养牛业是新疆畜牧业重要的支柱产业之一，近年来发展迅速，引进品种、数量日益增加，2021年全疆的牛存栏量达528.13万头，牛肉产量达43.9万吨。犊牛腹泻是养牛业中的常见疾病，严重影响犊牛生长发育，腹泻严重时可使动物发生血便并导致死亡^[1]，对养牛业造成了严重的经济损失。BCoV和牛诺如病毒(bovine norovirus，BNoV)是引起犊牛腹泻的主要病原^[2-3]。而其中由BCoV导致的腹泻呈全世界流行趋势，BCoV主要通过粪口传播和呼吸道传播^[4]，检测时可从粪便和鼻液中分离到病毒粒子^[5]，病情转归与犊牛的日龄、免疫状态及病毒毒力有关^[6]。BCoV感染新生犊牛可引起犊牛腹泻，也可以导致成年牛冬痢，或引起呼吸道疾病^[7-9]。自然状态下可感染羊驼^[10]、骆驼^[11]、驯鹿^[12]和羊^[13]等反刍动物，该病发病率较高，感染率与牛的年龄相关^[14]。

BCoV属于冠状病毒科冠状病毒属，是一种单股正链有囊膜的RNA病毒。其基因组长度约32 kb。结构上，BCoV粒子呈球状，外围呈日冕状，大小为62~210 nm，是目前已知最大的RNA病毒^[15]。包括10个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，两端是5′和3′非翻译区域。ORF1编码多聚蛋白(polyprotein，PPla)，通过核糖体转移为PPlab，然后被蛋白酶水解成多个非结构蛋白(nonstructural protein，NSP)。ORF3、ORF4、ORF8、ORF9和ORF10分别编码该病毒粒子的5种主要结构蛋白：N(核蛋白)、S(纤突蛋白)、M(膜蛋白)、E(小膜蛋白)、HE(血凝素酯蛋白)，其余的ORFs编码额外的NSPs^[16]。不同国家和地区的BCoV毒株存在区域差异。例如，中国的BCoV毒株与新西兰、阿根廷、荷兰、爱尔兰、丹麦、美国、德国和日本的毒株不同^[17]。这些毒株的致病力、传播力以及对疫苗和治疗的敏感性均有所不同，可能是由于宿主种群的差异、环境条件以及其他病毒或细菌混合感染导致的。

随着新疆规模化养牛业的迅速发展，特别是国内外引进品种以及数量的增加，BCoV感染病例的报道越来越多，但对新疆规模化养牛场的BCoV感染现状、流行特点和主要流行毒株的生物学特性尚缺乏较全面的调查研究。本研究对新疆南、北疆养牛业主产区BCoV感染的流行情况进行调查监测，探明其流行规律，分析其演化过程中的分子流行病学特性，为后续针对新疆BCoV毒株的精准防控提供数据支撑。

1 材料与方法 1.1 材料

MolPure^Ⓡ Plasmid Mini Kit质粒提取试剂盒和MolPure^Ⓡ Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒购自翌圣生物科技(上海)有限公司；TRIzol购自Invitrogen；Hifair^Ⓡ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)、2×Taq PCR Mix、DL2000 DNA Marker和琼脂糖购自天根生化科技(北京)有限公司；pEASY-T1载体购自Promega公司。

1.2 流行病学调查

本研究于2020年7月至2022年7月份对新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市、塔城地区、伊犁州、喀什地区、博乐市、呼图壁县的12个规模化养牛场犊牛的BCoV感染情况进行持续监测。根据BCoV感染后犊牛的典型症状，采集1~3月龄具有腹泻临床症状的犊牛粪便样品共652份，其中肉用犊牛424份，奶用犊牛228份。对样品进行BCoV检测，分析不同地区、不同季节和不同品种犊牛BCoV的流行规律。

1.3 病料采集与处理

使用棉签采集犊牛直肠粪便样品，放到冻存管里存入液氮, 粪便样品以1 ∶3的稀释比用PBS溶液稀释，涡旋充分混匀后保存于-80 ℃冰箱。使用时，解冻后再放入-20 ℃冰箱反复冻融3次，以破坏组织释放病毒粒子。取处理后的粪便样品，4 ℃ 8 000×g离心后取上清，用TRIzol进行RNA提取，利用Hifair^Ⓡ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录，获得的cDNA -20 ℃冻存。

