2. 青海大学农牧学院, 西宁 810003;
3. 青海省动物疫病病原诊断与绿色防控技术研究重点实验室, 西宁 810003
2. College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810003, China;
3. Qinghai Provincial Key Laboratory of Pathogen Diagnosis for Animal Diseases and Green Technical Research for Prevention and Control, Xining 810003, China
沙门菌病是一种人兽共患传染病,沙门菌感染人和动物后能引起胃肠炎,伤寒及副伤寒甚至死亡等,不仅给全球养殖业造成了重大的经济损失,还能通过动物产品污染对人类的生命健康造成严重威胁[1-2]。近年来,随着沙门菌的多重耐药现象日益严峻和国家提倡的养殖业“替抗减抗”政策的不断推行,抗生素替代技术的开发研究显得日益紧迫,噬菌体作为抗生素替代物在预防和治疗细菌感染方面具有无限应用潜力而受到越来越多的关注[3]。噬菌体在自然界中种类繁多、数量巨大,不仅易从各种环境中分离得到,还能特异性裂解多重耐药病原菌且不破坏环境中其它正常菌群[4-5]。目前,噬菌体在医疗、食品加工和畜牧养殖等很多行业得到应用,如美国食品药品监督管理局(FDA)已批准噬菌体可作为食品添加剂用于控制食品加工过程中单核细胞增生李斯特菌和O157:H7大肠杆菌的污染[6-7]。本研究分离了1株烈性沙门菌噬菌体SP3,对其形态学、生物学特性和基因组特点及遗传进化关系进行了分析,为噬菌体预防和治疗沙门菌感染提供研究基础。
1 材料与方法 1.1 试验菌株试验涉及的18株沙门菌和8株大肠杆菌来源于本实验室分离鉴定与保存。
1.2 主要试剂400目铜网购自北京中镜科仪技术有限公司;1%磷钨酸溶液购自北京索莱宝科技有限公司;0.22 μm滤器购自美国Millipore公司;LB培养基购自青岛海博生物技术有限公司;Tris-平衡酚购自北京索莱宝科技有限公司。
SM缓冲液:0.01%明胶,100 mmol·L-1 NaCl, 10 mmol·L-1 MgSO4, 500 mmol·L-1 Tris/HCl,pH=7.0。
1.3 噬菌体的分离筛选1.3.1 样品采集和处理 从西宁市奶牛养殖场附近采集污水样品500 mL,室温静置6 h,收集上层液体,加入CaCl2至终浓度为1 mol·L-1,5 000 r·min-1离心10 min,取上清液100 mL用0.22 μm滤器过滤除菌,得到滤液。
1.3.2 分离与纯化 取10 mL的滤液与100 mL沙门菌液混合后于恒温摇床37 ℃培养12 h;次日离心后取100 μL上清液与等量沙门菌液混合孵育10 min,倒置双层平板后37 ℃过夜培养,次日观察是否出现噬菌斑。用无菌巴氏吸管挑取单个噬菌斑,放入SM缓冲液中室温解离4 h,取100 μL解离液与沙门菌菌液混合,通过双层平板法进行4~5次纯化。
1.3.3 浓缩与超速离心 用PEG8000和NaCl对纯化的噬菌体进行浓缩,操作方法见参考文献[8];对浓缩后的噬菌体进行超离,步骤如下:SM缓冲液配制密度分别为ρ= 1.45、1.50和1.70 g·mL-1的氯化铯溶液,并在浓缩的噬菌体液中加入氯化铯至终浓度为1.15 g·mL-1,每支离心管中依次加入2 mL的不同浓度的氯化铯溶液,再加入6 mL已加氯化铯的噬菌体浓缩液,在4 ℃和25 000 r·min-1离心4 h,离心结束后吸取噬菌体层,4 ℃保存。
1.4 噬菌体的电镜观察吸取5 μL效价为109~1010 PFU·mL-1的超离的噬菌体液轻轻滴加在铜网的碳涂层面,在室温下静置10 min,用干净滤纸吸干铜网上的液体,然后再滴加5 μL的1%磷钨酸溶液负染2 min,用干净滤纸吸干铜网上残余的染液,用透射电镜观察噬菌体形态并拍照。
1.5 噬菌体的生物学特性研究1.5.1 宿主谱 以双层平板法测定噬菌体对18株多重耐药性沙门菌和8株不同血清型的大肠杆菌的宿主谱,具体试验方法见“1.3.2”,以沙门菌QH为指示菌,计算成斑率(EOP)。
成斑率(EOP)=噬菌体对不同测试菌株的裂解效价/噬菌体对指示菌的裂解效价
