2. 黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室, 哈尔滨 150030
2. Heilongjiang Key Laboratory of Experimental Animals and Comparative Medicine, Harbin 150030, China
邻苯二甲酸二-2-乙基己酯[di(2-ethylhexyl)phthalate, DEHP]作为一种合成聚合物的增塑剂，已被广泛应用于纺织品、医疗器械、电子产品和个人护理用品等方面[1]。而增塑剂会在材料中迁移并随着时间的推移从材料中渗出，最终进入环境[2]。随着DEHP的生产和使用量越来越大，其释放在环境中的含量也呈逐年上升趋势[3]。由于DEHP不断地释放到环境中，从而通过饮食，呼吸和皮肤接触进入人体，进而危害人体健康，这引起了人们对其安全性及其对人体健康的潜在影响的一些担忧[4]。广泛的研究表明，DEHP对人和动物都有有害影响，可诱导生殖毒性、神经毒性和心脏毒性，此外还有免疫毒性[5-8]。据报道，在哮喘小鼠模型中，DEHP增加了总IgE水平，此外，BALF中酸性粒细胞数量和肺中酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)明显增加[9]。研究人员发现DEHP可以改变骨髓中B细胞的成熟和分化[10]。此外，DEHP使小鼠巨噬细胞发生极化，M1极化降低，而M2极化增强，提示DEHP可以影响巨噬细胞的体内免疫反应，显著降低其肿瘤预防能力[11]。DEHP持续灌胃45 d，会导致鹌鹑脾受损，组织病理学观察脾组织中可见脾小体边界和细胞间隙增大[12]。大量研究表明，DEHP等环境污染物造成的细胞损伤与氧化应激有关[13-14]。值得注意的是，DEHP通过增加ROS的产生，从而诱导氧化应激，增加Bax/cytochrome-c/Caspase-3的表达水平，抑制BCL-2的表达，启动大鼠颗粒细胞的线粒体凋亡途径[15]。此外，氧化应激损伤通过激活细胞程序性坏死途径，增加坏死相关基因TNF-α、RIPK1、RIPK3、MLKL和JNK的表达，介导鸡肾细胞程序性坏死[16]。
PTEN/PI3K/AKT通路参与了细胞生长、凋亡以及与环境有关的多个细胞过程，并与氧化应激的产生密切相关[17]。多项研究表明，当细胞发生氧化应激时，会刺激ROS的过度产生，进而激活PTEN的表达，从而抑制PI3K/AKT表达，这是导致细胞损伤的主要途径[18-19]。PTEN/PI3K/AKT通路是细胞存活的保护通路，而氧化应激也常常通过调节PTEN/PI3K/AKT通路而导致细胞损伤。抑制miR-21能上调卵巢癌细胞中PTEN表达，阻断PI3K/AKT通路的活性，从而促进细胞凋亡[20]。此外，不同剂量的CPF暴露草鱼肝细胞，PTEN通过其脂质磷酸酶活性作用于PI3K/AKT通路，阻断该通路活性从而导致细胞凋亡和坏死[19]。肿瘤坏死因子(TNF)诱导的细胞程序性坏死是受到PI3K/AKT的抑制，结果发现，RIP1、RIP3和MLKL的表达水平升高，表明抑制PI3K/AKT通路可激活细胞坏死通路，最终导致细胞程序性坏死[21]。值得注意的是，双酚A(BPA)暴露通过上调Bax、caspase-3、caspase-9、RIP1、RIP3和MLKL的表达，下调BCL-2表达，加重了缺硒鸡肾细胞凋亡和程序性坏死，PI3K/AKT的负调控在此过程中发挥着重要作用[22]。此外，硒减轻了镉暴露通过抑制PI3K/AKT途径导致的凋亡和程序性坏死，改善了鲤鱼脾淋巴细胞的损伤[23]。
综上所述，氧化应激调控PTEN/PI3K/AKT通路，在细胞凋亡和坏死中发挥着重要作用。此外，DEHP是一种有害的环境污染物。有研究表明，DEHP可引起细胞氧化应激和降低细胞中PI3K/AKT的表达水平，最终诱导细胞损伤[24-25]。然而，目前尚未有关于DEHP暴露通过ROS/PTEN/PI3K/AKT引起HD11细胞凋亡和程序性坏死的研究。因此，本试验通过建立DEHP体外暴露模型，通过吖啶橙/澳化乙锭(AO/EB)染色法和流式细胞术检测凋亡及坏死信号，氧化应激试剂盒检测氧化与抗氧化指标，qRT-PCR和Western blot检测PTEN/PI3K/AKT信号通路，凋亡相关基因(Bax、Caspase-3、Caspase-9和BCL-2)以及坏死相关基因(RIPK1、RIPK3和MLKL)，探讨其在免疫毒性进展中的具体机制。本试验结果将为进一步探索塑化剂的免疫毒性机制提供新思路。
1 材料与方法 1.1 主要试剂DEHP(纯度≥99.0%，MCE，美国)。CCK8试剂盒、BCA试剂盒(碧云天生物技术公司，上海，中国)。青霉素、链霉素、胰酶(Gibco，美国)。胎牛血清(BioInd，上海，中国)。辣根过氧化酶标记的羊抗兔/鼠二抗(Abmart，上海，中国)。
1.2 HD11细胞培养HD11细胞在RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素)中，于37 ℃、饱和湿度条件下，含5%CO2的培养箱中培养。根据细胞生长状况，每1 d传代1次。将HD11细胞接种到每孔细胞密度为2×106的96孔板中。每孔加入细胞悬液100 μL，待细胞融合度达70%~80%时进行DEHP处理。DEHP暴露浓度分别为0、30、60、90、120、150、180、210、240 μmol·L-1 DEHP进行处理。DEHP暴露24 h后，每孔加入10 μL CCK8，随后在温箱中继续孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。按照说明书的公式计算不同浓度DEHP处理细胞后的细胞活力，并以折线图的形式呈现不同浓度DEHP暴露HD11细胞后的细胞活力。使用软件SPSS分析半数抑制浓度(IC50)和95%置信区间。
