2. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室, 济南 250100;
3. 农业农村部畜禽生物组学重点实验室, 济南 250100;
4. 济南市动物疫病预防与控制中心, 济南 250000
, ZHAO Xueyan2,3, WANG Yongjun4, WANG Yanping2,3, REN Yifan2,3, LI Jingxuan2,3, WANG Huaizhong2,3, WANG Jiying2,3
, SONG Qinye1
2. Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding, Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China;
3. Key Laboratory of Livestock and Poultry Multi-omics of Ministry of Agricultral and Rural Affairs, Jinan 250100, China;
4. Jinan Center for Disease Control and Prevention, Jinan 250000, China
动物肠道微生物是一个非常复杂的生态系统，影响许多重要的宿主生理功能，如食物摄入、新陈代谢调节、免疫系统激活、上皮细胞增殖和抗感染[1]。大量研究表明，不同品种猪具有不同的肠道菌群结构，与引进猪种相比，地方猪种肠道微生物组成更丰富[2]。近年来，研究发现肠道微生物菌群对猪脂肪沉积、饲料利用率、免疫抗性等有重要影响。He等[3]、Yang等[4]和Chen等[5]通过分析肠道微生物菌群与背膘厚、脂肪率等性状的关系，鉴定出普雷沃氏菌属(Prevotella)、大肠杆菌(Escherichia coli)等影响脂肪沉积的微生物类群。Bergamaschi等[6]研究发现，直肠微生物菌群中的厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、拟杆菌属(Bacteroides)、布氏杆菌属(Blautia)等影响杜洛克、大约克和长白等瘦肉型猪的饲料利用率。Zhao等[7]通过研究宿主-微生物群相互作用，揭示乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridia)和真杆菌属(Eubacterium)等潜在有益菌介导了民猪对炎症性肠病的抗性。
莱芜猪是中国著名的地方猪品种，具有肉质好、抗逆性强、耐粗饲等优良种质特性[8]，尤其是肌内脂肪沉积能力特别强，含量高达10%[9]，是我国地方猪种资源的宝贵基因库。系统研究莱芜猪和杜长大(DLY)猪盲肠和结肠微生物菌群结构组成和功能，鉴定影响莱芜猪特性的微生物菌属，将为从肠道菌群层面深入理解莱芜猪特性奠定基础。本研究以DLY猪为对比，系统研究自然生产状态下莱芜猪盲肠和结肠肠道食糜微生物群落的结构组成和功能，分析肠道菌群与背膘厚、血清生化指标的相关性，研究肠道中优势菌种与其表型性状的潜在联系，为从肠道菌群层面深入理解莱芜猪高脂肪沉积、耐粗饲和抗逆等特性作用机理奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物和样品采集本研究中的12头莱芜猪去势公猪来自莱芜猪种猪繁育有限公司，6头DLY猪去势公猪来自莱芜猪种猪繁育有限公司临近的商品猪场。所有试验猪健康无腹泻，且屠宰前3个月内均未使用过抗生素。莱芜猪和DLY猪分别参照国家标准《猪的营养需要量》(GB/T 39235—2020)的脂肪型猪和瘦肉型猪的标准配制。饲粮组成及营养水平详见表 1。
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表 1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Diet composition and nutrient level in this study(air-dry basis) |
莱芜猪日龄303 d，宰前体重为(95±5.8)kg，杜长大猪日龄192 d，宰前体重为(120±4.8)kg，均处于肥育后期。12头试验动物禁食24 h，电击致晕后按照标准流程屠宰。屠宰时采血，3 000 r·min-1离心5 min，吸取血清于离心管中，置于-20 ℃冰箱中保存。收集盲肠和结肠食糜于无菌离心管中，液氮中速冻，置于-80 ℃冰箱中保存。
1.2 背膘厚和血清生化指标测定根据《瘦肉型猪胴体性状测定技术规范》(NY/T 825—2004)[10]测量胴体背中线肩部最厚处、最后肋、腰荐结合处三点的皮下脂肪厚度，取3点平均值作为平均背膘厚。采用日立7100自动生化分析仪测定血清中的总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TCH)和二胺氧化酶(DAO)。
1.3 DNA提取、PCR扩增和16S rDNA高通量测序使用土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒(Qiagen, Valencia, California, USA)提取盲肠和结肠食糜中总基因DNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop，德国)测量提取的DNA的浓度和纯度，并在1% (w/v)琼脂糖凝胶上评估完整性。质控合格后，使用特异性引物341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)扩增16S rRNA基因的V3-V4区域[11]。根据PCR产物浓度等量混样，充分混匀后使用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并使用Universal DNA Gel Extraction Kit (TianGen, 北京, 中国)纯化目的条带。使用NEB-Next® Ultra DNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA)构建测序文库。文库用Qubit 2.0荧光计(Thermo Scientific)量化后，由诺禾致源(中国北京)利用Illumina NovaSeq 6000进行双末端测序，测序读段长度为250 bp。