1.5.2 一步生长曲线 按参考文献方法[9]进行试验,具体如下:沙门菌QH(OD600 nm=0.6)的培养液中,以感染复数为0.01加入噬菌体,继续37 ℃、200 r·min-1培养8 h,每隔一定时间取培养液100 μL在离心机中12 000 r·min-1离心10 min,取上清液与等体积的沙门菌QH液混合,37 ℃孵育10 min,倒置双层平板,培养箱中37 ℃过夜培养,次日计数双层平板上的噬菌斑,试验重复3次,计算出不同时间点培养液中的噬菌体效价。
1.5.3 最佳感染复数 将噬菌体按照不同的感染复数(MOI =10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1、10、102、103、104、105和106)与等体积的沙门菌QH菌液混合,37 ℃孵育10 min,8 000 r·min-1离心10 min,除去上清液中未吸附的游离噬菌体,将所得的沉淀加入10 mL的LB液体培养基中,37 ℃ 200 r·min-1培养4 h, 再取培养液通过双层平板法测定噬菌体的效价,试验重复3次,计算出不同感染复数下的噬菌体效价,并确定噬菌体的最佳MOI。
1.5.4 pH稳定性 使用浓盐酸或氢氧化钠溶液将SM缓冲液调整至pH为2~13,取100 μL噬菌体置于900 μL的不同pH的SM缓冲液中,37 ℃静置2 h后,通过双层平板法测定不同pH条件下噬菌体在沙门菌QH中的效价。
1.5.5 温度稳定性 取噬菌体液100 μL在10、20、30、40、50、60、70和80 ℃条件下,静置2 h,利用双层平板法测定噬菌体在沙门菌QH中的效价。
1.5.6 噬菌体对不同血清学沙门菌的抑菌能力和耐受菌检测 为研究噬菌体对不同血清型沙门菌的抑菌能力,参照文献方法[10]进行试验:将培养至稳定期(OD600 nm约为1.0)的3株沙门菌液(丙型副伤寒沙门菌QH,肠炎沙门菌GN19和鼠伤寒沙门菌YS01)分为两组,其中试验组按MOI=0.01接种噬菌体SP3,对照组不做任何处理,两组菌液37 ℃和200 r·min-1持续培养12 h,从0 h开始每隔1 h取样,采用平板菌落计数法测定培养液中沙门菌的浓度,测定重复3次。
通过次级感染试验[8]检测是否出现噬菌体耐受株,具体如下:将上述试验组菌液持续培养至24 h,取培养液在LB平板上划线,并37 ℃过夜培养, 次日挑选若干单菌落分别接种到LB液体培养基,在37 ℃,200 r·min-1培养至对数期后,通过双层平板法检测各菌株是否对噬菌体SP3耐受。
1.6 噬菌体基因组的提取和测序1.6.1 基因组提取 噬菌体基因组提取参考文献[8],具体操作如下:在超离的噬菌体液中加入DNase Ⅰ和RNase Ⅰ至终浓度为1 μg·mL-1,37 ℃作用30 min;再加入蛋白酶K和SDS分别至终浓度为50 μg·mL-1和0.5%,混匀后56 ℃水浴1 h;加入等体积的Tris-平衡酚后混匀;12 000 r·min-1,4 ℃离心10 min;吸取上清液并加入等体积的Tris-平衡酚,再次抽提;在上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)混匀后,12 000 r·min-1,4 ℃离心10 min;收集上清液,加入2倍体积的无水乙醇,4 ℃静置30 min;12 000 r·min-1,4 ℃离心10 min;弃上清,打开管盖,至乙醇完全挥发;加入50~100 μL的TE缓冲液溶解噬菌体基因组;-20 ℃保存。
1.6.2 全基因组测序和生物信息学分析 将提取的噬菌体基因组送至广东惠通生物科技有限公司,通过Illumina HiSeq 2500平台进行建库测序,并对基因组进行拼接,得到完整的基因序列。应用EditSeq对全基因组组分分析;采用tRNAscan-SE预测全基因组中的tRNA; 使用ORF finder预测噬菌体的ORF,用Smart Blast对预测的ORF进行验证并注释,进行序列相似性及编码基因的注释;通过VFDB和CARD分别预测毒力和耐药基因;最后将基因组上传至NCBI获得序列号。选择噬菌体的末端大亚基酶、主要衣壳蛋白和尾纤丝蛋白基因序列在NCBI进行比对,并下载同源性较高的序列,用MEGA7.0中的Neighbor-joining法构建系统发育进化树;将噬菌体SP3基因组在NCBI中进行Blast比对,下载同源性最高的10条噬菌体基因组,用BRIG和Artemis Comparison Tool进行基因组比较分析和可视化。