1.3 HD11细胞分组根据DEHP暴露对HD11细胞24 h的IC50，应用细胞存活率为≥80%的30 μmol·L-1 DEHP为最低剂量，最终在DEHP致HD11细胞凋亡和程序性坏死及氧化应激作用的研究中，本试验用不同浓度的DEHP (0、30、60、90 μmol·L-1)处理HD11细胞24 h分别命名为对照组(C组)、低剂量组(L组)、中剂量组(M组)和高剂量组(H组)。
1.4 氧化应激相关指标的测定按照南京建成试剂盒说明书对LMH细胞进行相应处理。用酶标仪在525 nm/532 nm/520 nm/550 nm/412 nm波长下测定ROS/MDA/T-SOD/T-AOC/GSH-PX的吸光度。
1.5 AO/EB染色和流式细胞术1.5.1 AO/EB染色 每100 μL细胞悬液加入4 μL AO/EB混合液(AO∶EB=1∶1)，在室温避光培养5 min后，将其放入荧光显微镜观察形态学改变，然后拍照记录。根据以下的公式计算细胞凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/(正常活细胞数+凋亡细胞数+坏死细胞数)×100%。坏死指数=坏死细胞数/(正常活细胞数+凋亡细胞数+坏死细胞数)×100%。
1.5.2 流式细胞术 加入195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再避光加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶，混匀，避光于室温下温育20 min。转移至新的流式玻璃管中，加入1×binding buffer 400 μL，轻弹混匀。用流式细胞术(NovoCyte，Aceabio，USA)和FlowJo7.6.1软件检测细胞凋亡率和坏死率。
1.6 总RNA分离及实时荧光定量PCR分析使用总RNA试剂盒II(天根生物技术有限公司，北京，中国)中提取HD11细胞总RNA，反转录为cDNA，以β-actin为内参基因。qRT-PCR在LightCycler@480系统(罗氏，瑞士)上进行。引物序列分别见表 1。荧光定量PCR反应条件：94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环；以GAPDH的Ct值为内参，采用相对定量分析2-ΔΔCt对得到的Ct值进行数据分析。
|
表 1 鸡qRT-PCR的基因序列 Table 1 Gene-special primers used for qRT-PCR in chicken |
采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将电泳后分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶37 ℃封闭2 h，随后，将纤维膜在4 ℃的一抗中孵育过夜。用TTBS洗涤3次，每次15 min，接着在室温下进行二抗孵育时长为2 h，然后用TTBS洗涤3次，每次15 min。ECL发光压片显色，以GAPDH作为内参，扫描并分析图像，并计算相对表达量。本研究使用的抗体如下：PTEN(1∶1 000，万类，沈阳)，PI3K(1∶1 000，万类，沈阳)，AKT(1∶1 000，万类，沈阳)，BCL-2(1∶1 000，万类，沈阳)，Bax(1∶1 000，万类，沈阳)，Caspase3(1∶1 000，万类，沈阳)，Caspase9(1∶1 000，万类，沈阳)，RIPK1 (1∶1 000，Abmart，上海)，RIPK3(1∶1 000，Abmart，上海)，MLKL(1∶1 000，Abmart，上海)，GADPH(1∶1 000，Abmart，上海)，HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000，ZSGB-B)。
1.8 统计分析采用SPSS(17版; SPSS，Chicago，IL，USA)进行统计学显著性分析。用GraphPad(版本7.0，GraphPad Software inc.，San Diego，CA，USA)进行统计学分析，P＜0.05具有统计学意义。在每种情况下至少进行3个独立的试验，并以平均值(SEM)的“平均值±标准误差”表示数据。
2 结果 2.1 DEHP暴露对HD11细胞活力的影响为了明确DEHP对HD11的半数抑制浓度，用0、30、60、90、120、150、180、210、240 μmol·L-1 DEHP处理HD11细胞24 h，随后进行CCK-8检测细胞活力，如图 1所示，结果表明，随着DEHP浓度的升高，细胞活力呈浓度依赖式下降，DEHP显著抑制了HD11细胞的细胞活力。DEHP对HD11细胞24 h的IC50为180.644 μmol·L-1(95%置信区间：160.725~208.598 μmol·L-1)。
|
图 1 DEHP暴露对HD11细胞活力的影响 Fig. 1 Effect of DEHP exposure on HD11 cell viability |
为了评估DEHP暴露对HD11细胞氧化应激的影响，因此，本试验检测了相关的氧化应激指标。结果如图 2所示，与对照组相比，DEHP处理组的ROS与MDA表达水平显著升高，并且与DEHP浓度成正比(P＜0.01)。此外，与对照组相比，T-AOC表达水平显著降低，抗氧化物酶T-SOD，GSH-PX活性显著降低(P＜0.01)，结果表明，DEHP可诱导HD11细胞发生氧化应激，从而导致HD11细胞损伤。
|
与对照组(0 μmol·L-1)相比，**. P＜0.01 Compared with C group (0 μmol·L-1), **. P < 0.01 图 2 氧化应激指标变化 Fig. 2 Oxidative stress index changes |