1.4 RT-PCR鉴定

根据GenBank中公开发表的BCoV病毒基因序列，利用Premier 5.0软件设计特异性引物，由生物工程(上海)股份有限公司合成。以实验室前期构建的质粒作为阳性对照，以样品cDNA作为模板，全程置于冰盒上进行操作，将提取出的样品RNA模板加入无酶无菌离心管，配置体系为15 μL，同时每管加入3 μL 5×gDNA Digester Mix，RNase-free H₂O补至15 μL并轻轻吹打混匀，混合液42 ℃条件下孵育2 min。逆转录反应20 μL体系配制，反应条件为25 ℃ 5 min，58 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min使用特异性引物进行PCR扩增，PCR扩增体系(15 μL)：2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，dd H₂O 4.5 μL，上、下游引物(10 μmol ·L^-1)各0.5 μL，cDNA 2.0 μL。反应条件为：预变性95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 45 s，35个循环；延伸10 min。扩增结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，于凝胶成像系统观察结果。PCR反应涉及的相关引物见表 1。

1.5 BCoV结构蛋白引物设计及扩增

以MW711 287.1为参考序列，设计BCoV结构蛋白N、S、M、E、HE的扩增引物(表 2)，引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。通过RT-PCR方法对病料提取的cDNA进行扩增，PCR扩增体系(15 μL)：2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，dd H₂O 4.5 μL，上、下游引物(10 μmol ·L^-1)各0.5 μL，cDNA 2.0 μL。反应条件为：预变性95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 45 s，35个循环；延伸5 min。扩增后，胶回收目的片段并构建于pEASY-T1载体，送生物工程(上海)股份有限公司测序，获得目的基因序列。

2 结果 2.1 BCoV阳性检测结果

RT-PCR检测结果显示(图 1)，在774 bp处可以看到明显特异的片段(第1、2、3、5和9泳道)，电泳结果经测序与预期片段序列符合。对2020—2022年新疆养牛主产区的652份粪便样品采用RT-PCR方法检出阳性156份，BCoV阳性总检出率为23.93%。

2.2 BCoV流行情况

2.2.1 BCoV感染地区差异 　　对六个地区12个规模化养牛场犊牛BCoV感染调查结果如图 2所示，喀什地区阳性率和阳性数量均最高，阳性率约35%。而乌鲁木齐、伊犁和博乐地区均未检出阳性。BCoV在南、北疆流行情况见表 3，可见BCoV在全疆均有分布，南、北疆地区的感染率呈现较大差异，南疆地区发病率较高。

2.2.2 BCoV感染的四季差异 　　BCoV在各个季节的流行情况详见表 4，可知在新疆地区，BCoV的流行受季节因素影响较大，集中于冬季流行，冬季检出率高达50.85%，远高于总检出率23.93%，这也符合此前其它地区研究对BCoV感染特征的认识^[18-20]。

2.2.3 BCoV感染的品种间差异 　　BCoV在奶、肉用犊牛中的流行情况详见表 5，可见BCoV在奶、肉用犊牛均可传播，但两者的感染率呈现较大差异，与奶用犊牛相比，肉用犊牛的发病率较高。

2.3 BCoV基因序列分析

将本文分离到的BCoV病毒，暂定名为：BCoV/China/XJ-CJ/2022，采用RT-PCR方法进行扩增, 获得BCoV的N、S、M、E、HE基因序列并送往生物公司测序，将测序获得的BCoV主要结构蛋白S、HE、E、M和N的序列进行同源性、进化树和基因重组分析、N蛋白抗原表位预测。

2.3.1 BCoV同源性分析 　　为了比对鉴定的BCoV/China/XJ-CJ/2022与现存其它毒株的异同，本研究于GenBank上挑选14条国内外各地区BCoV参考毒株进行比对，根据BCoV的五个结构蛋白S、HE、E、M和N进一步做同源性分析，结果可见(表 6)：BCoV/China/XJ-CJ/2022与国内参考株MW711 287.1_SWUN/NMG-D10/2020的核苷酸相似性最高，为97.4%，主要在M蛋白区域的核苷酸和氨基酸相似性最高，分别为99.4%和100.0%。与加拿大参考株AF220 295.1_Quebec的核苷酸相似性最低，为95.8%，主要是E蛋白区域的核苷酸相似度最低，为92.9%。

2.3.2 BCoV的S、N、M、E和HE基因的进化树和基因重组分析 　　S、N、M、E和HE基因的进化分析结果表明(图 3)，除与MW711 287.1_SWUN/NMG-D10/2020的S基因比对部分基因缺失外，同源性平均数值高于95%。本研究的分离株S基因与2018年毒株MN982 199.1进化关系最近，N基因与2018年毒株MK095 169.1BCOV-China/SWUN/LN4/2018进化关系最近，M基因与2017年毒株MK095 148.1 China/SWUN/SC1/2017进化关系最近，HE基因与2017年毒株MK095 136.1 BCOV-China/SWUN/SC2/2017进化关系最近。使用RDP 4和Simplot软件分析Bo/XJ-KS/02/CHN可能存在的重组事件，结果显示未出现基因重组现象。