2 结果 2.1 噬菌体的分离筛选及形态学观察通过双层平板法从样品中分离出1株以丙型副伤寒沙门菌QH为宿主的噬菌体,并命名为SP3。电镜观察发现噬菌体SP3头部为正多面体,平均直径为70 nm;有一条长而收缩的尾巴,尾巴平均长度为130 nm (图 1)。
利用实验室保存的18株沙门菌和8株大肠杆菌对噬菌体SP3进行宿主谱鉴定发现,SP3能裂解3种不同血清型共8株沙门菌(包括4株鼠伤寒沙门菌、对3株肠炎沙门菌和1株丙型副伤寒沙门菌),对不同血清型沙门菌的EOP由高到低依次为丙型副伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌,但不能裂解大肠杆菌,详见表 1。
一步生长曲线测定结果表明,噬菌体SP3的潜伏期约为40 min,而爆发期为40~160 min (图 2a),此时噬菌体的效价可达5.5×108 PFU·mL-1,而感染初期宿主菌QH的含量为5.0×106 CFU·mL-1,计算得知噬菌体SP3的爆发量为110 PFU·cell-1;将噬菌体SP3与宿主菌QH按不同的MOI混合后测定效价发现,SP3最佳MOI为0.000 1 (图 2b);pH耐受性试验发现,在pH 4.0~11.0时,噬菌体SP3的效价无明显变化,但当pH>11或<4时噬菌体活性快速下降直至完全失活,表明SP3对碱性环境的耐受性较强,但对酸性环境的耐受性较弱(图 2c);噬菌体SP3经20~50 ℃水浴处理2 h后,效价无显著变化,但随着温度的逐渐升高,效价急剧下降,70 ℃时大部分失活,80 ℃时完全失活(图 2d)。
抑菌能力试验表明,在丙型副伤寒沙门菌QH、肠炎沙门菌GN19和鼠伤寒沙门菌YS01中加入噬菌体SP3后,上述3种沙门菌液中的活菌量持续下降,分别于5、5和7 h时达到最低(图 3),表明噬菌体SP3对不同血清型沙门菌的抑菌效果存在差异;次级感染试验发现,噬菌体SP3与上述3株不同血清型沙门菌持续共培养24 h后,再次分离的菌株与噬菌体SP3互作后,通过双层平板法检测发现均无噬菌斑出现,表明上述3种不同血清型沙门菌与噬菌体SP3长期互作后,均能产生耐受性。
噬菌体SP3的基因组(MW296 865.1)大小为88 039 bp,GC%为38.85%,共有130个开放阅读框(ORF),编码基因全长77 746 bp,基因平均长度为698 bp,编码基因共占比88.31%;其中大部分编码功能未知的假定蛋白,仅32个ORFs与已知的功能基因有较高的相似性,包括噬菌体结构基因、DNA复制和细菌裂解相关酶的编码基因等,未发现编码整合酶、切除酶或阻遏物等与溶原有关的基因,表明是一株烈性噬菌体;SP3基因组含有22个编码tRNA的序列,转运包括Pro(脯氨酸)、Glu(谷氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Tyr(酪氨酸)、Asp(天冬氨酸)、Lys(赖氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Arg(精氨酸)、Leu(亮氨酸)、Ala(丙氨酸)、Gly(甘氨酸)、Thr(苏氨酸)、Val(缬氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、His(组氨酸)和Phe(苯丙氨酸)在内的共17种氨基酸。
基于主要衣壳蛋白构建的系统进化树表明,噬菌体SP3与大肠杆菌噬菌体SP22(LC519 489.1,日本)和沙门菌噬菌体S19cd(MZ150 758.1,中国)位于同一进化分支(图 4);基于末端酶大亚基构建的系统进化树表明,噬菌体SP3与大肠杆菌噬菌体SEM50(MT887 289.1,韩国)、大肠杆菌噬菌体vB EcoM Shy(MT833 282.1,葡萄牙)、大肠杆菌噬菌体JN01(MN882 542.1,中国)、大肠杆菌噬菌体PHB11(MK524 176.1,中国)以及沙门噬菌体vB SalM SPJ41(ON868 915.1,中国)位于同一进化分支(图 