为了证实DEHP暴露可诱导HD11细胞发生细胞凋亡和程序性坏死，用AO/EB染色和流式细胞术检测了不同暴露剂量下HD11细胞的细胞凋亡和程序性坏死比例。如图 3A所示，AO/EB染色后，荧光显微镜可区分出4种细胞形态: 活细胞，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞，核染色质着橘红色并呈正常结构。在荧光图像中，随着DEHP暴露剂量的升高，L组、M组和H组的凋亡细胞和坏死细胞比例逐渐增加。此外，Annexin VFITC-PI荧光标记法探究细胞凋亡和坏死的具体数量。如图 3C所示，流式细胞仪数据显示，坏死细胞比例5.1%增加到16.2%(第一象限)，第二、三象限显示，凋亡细胞比例5.8%增加到19.8%，AO/EB和流式细胞术结果共同表明，DEHP以浓度依赖性的方式增加了凋亡细胞和坏死细胞的比例。
|
A. AO/EB染色(比例尺，100 μm)；B. Image J荧光定量强度分析；C.流式细胞术分析；D.流式细胞术定量分析。与对照组(0 μmol·L-1)相比，**. P＜0.01 A. The AO/EB fluorescence staining (scalebar, 100 μm); B. The AO/EB fluorescence intensity quantitative analysis by ImageJ; C. The results of flowcytometry analysis; D. The quantitative results of flowcytometry. Compared with C group (0 μmol·L-1), **. P < 0.01 图 3 HD11细胞凋亡检测结果 Fig. 3 Cell apoptosis assay results for HD11 cells |
为了探索DEHP诱导的HD11损伤过程是否与PTEN/PI3K/AKT通路有关，本试验检测了DEHP暴露24 h后，HD11细胞中PTEN/PI3K/AKT信号通路相关基因的表达情况。如图 4所示，与对照组相比，DEHP暴露组PTEN的mRNA和蛋白水平显著升高。DEHP暴露组PI3K和AKT mRNA及蛋白表达明显降低(P＜0.01)。结果表明，DEHP能增强HD11细胞中PTEN的表达，进而抑制PI3K和AKT的表达，且这种作用随着DEHP剂量的增加而加强，提示DEHP能有效调控HD11细胞内PTEN/PI3K/AKT通路的活性。
|
与对照组(0 μmol·L-1)相比，**. P＜0.01 Compared with C group (0 μmol·L-1), **. P < 0.01 图 4 PTEN/PI3K/AKT通路相关基因mRNA及蛋白表达变化 Fig. 4 Changes of mRNA and protein expression of PTEN/PI3K/AKT pathway related genes |
为了研究DEHP对HD11细胞凋亡的影响，进一步检测了凋亡通路相关因子Caspase 9、Caspase 3、BCL-2和Bax的mRNA和蛋白表达。如图 5所示，与对照组相比，DEHP暴露组抗凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达显著降低，而Caspase 9、Caspase 3和Bax的mRNA和蛋白表达显著增加(P＜0.01)。结果表明DEHP暴露诱导HD11细胞发生线粒体凋亡。
|
与对照组(0 μmol·L-1)相比，**. P＜0.01 Compared with C group (0 μmol·L-1), **. P < 0.01 图 5 细胞凋亡相关基因mRNA及蛋白表达变化 Fig. 5 Changes of mRNA and protein expression of apoptosis related genes |
为了验证DEHP暴露24 h后细胞内的坏死通路被激活，分析了程序性坏死信号通路相关基因RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA和蛋白表达，由图 6所知，当DEHP暴露时，与对照组相比，RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P＜0.01)。表明DEHP暴露诱导HD11细胞发生程序性细胞坏死。
|
与对照组(0 μmol·L-1)相比，**. P＜0.01 Compared with C group (0 μmol·L-1), **. P < 0.01 图 6 程序性坏死相关基因mRNA及蛋白表达 Fig. 6 Changes of mRNA and protein expression of necroptosis related genes |
为了进一步探究DEHP暴露引起的HD11细胞凋亡和程序性坏死与PTEN/PI3K/AKT通路是否有关，利用PCA对上述指标进行了分析，由图 7A所知，所有检测基因均位于三维结构中，PC1、PC2、PC3分别代表不同的3个组成部分，占比为94.6%、3.7%和0.8%。通过Pearson检验各基因之间的相关性。从结果中发现PTEN、PI3K、AKT通路以及凋亡和程序性坏死相关基因主要集中在PC1，且PI3K、AKT、BCL-2之间呈正相关，与其他因子呈负相关，相关分析结果如图 7B所示，显示相关分析的结果与PCA基本一致。提示PTEN负调控PI3K/AKT通路进而促进DEHP诱导的HD11细胞凋亡和程序性坏死。
|
图 7 主成分分析(A)及相关性分析(B) Fig. 7 Principal component analysis (A) and correlation analysis (B) |
