禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV)分为5个种(A~E)，12个血清型[1]。临床上与FAdV感染相关的主要是FAdV-4引起的心包积液综合征(HPS)及FAdV-8b引起的包涵体肝炎(IBH)，给我国养禽业造成了巨大的经济损失[2-4]。纤突蛋白(Fiber)是FAdV的主要结构蛋白，能够编码中和抗原表位，参与体液免疫，使动物产生中和抗体[5-7]。其中，FAdV-4有两个Fiber(Fiber1和Fiber2)，FAdV-8b只有一个Fiber[8-10]。Gupta等[11]研究表明重组fiber蛋白临床保护率可达到82.7%，能够很好地阻止包涵体肝炎的发生，对预防由FAdV-8b引起的包涵体肝炎具有很好的防制效果。Luca等[9]研究表明FAdV-8b的Fiber蛋白免疫后对子代有一定的保护效果。研究证实重组fiber2蛋白作为免疫原对FAdV-4引起的心包积液综合征的防控具有很好的效果[12-14]，可作为FAdV亚单位疫苗的候选蛋白，具有很好的应用前景。我们前期将制备的FAdV-4和FAdV-8b单因子血清进行细胞交叉中和试验，结果表明FAdV-4和FAdV-8b的血清不能相互中和[15]。目前，尚未见有关禽腺病毒FAdV-4和FAdV-8b二价亚单位疫苗的研究，研发针对FAdV-4和FAdV-8b的二价疫苗具有重要的应用价值。本研究将FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber的全长蛋白、截短蛋白及二价融合蛋白成功在大肠杆菌中表达，并对其免疫原性进行了评价，以期为禽腺病毒FAdV-4和FAdV-8b二价亚单位疫苗的研发奠定基础。
1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂1.1.1 主要试剂 Ⅰ群禽腺病毒FAdV-4和FAdV-8b为青岛农业大学预防兽医实验室分离、鉴定并保存；pCold-TF载体，大肠杆菌DH5ɑ、BL21(DE3)，FAdV-4和FAdV-8b阳性血清均由青岛农业大学预防兽医实验室保存；T3 Super PCR Mix购自北京擎科生物科技有限公司；T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；His-Tagged蛋白纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；HRP标记兔抗鸡IgG抗体、7号白油、BCA蛋白浓度试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。
1.1.2 实验动物 150枚SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；SPF雏鸡由SPF鸡胚自行孵化并在负压隔离器中饲养至所需日龄。
1.2 重组表达质粒的构建及鉴定根据FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber基因序列设计截短片段(FP和BP)、融合片段(BP-FP)及全长(FL和BL)引物，引物送生工生物工程有限公司合成，引物序列见表 1。
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表 1 FAdV-4 fiber-2和FAdV-8b fiber基因扩增引物 Table 1 Primers of FAdV-4 fiber-2 and FAdV-8b fiber gene |
以实验室保存的FAdV-4和FAdV-8b毒株的DNA为模板，使用FP、FL、BP、BL引物扩增目的基因，PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶回收。使用BP-F和F-Linker引物、Linker-F2和FP-R引物分别进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后各取1 μL混合当模板，使用BP-F和FP-R引物扩增BP-FP目的基因，PCR反应程序同上，进行琼脂糖凝胶回收。将FP、FL、BP、BL、BP-FP回收产物和pCold-TF空载体用Xba Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，用T4 DNA连接酶连接纯化回收的酶切产物，转化DH5ɑ感受态细胞，提取转化子质粒，进行酶切验证和测序鉴定。
1.3 重组蛋白的表达及纯化将测序正确的5个重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布于氨苄抗性的LB平板，37 ℃过夜培养。挑单菌落接种于氨苄抗性的LB培养基中，37 ℃、220 r·min-1培养至OD600 nm为0.6左右，加入1 mol·L-1的IPTG，16 ℃诱导表达12 h。收集表达后的菌体沉淀，冰浴超声破碎菌体，12 000 r·min-1离心5 min，SDS-PAGE分析蛋白表达情况。超声破碎后菌体上清按照His-Tagged蛋白纯化试剂盒说明书进行目的蛋白纯化。