5);根据ICTV(https://ictv.global/taxonomy)的最新分类标准发现,噬菌体SP3与上述位于同一分支的其它噬菌体均属于Duplodnaviria圈、Heunggongvirae界、Uroviricota门、Caudoviricetes纲、Ounavirinae亚目、Felixounavirus属;对SP3的尾纤丝蛋白Blastbn比对发现,与大肠杆菌噬菌体humlepung(MN850 564.1)和nataliec(MN850 611.1)的相似性最高,与二者的覆盖度(cover)分别为51%和63%,序列比对的一致度(Per ident)分别为88.97% 和98.31%;同时基于尾纤丝蛋白构建的系统进化树表明,噬菌体SP3与humlepung和nataliec(MN850 611.1)位于同一进化分支(图 6),与其它沙门菌噬菌体的尾纤丝蛋白遗传进化距离较远。
将SP3基因组在NCBI中Blastn得到10条相似性最高的噬菌体基因组中,6条为大肠杆菌噬菌体(MT833 282.1、NC_027 369.1、MN882 542.1、MK524 176.1、OQ174 507.1和OL825 705.1),3条为沙门菌噬菌体(MN227 145.1、MZ150 758.1和OL656 108.1),1条为志贺菌噬菌体(MN655 999.1)。以噬菌体SP3为参考基因组,通过BRIG与上述10条基因组进行比对和可视化发现(图 7),11株噬菌体的大部分基因(尤其是已知的功能基因)同源性很高,仅少部分基因同源性很低,这些基因主要分布在基因组6个区域,且大部分基因编码功能未知的假定蛋白;其中,Region 1包括ORF 14-18,Region 2包括ORF 45-52,Region 3包括ORF 68和69,Region 4包括ORF 83、84、86和87,Region 5包括ORF 99-101,Region 6包括ORF129;对以上区域中基因编码的蛋白序列进一步的blastp发现,仅部分ORF编码蛋白与已知的功能蛋白具有较高的相似性,如ORF 69与Escherichia phage EC6中gp128有较高相似性(92.80%),ORF 83与Escherichia phage EC6中gp006有较高相似性(97.30%),ORF101与Escherichia phage EC6中gp024有较高相似性(86.25%),而ORF129与Escherichia phage nataliec编码的tail fibers protein有较高相似性(73.29%)。
选取相似性最高的Escherichia phage JN01(MN882 542.1)和Salmonella phage S19cd(MZ150 758.1)与SP3进行基因组共线性分析发现,噬菌体SP3基因组上主要的模块区域(蓝、橙和绿色区域)相似性很高,而且这3个区域含有的基因也相同或高度相似,表明噬菌体SP3基因组有重排现象发生(图 8)。
在本研究中分离了一株烈性沙门菌噬菌体SP3,该噬菌体具有较宽的宿主谱和较强的pH和温度耐受性。pH和温度耐受范围与芩鑫等[11]分离的沙门菌噬菌体S5接近,能在pH4~11和10~50 ℃保持高活性;噬菌体SP3的潜伏期(40 min)比噬菌体L6jm(15 min)[12]、KM104(6 min)[13]、S5(5 min)[11]和PEA2-3(20 min)[14]更长,但其爆发期(120 min)比KM104(62 min)、S5(90 min)和PEA2-3(80 min)更长,与L6jm(120 min)相同;此外沙门菌噬菌体SP3的爆发量较高,高于噬菌体JN-S202001(67 PFU/cell)[15]、v B_EcoS_AH50(67 PFU·cell-1)[16]、vB_CpeS_SD72(28.5 PFU·cell-1)[17]和PSM6(56 PFU·cell-1)[18],与vB_EcoM_F2(101 PFU·cell-1)[19]接近,低于SJT-90(141 PFU·cell-1)[20]和vB_EcoM_GXBP08(154 PFU·cell-1)[21];其最佳MOI为0.000 1,低于L6jm(0.01)、KM104(0.1)和PEA2-3(0.01);噬菌体SP3的体外抑菌能力与喻胜孟[22]报道的大肠杆菌噬菌体相似,即在0~1 h内抑菌效果较弱,1~6 h内抑菌效果不断增强,6~7 h内抑菌效果达到最强,随后抑菌效果迅速下降,菌液中活菌数量不断增加。