DEHP作为无处不在的存在于食品和自然环境中的污染物，可诱发免疫系统损伤和氧化应激损伤[26-27]。研究人员发现暴露于不同剂量的DEHP，会产生大量ROS，最终导致大鼠卵巢颗粒细胞发生线粒体凋亡[15]。此外，PTEN/PI3K/AKT通路与毒性作用机制密切相关，参与了细胞凋亡和程序性坏死通路的激活[19]。本研究探讨了DEHP是否诱导鸡巨噬细胞凋亡和程序性坏死及其可能机制，本试验研究了DEHP调控ROS/PTEN/PI3K/AKT通路在DEHP诱导鸡巨噬细胞凋亡和程序性坏死中的作用，结果表明，DEHP暴露引起了HD11细胞程序性坏死和细胞凋亡，发生了氧化损伤。此外，PTEN/PI3K/AKT通路被激活，并存在剂量效应关系。诱导鸡巨噬细胞凋亡和程序性坏死。本研究为比较医学研究提供理论基础。
生物体内活性氧(ROS)生成量是一个动态变化过程，与许多内外因素有关，它直接决定是否发生氧化应激，而这也决定了细胞存活和死亡的不同调节[28]。在正常生理条件下，ROS主要被细胞内的抗氧化系统清除，从而使其维持在较低的水平参与细胞信号调节。然而，当细胞内抗氧化系统被抑制或者抗氧化系统与ROS的产生之间失去平衡时，氧化应激就会产生，当ROS过度产生便会导致氧化损伤[29]。研究显示，环境中的许多化学物质均可诱导细胞及器官产生氧化应激[30-32]。不同浓度的H2O2作用于HepG2细胞时，ROS水平显著增加并与H2O2呈剂量效应关系[33]。此外，维生素E和姜黄素单独作用均能有效减弱邻苯二甲酸二丁酯(DBP)引起的脾氧化应激损伤[34]。DEHP被证明可以诱导多种细胞和器官产生氧化应激，如斑马鱼肝细胞、人子宫内膜基质细胞以及大口黑鲈幼鱼的肝和脾[35-38]。与以往研究相似，本研究结果显示，随着DEHP暴露水平的增加，ROS和MDA水平显著升高，T-SOD、GSH-PX活性显著降低。此外，暴露于DEHP的HD11细胞中T-AOC水平显著降低。结果提示，DEHP暴露后，HD11细胞内ROS的过量生成和细胞抗氧化能力的降低，导致抗氧化酶系统的破坏，导致细胞发生氧化应激。
DEHP暴露可诱导细胞毒性损伤，这与PTEN/PI3K/AKT信号通路的激活密切相关。例如，研究发现DEHP通过上调PTEN的表达，进而下调AKT的表达，从而抑制人胚胎干细胞增殖，促进细胞周期停滞，并诱导细胞凋亡[39]。DEHP暴露通过抑制PI3K/AKT信号通路，诱导心肌细胞毒性[40]。还有研究发现DEHP可通过激活氧化应激和下调PI3K/AKT信号通路诱导骨骼肌细胞凋亡和程序性坏死[41]。与以往研究相似，本试验结果显示，DEHP暴露后，HD11细胞发生氧化损伤，DEHP处理组PTEN基因的mRNA和蛋白表达相应升高，PI3K和AKT表达降低。值得注意的是，BCL-2和RIPK1是PI3K/AKT信号转导通路的重要下游靶点，通过抑制PI3K/AKT表达，进而使BCL-2低表达和RIPK1高表达来实现凋亡和坏死[42-43]。研究人员发现，用50和500 mg·(kg·d) -1 DEHP处理小鼠35 d，会使BCL-2蛋白低表达，使Bax蛋白高表达，进而Bax与BCL-2形成异二聚体从而启动信号通路，导致线粒体损伤，最终诱导小鼠睾丸启动内质网应激诱导生殖细胞凋亡[44]。此外，500 μmol·L-1 DEHP可以上调RIPK1、RIPK3和MLKL表达水平，最终导致心肌细胞发生程序性坏死[45]。与以往研究相似，本研究发现，不同浓度DEHP暴露于HD11细胞导致BCL-2的表达水平显著降低，Bax、Caspase-3、Caspase-9表达显著增强，启动了细胞线粒体凋亡途径; 同样，RIPK1、RIPK3和MLKL的表达显著升高，说明细胞程序性坏死通路也被激活(图 8)。
|
图 8 图形摘要 Fig. 8 Graphical abstract |
本研究首次提供了DEHP暴露引起HD11细胞凋亡和程序性坏死证据。发现DEHP可抑制HD11细胞活力，导致氧化应激反应增强，进而激活了PTEN/PI3K/AKT信号通路，促进了HD11细胞凋亡和程序性坏死，并且HD11细胞的损伤程度与DEHP浓度成剂量依赖性。这些发现为阐明DEHP对禽类中毒的分子机制提供了研究基础，为寻找切实有效地治疗DEHP所致的HD11细胞损伤药物提供了思路。本研究对DEHP的毒理学研究、生态环境保护及动物和人类健康具有重要意义。
| [1] |
ROWDHWAL S S S, CHEN J X. Toxic effects of Di-2-ethylhexyl phthalate: an overview[J]. Biomed Res Int, 2018, 2018: 1750368. |
| [2] |
ERYTHROPEL H C, MARIC M, NICELL J A, et al. Leaching of the plasticizer di(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) from plastic containers and the question of human exposure[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(24): 9967-9981. DOI:10.1007/s00253-014-6183-8 |
| [3] |
LI X T, LV Z M, CHEN J, et al. Bacillus amyloliquefaciens B10 can alleviate liver apoptosis and oxidative stress induced by aflatoxin B1[J]. Food Chem Toxicol, 2021, 151: 112124. DOI:10.1016/j.fct.2021.112124 |
| [4] |
WANG Y, ZHU H K, KANNAN K. A review of biomonitoring of phthalate exposures[J]. Toxics, 2019, 7(2): 21. DOI:10.3390/toxics7020021 |
| [5] |