1.4 16S rDNA测序数据处理根据Barcode和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7)[12]对reads进行拼接，得到原始Tags数据(Raw Tags)；原始Tag使用QIIME(V1.9.1)[13]进行如下质量控制得到高质量的Tags(Clean tags)：a)Tag截取：将原始Tags从连续低质量值(默认质量阈值为≤19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)Tag长度过滤：经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。经过以上处理后得到的高质量Tag序列通过VSEARCH[14]与物种注释数据库比对检测和去除嵌合体序列，并得到最终的有效Tag数据(Effective Tags)。
利用Uparse算法(Uparse v7.0.1001)[15]对样本的全部有效Tags进行聚类，以默认的97%序列一致性(Identity)将有效Tag序列聚类成为分类操作单元(OTUs)，同时选取出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。使用Mothur方法与SILVA138[16]的SSUrRNA数据库[17]对OTUs代表序列进行物种注释分析(设定阈值为0.8~1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平(门、纲、目、科、属、种)统计各样本的微生物菌群组成。使用MUSCLE[18](Version 3.8.31)软件进行快速多序列比对，得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。最后以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。
1.5 肠道菌群多样性及品种差异分析使用QIIME(V 1.9.1)计算样品的Simpson和Shannon等Alpha多样性指标，并使用Wilcox检验分析Alpha多样性指数组间差异；使用QIIME软件(V 1.9.1)计算Bray-Curtis相异度以估计群落结构的差异，使用主坐标分析(PCoA)对样本的相似性或差异性进行可视化呈现。
使用LEfSe[19]开展品种间物种差异判别分析以鉴定显著性影响莱芜猪和DLY猪的肠道微生物菌群，所用分析参数为：使用Kruskal-Wallis检验比较OTU的相对丰度，P水平为0.05；将所得显著不同的OTU用作线性判别分析(LDA)的输入，以计算它们的效应大小，选择对数LDA得分阈值>3.5的OTU作为组间显著不同的OTU。使用Metastats[20]对门、属、种水平的各个分类单元在莱芜猪和DLY猪之间的丰度差异进行比较检验。
1.6 肠道菌群与背膘厚、血清生化指标的相关性分析使用R语言计算背膘厚和血清生化指标与丰度前40的肠道微生物菌属丰度之间的Spearman相关系数，将获得的相关系数数值矩阵通过R语言pheatmap程序包绘制相关性热图。
1.7 肠道菌群功能预测使用Tax4Fun[21]对16S rDNA基因测序数据进行功能预测，并使用热图可视化前35个KEGG通路的统计差异。
2 结果 2.1 背膘厚和血清生化指标检测莱芜猪和DLY猪的背膘厚和血清生化指标检测结果见表 2。可以看出，莱芜猪和DLY猪具有不同的品种特点，二者的背膘厚、部分血清生化指标存在显著差异(P＜0.05)。莱芜猪的背膘厚和TP显著高于DLY猪(P＜0.05)，GLU、TG和HDL-C均显著低于DLY猪(P＜0.05)。
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表 2 莱芜猪和杜长大猪背膘厚和血清生化指标比较 Table 2 Comparison of backfat thickness and serum biochemical parameters between Laiwu and DLY pigs |
莱芜猪和DLY猪的盲肠、结肠肠道微生物菌群16S rRNA测序数据如表 3所示。本研究共得到2 105 633个高质量的有效tag序列，平均每个样本为58 490个，有效tag序列的平均长度为409 bp，Q20和Q30的平均值分别为98.39% 和94.79%，表明本研究测序数据质量良好。
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表 3 16S rDNA测序数据统计性描述 Table 3 Summary statistics for the 16S rDNA sequencing data |
基于97%的序列一致性将有效Tag序列聚类，共获得了6 642个OTUs。莱芜猪和DLY猪盲肠和结肠共有和特异的OTU韦恩图(图 1)显示，莱芜猪、DLY猪盲肠和结肠4个肠段中共有的OTU数量为1 130个，占所有OTU总数的17.01%；莱芜猪盲肠和结肠共有OTU数1 722个，DLY猪盲肠和结肠的共有OTU 1 251个；莱芜猪和DLY猪盲肠和结肠共有OTU分别为1 454和1 372个。特异OTU分析显示，莱芜猪盲肠和结肠特异OTU分别为708和2 825个，DLY猪盲肠和结肠特异OTU分别为690和283个。莱芜猪盲肠和DLY猪盲肠的特异OTU数量基本一致，而莱芜猪结肠的特异OTU数量远高于DLY猪结肠的特异OTU数量。