研究发现噬菌体与细菌在长期互作过程中,细菌可以通过多种防御性机制获得对噬菌体的抗性,如大肠杆菌即可以通过群体感应系统下调菌体表面受体数量来阻止噬菌体的吸附[23],也可以通过外膜囊泡中和噬菌体的感染[24];铜绿假单胞菌可在群体感应系统和CRISPR-Cas系统的共同作用下提高对噬菌体的耐受[25];此外,受体合成相关基因的缺失或突变也会导致噬菌体感染失败,如通过自然突变出现的铜绿假单胞菌PA1突变株基因组缺失了galU基因后,使得突变株丢失作为噬菌体受体的O抗原而获得耐受性[26];而对噬菌体耐受的鼠伤寒沙门菌突变株的研究发现,与毒力和脂多糖合成的相关基因表达发生了下调后,导致噬菌体对该突变株的吸附率急剧下降[27]。以上研究表明,噬菌体与细菌在互作的过程中,宿主细菌很容易通过各种机制产生对噬菌体的抗性,而此类难题的解决方式之一就是通过多种噬菌体配制噬菌体鸡尾酒来防止耐受菌的产生,如包红朵等[28]研究发现由多株噬菌体制备的鸡尾酒JS-SP1对6种不同血清型的沙门菌的抑菌效果明显优于单株噬菌体组。噬菌体SP3的环境耐受力强特点可以使其在胃肠道和高温等不良环境中保持高活性,其较低的感染复数有助于降低生产成本,而较长的爆发期和高爆发量的特点可以用于在短时间内杀死大量的沙门菌,但也存在着长期互作后宿主菌易产生耐受性等缺点,因此可以合理通过与其它噬菌体配制鸡尾酒等方式解决这一弊端,才能充分发挥其在环境消毒和临床治疗等方面的应用潜力。
在细菌多重耐药现象日益严重和国家提倡全面禁抗的背景下,噬菌体疗法作为一种“替抗”的绿色防治技术,具有易获得、宿主谱窄、环境耐受力强、可杀灭多重耐药菌、治疗所需剂量小和安全无副作用等优点[29]。然而用于实际生产中的噬菌体不仅需要爆发量大和裂解力强等优点,还必须遗传背景清楚,且不携带毒力、耐药和溶源相关等不良基因[30]。通过对噬菌体SP3的全基因组测序分析发现,SP3编码的130个基因中,尽管大部分基因编码功能未知的假定蛋白,但其不携带任何毒力、耐药和溶原相关基因,此外SP3携带22个编码tRNA的序列,研究发现噬菌体携带的tRNA能通过弥补宿主菌缺少的tRNA而提高裂解酶等蛋白的翻译效率外;并且携带的tRNA越多,噬菌体的裂解性越强,如烈性噬菌体就含有比温和噬菌体更多的tRNA[31]。以上研究结果表明噬菌体SP3作为生物防治手段的安全性高,不会水平转移有害基因。通过对噬菌体SP3的形态学观察和基于两种结构蛋白(major capsid protein和large subunit terminase)的编码基因构建的系统发育树表明SP3是属于Ounavirinae亚目、Felixounavirus属,与已知的不同地理位置分离的沙门菌噬菌体和大肠杆菌噬菌体的亲缘关系很近,具有共同的遗传进化起源;SP3与上述噬菌体的大部分编码基因相似性很高,而包含部分结构蛋白编码基因在内的少数基因的低相似性是造成SP3与上述噬菌体进化差异的主要因素。研究发现,尾纤丝蛋白属于受体结合蛋白(receptor binding protein, RBP),是噬菌体用于特异性识别和吸附宿主受体的关键结构,直接决定着噬菌体的宿主范围[32]。本研究中,由于实验室存储和用于测试宿主谱的大肠杆菌菌株数量有限,噬菌体SP3虽然未能裂解8株大肠杆菌,但基于尾纤丝蛋白基因构建的系统进化树发现,相比于其它沙门菌噬菌体,噬菌体SP3的尾纤丝蛋白与大肠杆菌噬菌体的亲缘关系更近,表明SP3可能能裂解其它大肠杆菌菌株。噬菌体SP3与亲缘关系最近的噬菌体基因组共线性比较发现,多个具有相似或相关生物学功能的基因聚集并进行重新排列,证实了基因组重排在不同噬菌体之间是非常普遍和共性的[33],而研究表明基因组重排与噬菌体经历过选择压力有关[34],以上说明噬菌体SP3在进化过程中可能在选择压力作用下,通过复杂的基因水平转移、突变和重组等演化而来。
4 结论分离出一株烈性沙门菌噬菌体SP3,具有对不良环境耐受力强、感染复数小、爆发量大且不携带任何有害基因等优点,在环境消杀和临床治疗等方面具有一定的应用潜力。
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(编辑 白永平)