WANG S T, CAO Y R, WANG S C, et al. DEHP induces immunosuppression through disturbing inflammatory factors and CYPs system homeostasis in common carp neutrophils[J]. Fish Shellfish Immunol, 2020, 96: 26-31. DOI:10.1016/j.fsi.2019.11.073 |
| [6] |
YI W E I, TANG X L, ZHOU Y, et al. DEHP exposure destroys blood-testis barrier (BTB) integrity of immature testes through excessive ROS-mediated autophagy[J]. Genes Dis, 2018, 5(3): 263-274. DOI:10.1016/j.gendis.2018.06.004 |
| [7] |
SUN Y Y, YANG F, LIU Y, et al. Di-2-ethylhexyl phthalate induces heart looping disorders during zebrafish development[J]. Toxicol Ind Health, 2021, 37(7): 391-397. DOI:10.1177/07482337211019184 |
| [8] |
FENG W W, LIU Y C, DING Y Y, et al. Typical neurobehavioral methods and transcriptome analysis reveal the neurotoxicity and mechanisms of di(2-ethylhexyl) phthalate on pubertal male ICR mice with type 2 diabetes mellitus[J]. Arch Toxicol, 2020, 94(4): 1279-1302. DOI:10.1007/s00204-020-02683-9 |
| [9] |
YOU H H, LI R, WEI C X, et al. Thymic stromal lymphopoietin neutralization inhibits the immune adjuvant effect of Di-(2-ethylhexyl) phthalate in balb/c mouse asthma model[J]. PLoS One, 2016, 11(7): e0159479. DOI:10.1371/journal.pone.0159479 |
| [10] |
SERRANO K, LEVIN E, CHEN D, et al. An investigation of red blood cell concentrate quality during storage in paediatric-sized polyvinylchloride bags plasticized with alternatives to di-2-ethylhexyl phthalate (DEHP)[J]. Vox Sang, 2016, 110(3): 227-235. DOI:10.1111/vox.12355 |
| [11] |
LEE J W, PARK S, HAN H K, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate enhances melanoma tumor growth via differential effect on M1-and M2-polarized macrophages in mouse model[J]. Environ Pollut, 2018, 233: 833-843. DOI:10.1016/j.envpol.2017.10.030 |
| [12] |
YU L, LI H X, GUO J Y, et al. Di (2-ethyl hexyl) phthalate (DEHP)-induced spleen toxicity in quail (Coturnix japonica) via disturbing Nrf2-mediated defense response[J]. Environ Pollut, 2019, 251: 984-989. DOI:10.1016/j.envpol.2019.05.061 |
| [13] |
YAHYAVY S, VALIZADEH A, SAKI G, et al. Taurine ameliorates cytotoxic effects of Di(2-ethylhexyl) phthalate on Leydig cells[J]. Andrologia, 2021, 53(8): e14146. |
| [14] |
HONG Y F, ZHOU Y, SHEN L J, et al. Exposure to DEHP induces testis toxicity and injury through the ROS/mTOR/NLRP3 signaling pathway in immature rats[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2021, 227: 112889. DOI:10.1016/j.ecoenv.2021.112889 |
| [15] |
TRIPATHI A, PANDEY V, SAHU A N, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) inhibits steroidogenesis and induces mitochondria-ROS mediated apoptosis in rat ovarian granulosa cells[J]. Toxicol Res, 2019, 8(3): 381-394. DOI:10.1039/C8TX00263K |
