ前期的表达量升高有助于刺激巨噬细胞释放炎性因子，并引导骨骼肌内脂肪组织产生，有助于促进肌纤维修复。祁美武和周晓[35]观察放疗大鼠腿部肌肉纤维化的情况，发现注射脂肪干细胞可以相对降低TGF-β1的速度，对肌肉纤维化起到一定的延缓作用，表明脂肪细胞可能会减缓肌肉纤维化，与本试验经丹参素治疗后纤维化相关因子表达降低具有一致性。
越来越多的中药用来治疗犬、猫运动造成的损伤，本研究针对丹参素加速骨骼肌损伤后修复的功能进行了基础探索，表明丹参素将在治疗犬、猫骨骼肌损伤中发挥重要的作用，这在宠物医疗行业中具有广阔的应用前景。
4 结论本试验证明传统中药丹参的提取物丹参素单体成分对骨骼肌再生的积极作用，其可抑制骨骼肌纤维化，改善肌肉修复速度与质量，为后续临床治疗动物骨骼肌损伤提供候选药物参考。
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(编辑 白永平)