3 讨论

犊牛腹泻包括非感染性腹泻和感染性腹泻，其中非感染性腹泻是受到饲养管理不当、环境气候恶劣、应激反应等非感染因素的影响，从而导致犊牛自身免疫力降低，增加了犊牛腹泻的概率，但发病率和危害性低于感染性腹泻，制定并实施合理的生物安全措施可以有效防控非感染性腹泻^[3]。感染性腹泻根据病因可分为病毒性腹泻、细菌性腹泻、寄生虫性腹泻，BCoV常与其它病毒混合感染，并引发细菌感染，导致临床诊断的症状表现复杂，临床上难以净化^[20-21]，其中引起腹泻的病毒包括BCoV、BNoV、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)、牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)、牛纽布病毒(bovine nebovirus，BNeV)，其中BCoV的感染率最高^[2]，可感染新生犊牛引起犊牛腹泻，也可以导致成年牛冬痢，或引起呼吸道疾病，严重时可导致犊牛死亡。在国外，一项2019—2021年的流行病学调查结果表明，波兰奶牛群的BCoV感染率约为30%^[22]，2022年巴西的流行病学调查结果显示，患病牛群中BCoV的感染率高达56%^[23]，土耳其BCoV感染率为29.92%^[24]。在国内，BCoV流行病学调查结果显示其实际感染率较高，其中四川、西藏、青海、云南省份BCoV检出率均高于60%。在中国东北地区的一项流行病学调查显示腹泻牛中BCoV阳性率为15.45%^[25]。可见BCoV在世界范围内广泛的流行。本研究于2020—2022年期间在新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市、塔城地区、伊犁州、喀什地区、博乐市、呼图壁县的12个规模化养牛场共采集样品652份，检出BCoV阳性156份，检出率为23.93%，其中喀什地区阳性率达到35%。

造成BCoV感染的原因除了与饲养管理不当、环境气候恶劣有关外，也与养殖场犊牛自身免疫力不足等因素有关。本团队前期研究结果显示，南疆牧场在防疫制度、人员物流管控、饲养管理等生物安全控制方面存在隐患，养殖场人员防控意识有限，缺乏有效针对BCoV的疫苗接种，这些因素成为BCoV在新疆南疆地区广泛、反复传播的有利因素^[3]。本研究发现，新疆BCoV毒株的传播具有冠状病毒传播的典型特征，即冬春传播，气温对病毒传播影响较大，冬季为该疾病的高发季节，发病率可达到50.85%，冬季应着重防范BCoV。从地区分布上，南疆气温相对于北疆较高，降水量少，日照时间充足，气候较为干旱，换季时期昼夜温差可达到20 ℃，BCoV发病率高达36.09%，应加强区域管理，减少跨区域引种。另外，本研究还发现，新疆BCoV毒株更易感染肉用犊牛，发病率达到30.9%，奶用犊牛发病率仅为10.96%，也有相关的研究报道显示，肉牛初乳乳糖含量及pH较高，可能会增加新生犊牛腹泻率^[26-27]。奶、肉用犊牛患病率的差异可能与初乳摄入量有关。初乳中含有免球蛋白、生长因子、细胞因子、非特异性抗菌因子和营养物质等，不当的初乳管理可能会影响初乳中的免疫成分及营养物质等，进而影响新生犊牛的免疫状态和生长发育情况^[28]。据报道，肉牛的平均初乳产量为2.7 L(0.6~5.6 L)，奶牛的平均初乳产量为6.7 L(3.7~9.5 L)，受产量影响，肉用犊牛对初乳奶量相对摄入较少，免疫球蛋白的摄入也相应减少，免疫球蛋白不足会造成犊牛被动免疫转移失败，导致犊牛发病率和死亡率增加以及后期生产力的下降^[29-30]，所以更应加强肉用犊牛的初乳补饲。

本研究从遗传演化分析的结果分析，进化树的主要分支是以地区、国家为分界各自形成谱系，说明目前BCoV没有通过物流或动物迁徙等因素形成全球传播，病毒的进化和传播主要集中在各自地理分界内，这与各国贸易对生物安全的严格管控有关，且与BCoV的自然宿主多为缺乏全球迁徙能力的偶蹄目动物有关^[31]。BCoV的传播存在地域性和季节性的特征，因此对BCoV的防控也应具有地域性和季节性^[32-33]。

4 结论

犊牛腹泻BCoV流行病学调查结果表明，新疆养牛业主产区广泛存在BCoV感染。南疆地区BCoV感染率较高，肉用犊牛BCoV感染率高于奶用犊牛。同时与季节呈现较强相关性，以冬季感染为主。遗传演化分析结果表明，BCoV感染以本土毒株为主，中国毒株形成独立谱系，传染存在地域性特征，未见重组事件。本研究为BCoV的精准防控和后续的疫苗研制奠定了理论基础。