| [16] |
HAN Q, ZHANG J Y, SUN Q, et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction involved in ammonia-induced nephrocyte necroptosis in chickens[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2020, 203: 110974. DOI:10.1016/j.ecoenv.2020.110974 |
| [17] |
TANG Y S, ZHAO Y H, ZHONG Y, et al. Neferine inhibits LPS-ATP-induced endothelial cell pyroptosis via regulation of ROS/NLRP3/Caspase-1 signaling pathway[J]. Inflamm Res, 2019, 68(9): 727-738. DOI:10.1007/s00011-019-01256-6 |
| [18] |
LI Z L, MI J, LU L, et al. The main anthocyanin monomer of Lycium ruthenicum Murray induces apoptosis through the ROS/PTEN/PI3K/Akt/caspase 3 signaling pathway in prostate cancer DU-145 cells[J]. Food Funct, 2021, 12(4): 1818-1828. DOI:10.1039/D0FO02382E |
| [19] |
WANG L Q, WANG L X, SHI X, et al. Chlorpyrifos induces the apoptosis and necroptosis of L8824 cells through the ROS/PTEN/PI3K/AKT axis[J]. J Hazard Mater, 2020, 398: 122905. DOI:10.1016/j.jhazmat.2020.122905 |
| [20] |
LIU H Y, ZHANG Y Y, ZHU B L, et al. miR-21 regulates the proliferation and apoptosis of ovarian cancer cells through PTEN/PI3K/AKT[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2019, 23(10): 4149-4155. |
| [21] |
HU S P, CHANG X X, ZHU H B, et al. PI3K mediates tumor necrosis factor induced-necroptosis through initiating RIP1-RIP3-MLKL signaling pathway activation[J]. Cytokine, 2020, 129: 155046. DOI:10.1016/j.cyto.2020.155046 |
| [22] |
CHEN H J, ZHANG Y, ZOU M M, et al. Bisphenol A aggravates renal apoptosis and necroptosis in selenium-deficient chickens via oxidative stress and PI3K/AKT pathway[J]. J Cell Physiol, 2022, 237(8): 3292-3304. DOI:10.1002/jcp.30781 |
| [23] |
ZHANG J Q, ZHENG S F, WANG S C, et al. Cadmium-induced oxidative stress promotes apoptosis and necrosis through the regulation of the miR-216a-PI3K/AKT axis in common carp lymphocytes and antagonized by selenium[J]. Chemosphere, 2020, 258: 127341. DOI:10.1016/j.chemosphere.2020.127341 |
| [24] |
FU Y Y, DONG J, WANG J N, et al. Developmental exposure to Di-(2-ethylhexyl) phthalate induces cerebellar granule cell apoptosis via the PI3K/AKT signaling pathway[J]. Exp Neurobiol, 2018, 27(6): 472-488. DOI:10.5607/en.2018.27.6.472 |
| [25] |
FU G Q, DAI J, LI Z, et al. The role of STAT3/p53 and PI3K-Akt-mTOR signaling pathway on DEHP-induced reproductive toxicity in pubertal male rat[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2020, 404: 115151. DOI:10.1016/j.taap.2020.115151 |