1.4 重组蛋白的Western blot鉴定纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳后湿转至PVDF膜，使用FAdV-4和FAdV-8b阳性血清为一抗，HRP标记兔抗鸡IgG抗体为二抗，对纯化蛋白进行Western blot鉴定，用ECL化学发光后，凝胶成像系统观察并拍照。
1.5 重组蛋白免疫效果评价1.5.1 动物分组及处理 将纯化后的蛋白与油相1∶2混合。108只1日龄SPF鸡随机分成9组。1~6组(FL、FP、BP-FP4、BP-FP8b、BL、BP)为免疫组，7日龄皮下注射疫苗100 μg·只-1，14日龄进行二免；7~8组(C4、C8b)为攻毒对照组，9组(C)为空白对照组。二免后7 d，FL、FP、BP-FP4、C4组肌肉注射FAdV-4(107.5 TCID50·mL -1)，BL、BP、BP-FP8b、C8b组肌肉注射FAdV-8b(107.5 TCID50·mL -1)，攻毒剂量为0.2 mL·只-1。在免疫前，免疫后7、14、21 d心脏采血并分离血清；攻毒后3、7 d采集攻FAdV-8b组的泄殖腔拭子；攻毒后7 d采集各组鸡肝脏样品。
1.5.2 抗体水平检测 用间接ELISA进行抗体水平检测，采用浓度为1 μg·mL-1的BP-FP蛋白包被过夜，用1% BSA 37 ℃封闭1 h，洗后加入1∶1 000稀释的血清37 ℃孵育1 h，洗后加入1∶5 000稀释的兔抗鸡IgG-HRP 37 ℃孵育1 h，洗后加入显色液避光孵育30 min，终止显色后读取OD450 nm值。
1.5.3 免疫攻毒保护 攻毒后每天观察鸡的健康状况，记录死亡数量，计算存活率。
1.5.4 排毒量检测 所有攻FAdV-8b的鸡在攻毒3、7 d后取泄殖腔拭子置于含有抗生素的无菌生理盐水中，提取DNA，经qPCR检测排毒量。根据FAdV-8b Hexon基因与其它血清型禽腺病毒差异显著的保守区域设计引物，引物序列为F 5′-CTACGGCAACAGCTGGGGCAA-3′；R 5′-TGTGCAGTGGTGTCTAAC-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应体系：模板1 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×SYBR Mix 10 μL，加水至20 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环；熔解曲线反应条件为95 ℃10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃1 s。每个样本设3个重复。按照公式拷贝数(拷贝·μL -1)=6.02×1023(拷贝·mol-1)×质粒浓度(ng·μL -1)×10-9/[(载体分子量+插入片段分子量)×660](g·mol -1)绘制标准曲线。
1.5.5 细胞因子mRNA表达水平检测 根据文献[16-17]合成IL-4、TNF-α、IFN-γ和内参基因β-actin引物。取攻毒7 d后所有鸡的肝脏进行研磨，提取RNA，经RT-PCR反转录成cDNA，以β-actin作为内参基因经qPCR检测IL-4、IFN-γ和TNF-α mRNA表达水平。qPCR反应程序同“1.5.4”。
1.6 数据分析抗体水平、排毒量及细胞因子mRNA表达水平检测数据均用Prism 5.0软件进行统计分析，使用t检验法进行差异性显著分析，P＜0.05代表差异显著。
2 结果 2.1 重组表达载体的构建及鉴定如图 1所示，重组质粒经双酶切后，均出现载体片段和目的片段，FL、FP、BP-FP、BL和BP基因大小与预期一致，表明原核重组质粒构建成功。经测序进一步确定重组表达质粒构建成功。
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M.相对分子质量标准；1.FL；2.FP；3.BP-FP；4.BL；5. BP M. Standard molecular weight; 1.FL; 2.FP; 3.BP-FP; 4.BL; 5.BP 图 1 重组表达质粒的双酶切鉴定 Fig. 1 Results of double digestion of recombinant expression plasmids |
经SDS-PAGE检测，结果如图 2A所示，成功表达出大小为104.9、70.6、92.3、100.3和69.2 ku的重组蛋白，且均在上清中以可溶性形式表达。将BP-FP、BL、BP、FL和FP蛋白上清用蛋白纯化试剂盒纯化，纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE分析(图 2B)。
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M.标准分子质量；1.BL沉淀；2.BL上清；3.BP沉淀；4.BP上清；5.BP-FP上清；6.BP-FP沉淀；7.FL上清；8.FL沉淀；9.FP上清；10.FP沉淀；11.FP；12.FL；13.BP-FP；14.BL；15.BP M. Standard molecular weight; 1.BL precipitation; 2.BL supernatant; 3.BP precipitation; 4.BP supernatant; 5.BP-FP supernatant; 6.BP-FP precipitation; 7.FL supernatant; 8.FL precipitation; 9.FP supernatant; 10.FP precipitation; 11.FP; 12.FL; 13.BP-FP; 14.BL; 15.BP 图 2 各样品中重组蛋白(A)及其纯化后(B)的SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins in each sample (A) and their purified proteins (B) |
重组蛋白Western blot鉴定结果如图 3，FP、FL、BP-FP、BP、BL蛋白条带大小分别为69.2、100.3、92.3、70.6、104.9 ku，与预期大小一致，表明重组蛋白在原核系统中成功表达。
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A.FAdV-4阳性血清作一抗；B.FAdV-8b阳性血清作一抗；M.标准分子质量；A1~A3.FP、FL和BP-FP；B1~B3.BP、BL和BP-FP A. FAdV-4 positive serum as primary antibody; B. FAdV-8b positive serum as primary antibody; M.Standard molecular weight; A1-A3.FP, FL, and BP-FP; B1-B3.BP, BL, and BP-FP 图 3 重组蛋白的Western blot Fig. 3 Western blot of recombine protein |
2.4.1 抗体水平检测 ELISA抗体检测结果如图 4所示，BL、FL、BP-FP、BP和FP组在免疫后7~14 d各组抗体均呈上升趋势，免疫后14~21 d抗体水平没有明显变化，免疫组抗体水平显著高于阴性对照组(P＜0.05)，但免疫组抗体水平无显著差异(P＞0.05)。
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“**”表示差异显著，无标注表示差异不显著。下同 "**"means significant difference, and no mark means insignificant difference. The same as below 图 4 鸡免疫后血清抗体水平 Fig. 4 Serum antibody levels of chickens after immunization |
2.4.2 免疫攻毒保护 攻毒后各组SPF鸡的存活情况如图 5所示，C4组存活率为25%，BP-FP4组存活率为58.3%，其它组鸡存活率均为100%。
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图 5 攻毒7 d后鸡存活率 Fig. 5 Survival rate of chickens at 7 d post-challenge |
2.4.3 排毒量测定 以log(X)为X轴，Ct值为Y轴绘制标准曲线，结果如图 6，标准曲线为y=-2.956 1x+38.826，R2=0.99。
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图 6 FAdV-8b实时荧光定量PCR标准曲线 Fig. 6 The standard curve for Real-time PCR of FAdV-8b |
排毒量检测结果如图 7，在攻毒3、7 d后，C8b组排毒量分别为9.48×105和3.24×107拷贝·μL -1, BL、BP和BP-FP8b组排毒量显著低于C8b组(P＜0.05)。攻毒后7 d BL和BP组排毒量分别为6.4×105和1.1×106拷贝·μL -1，显著低于BP-FP8b组(P＜0.05)，BP与BL组之间差异不显著(P＞0.05)。
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图 7 FAdV-8b攻毒后泄殖腔拭子排毒量 Fig. 7 Viral loads of cloacal swabs challenged with FAdV-8b |
2.4.4 细胞因子mRNA表达水平测定 qPCR检测肝脏中IL-4、IFN-γ和TNF-α mRNA表达水平，结果如图 8。免疫组细胞因子mRNA表达水平均显著高于阴性对照组(P＜0.05)，FP组IL-4和IFN-γ mRNA表达水平分别为5.7和8.5，显著高于FL组(P＜0.05)；BP组IL-4 mRNA表达水平为10.4，显著高于BL组(P＜0.05)；BL组和BP组TNF-α mRNA表达水平分别为5.73和4.45，二者差异不显著(P＞0.05)。