| [26] |
KITAOKA M, HIRAI S, TERAYAMA H, et al. Effects on the local immunity in the testis by exposure to di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) in mice[J]. J Reprod Dev, 2013, 59(5): 485-490. DOI:10.1262/jrd.2012-180 |
| [27] |
HOSSEINZADEH A, MEHRZADI S, SIAHPOOSH A, et al. The ameliorative effect of ellagic acid on di-(2-ethylhexyl) phthalate-induced testicular structural alterations, oxidative stress, inflammation and sperm damages in adult mice[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2021, 19(1): 146. DOI:10.1186/s12958-021-00830-0 |
| [28] |
FORRESTER S J, KIKUCHI D S, HERNANDES M S, et al. Reactive oxygen species in metabolic and inflammatory signaling[J]. Circ Res, 2018, 122(6): 877-902. DOI:10.1161/CIRCRESAHA.117.311401 |
| [29] |
JAKUBCZYK K, DEC K, KAŁDUŃSKA J, et al. Reactive oxygen species-sources, functions, oxidative damage[J]. Pol Merkur Lekarski, 2020, 48(284): 124-127. |
| [30] |
CHENG C H, MA H L, DENG Y Q, et al. Oxidative stress, cell cycle arrest, DNA damage and apoptosis in the mud crab (Scylla paramamosain) induced by cadmium exposure[J]. Chemosphere, 2021, 263: 128277. DOI:10.1016/j.chemosphere.2020.128277 |
| [31] |
HUANG M Q, LIU S, FU L, et al. Bisphenol A and its analogues bisphenol S, bisphenol F and bisphenol AF induce oxidative stress and biomacromolecular damage in human granulosa KGN cells[J]. Chemosphere, 2020, 253: 126707. DOI:10.1016/j.chemosphere.2020.126707 |
| [32] |
GENG L J, XIA Z H, YUAN L, et al. Effects of β-HgS on cell viability and intracellular oxidative stress in PC-12 cells[J]. Metallomics, 2020, 12(9): 1389-1399. DOI:10.1039/d0mt00088d |
| [33] |
WU Z M, WANG H G, FANG S Y, et al. Roles of endoplasmic reticulum stress and autophagy on H2O2-induced oxidative stress injury in HepG2 cells[J]. Mol Med Rep, 2018, 18(5): 4163-4174. |
| [34] |
WANG X L, YAN X, YANG Y Y, et al. Dibutyl phthalate-mediated oxidative stress induces splenic injury in mice and the attenuating effects of vitamin E and curcumin[J]. Food Chem Toxicol, 2020, 136: 110955. DOI:10.1016/j.fct.2019.110955 |
| [35] |
PARK C G, SUNG B, RYU C S, et al. Mono-(2-ethylhexyl) phthalate induces oxidative stress and lipid accumulation in zebrafish liver cells[J]. Comp Biochem Physiol Part C: Toxicol Pharmacol, 2020, 230: 108704. DOI:10.1016/j.cbpc.2020.108704 |
| [36] |
BALLY M B, OPHEIM D J, SHERTZER H G. Di-(2-ethylhexyl) phthalate enhances the release of lysosomal enzymes from alveolar macrophages during phagocytosis[J]. Toxicology, 1980, 18(1): 49-60. DOI:10.1016/0300-483X(80)90037-2 |