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A~C.不同免疫组FAdV-4攻毒；D~F.不同免疫组FAdV-8b攻毒 A-C. Different immune groups post FAdV-4 challenge; D-F. Different immune groups post FAdV-8b challenge 图 8 各免疫组攻毒后细胞因子mRNA表达水平 Fig. 8 mRNA expression level of cytokines in different immune groups post challenge |
2.4.5 肝脏组织病理观察 肝脏病理组织切片如图 9所示，C4组肝细胞严重充血、水肿，肝细胞空泡变性、坏死，存在嗜碱性包涵体和严重的炎性细胞浸润，C8b组肝细胞中存在包涵体和大量空泡变性。C组无病变。FL组与BL组未见明显空泡变性，无炎性灶。FP组与BP组有轻微炎性细胞浸润。BP-FP4与BP-FP8b组肝细胞能观察到轻微空泡变性。
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A.FL组；B.FP组；C.BP-FP4组；D: BL组；E.BP组；F.BP-FP8b组；G.C4组；H.C8b组；I.C组 A. FL group; B. FP group; C. BP-FP4 group; D: BL group; E. BP group; F. BP-FP8b group; G. C4 group; H. C8b group; I. C group 图 9 肝组织病理观察(100×) Fig. 9 Histopathological observation in liver (100×) |
近年来，由FAdV-4引起的HPS和FAdV-8b引起的IBH在肉鸡中有流行暴发趋势[18-21]，给养禽业带来了巨大的经济损失。不同血清型FAdV混合感染的情况在养殖场普遍存在。疫苗是防控疫病的有效手段之一，目前我国还未有同时防控HPS和IBH的商品化疫苗，研制防控FAdV-4和FAdV-8b的二价疫苗具有重要意义[22-24]。
本研究通过软件分析得到FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber亲水性和抗原性较好的区域位于后半段，与knob-s区域所在位置一致。因此选取了fiber2基因片段850~1 440 bp和fiber基因片段937~1 566 bp，并通过(GGGGS)3 15个氨基酸的linker串联表达。5种重组蛋白均能在上清液中稳定可溶表达，避免了包涵体复性对蛋白结构的影响。BP和FP的表达量明显高于BL和FL，表明截短的蛋白比全长蛋白更易表达，这可能与所选基因片段的长度有关，这些结果与Fingerut等[25]研究结果一致。本研究基于大肠杆菌表达的FL、FP、BP-FP、BL、BP 5个蛋白制备了亚单位疫苗，攻毒免疫保护显示，除BP-FP4组存活率为58.3%，其它组存活率均为100%；肝脏病理切片观察发现，攻毒组肝脏病变最严重，FP组与BP组次之，FL组与BL组无明显病变，表明截短蛋白和全长蛋白免疫保护效果优于二价融合蛋白。FAdV-8b泄殖腔拭子排毒量结果显示，BP-FP8b排毒量显著高于BL和BP，但仍显著低于FAdV-8b攻毒对照组，表明BP-FP重组蛋白的保护效果弱于单价蛋白。BP-FP4组的存活率为58.3%，低于单价蛋白，但高于对照组，表明BP-FP重组蛋白可诱导一定程度的免疫保护。
间接ELISA法检测重组蛋白免疫后鸡的抗体水平，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点[26-27]。5种重组蛋白均能有效诱导体液免疫反应，仅经过首免即可获得较高水平的抗体，具有良好的免疫原性。与对照组相比，5种重组蛋白抗体水平均显著升高，免疫组在受免后14 d血清抗体水平下降，与第二次免疫后抗体水平相似。抗体水平达到峰值后，依次为FL>FP>BP-FP>BL>BP, BL组与BP组差异不显著。由此可见，全长蛋白刺激SPF鸡产生抗体的能力优于截短蛋白，这可能与全长蛋白具有其他重要的表位有关。Th1细胞主要分泌IFN-γ和TNF-ɑ等细胞因子，参与调节细胞免疫，介导细胞免疫应答；Th2细胞主要分泌IL-4和IL-10，可以激活B细胞，促进中和抗体的产生[28-29]。研究表明，FAdV-4灭活苗可刺激动物机体产生较高水平的IL-4和IFN-γ且显著高于阴性对照组[30]。本研究结果显示，免疫组均显著高于阴性对照组，表明全长蛋白、截短蛋白和二价融合蛋白均能诱导产生细胞免疫，FP组IL-4和IFN-γ mRNA表达水平显著高于FL组，表明FP蛋白刺激机体产生IL-4和IFN-γ的水平高于FL蛋白。
4 结论FAdV-4 fiber2和FAdV-8b fiber截短蛋白和全长蛋白免疫保护效果优于二价融合蛋白，截短蛋白可替代全长蛋白用于禽腺病毒亚单位疫苗的制备。
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(编辑 白永平)