| [37] |
CHO Y J, PARK S B, HAN M. Di-(2-ethylhexyl)-phthalate induces oxidative stress in human endometrial stromal cells in vitro[J]. Mol Cell Endocrinol, 2015, 407: 9-17. DOI:10.1016/j.mce.2015.03.003 |
| [38] |
LIAO H P, LIU S L, JUNAID M, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate exacerbated the toxicity of polystyrene nanoplastics through histological damage and intestinal microbiota dysbiosis in freshwater Micropterus salmoides[J]. Water Res, 2022, 219: 118608. DOI:10.1016/j.watres.2022.118608 |
| [39] |
FANG H Q, FANG W T, CAO H W, et al. Di-(2-ethylhexyl)-phthalate induces apoptosis via the PPARγ/PTEN/AKT pathway in differentiated human embryonic stem cells[J]. Food Chem Toxicol, 2019, 131: 110552. DOI:10.1016/j.fct.2019.05.060 |
| [40] |
YU D M, ZHU D W, WANG X F, et al. Prenatal di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure induced myocardial cytotoxicity via the regulation of the NRG1-dependent ErbB2/ErbB4-PI3K/AKT signaling pathway in fetal mice[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2022, 241: 113771. DOI:10.1016/j.ecoenv.2022.113771 |
| [41] |
LIU X J, ZHANG Y L, SUN X Y, et al. Di-(2-ethyl hexyl) phthalate induced oxidative stress promotes microplastics mediated apoptosis and necroptosis in mice skeletal muscle by inhibiting PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. Toxicology, 2022, 474: 153226. DOI:10.1016/j.tox.2022.153226 |
| [42] |
GONG Y, LUO S, FAN P, et al. Growth hormone activates PI3K/Akt signaling and inhibits ROS accumulation and apoptosis in granulosa cells of patients with polycystic ovary syndrome[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2020, 18(1): 121. DOI:10.1186/s12958-020-00677-x |
| [43] |
LIU L L, LIU X L, ZHAO L Y, et al. 1, 8-cineole alleviates bisphenol A-induced apoptosis and necroptosis in bursa of Fabricius in chicken through regulating oxidative stress and PI3K/AKT pathway[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2021, 226: 112877. DOI:10.1016/j.ecoenv.2021.112877 |
| [44] |
ZHU B B, ZHANG Z C, LI J, et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate induces testicular endoplasmic reticulum stress and germ cell apoptosis in adolescent mice[J]. Environ Sci Pollut Res Int, 2021, 28(17): 21696-21705. DOI:10.1007/s11356-020-12210-z |
| [45] |
ZHENG Y Y, SHI G L, CAI J Z, et al. Di-(2-ethyl hexyl) phthalate induces necroptosis in chicken cardiomyocytes by triggering calcium overload[J]. J Hazard Mater, 2020, 387: 121696. DOI:10.1016/j.jhazmat.2019.121696 |
(编辑 白永平)