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DLYCA 代表杜长大猪盲肠，DLYCO 代表杜长大猪结肠，LWCA 代表莱芜猪盲肠，LWCO 代表莱芜猪结肠，下同 DLYCA means caecum of DLY pig, DLYCO means colon of DLY pig, LWCA means caecum of Laiwu pig, LWCO means colon of Laiwu pig, the same as below 图 1 莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠共有和特异分类操作单元(OTUs)韦恩图 Fig. 1 Venn diagram of common and unique operational taxonomic units (OTUs) of caecum and colon in Laiwu and DLY pigs |
莱芜猪和DLY猪盲肠和结肠微生物菌群的Alpha多样性见图 2所示，可以看出利用Simpson和Shannon指数分析的Alpha多样性结果基本一致。莱芜猪盲肠Simpson指数高于DLY猪，且莱芜猪与DLY猪在盲肠的Simpson指数上的差异达到了显著水平(P＜0.05)，表明莱芜猪比DLY猪具有更丰富的盲肠微生物多样性。
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左为 Simpson 指数，右为 Shannon 指数，*表示P＜0.05 Left. Simpson index; Right. Shannon index, *. P < 0.05 图 2 莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠微生物的Alpha多样性比较 Fig. 2 Comparison of microbial alpha diversity of caecum and colon in Laiwu and DLY pigs |
为衡量样本或组间的微生物组差异，根据Bray-Curtis相异度绘制PCoA图(图 3)。可以看到，莱芜猪盲肠(LWCA)、莱芜猪结肠(LWCO)、DLY猪盲肠(DLYCA)和DLY猪结肠(DLYCO)4组样本相对聚集在一起，组间有一定程度重叠。DLY猪盲肠样本分布最为集中，表明DLY猪样本盲肠微生物一致性最高。DLY猪盲肠与结肠样本只有少许重叠，而莱芜猪盲肠与结肠样本重叠较多，表明莱芜猪盲肠与结肠微生物菌群的相似度更高。莱芜猪盲肠样本与DLY猪盲肠样本、莱芜猪结肠样本与DLY猪结肠样本均有部分重叠，表明不同猪种同一肠段的菌群之间有一定的相似性。
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图 3 莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠微生物菌群的主坐标分析 Fig. 3 Principal coordinate analysis by the bacterial microbiota of caecum and colon in Laiwu and DLY pigs |
本研究检测的6 642个OTUs中，4 750个(占总数的71.51%)可在Silva数据库中注释，门、纲、目、科、属和种水平的注释率分别为64.50%、62.15%、56.55%、46.69%、31.11%、6.68%。
在门水平上(图 4A)，莱芜猪和DLY猪均以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)为优势菌门，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)丰度之和分别占莱芜猪盲肠微生物的92.86%和结肠微生物的91.15%，占DLY猪盲肠微生物的96.13%和结肠微生物的96.51%。品种间比较，莱芜猪盲肠和结肠中的厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度占比均低于DLY猪，其中盲肠的差别达到显著水平(69.16% vs. 89.59%，P＜0.05, 图 5A)。此外，莱芜猪结肠和盲肠中的广古菌门(Euryarchaeota)和梭杆菌门(Fusobacteriota)相对丰度分别为2.47%和2.54%，远高于DLY猪结肠和盲肠中的这2个门的相对丰度(0.06%和0.01%)，但没有达到显著差异(P>0.05)。
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图 4 莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠微生物菌群前10个门(A)和前10个属(B)相对丰度组成 Fig. 4 Relative abundance of the top 10 bacterial microbiota at phylum (A) and genus (B) levels of caecum and colon in Laiwu and DLY pigs |
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A. 厚壁菌门；B. Oscillospiraceae_UCG-007 菌属；C. 候选单胞生糖菌属。* 表示差异显著(P＜0.05) A. Firmicutes; B. Oscillospiraceae_UCG-007; C. Candidatus_Saccharimonas. Significance is presented as * (P<0.05). 图 5 莱芜猪和杜长大猪盲肠微生物显著差异菌门和属 Fig. 5 Significantly different microbiota at phylum and genus levels of caecum in Laiwu and DLY pigs |
在属水平上(图 4B)，莱芜猪和DLY猪盲肠和结肠微生物丰度最高的菌属均为土孢杆菌属(Terrisporobacter)，占比为15.64%~32.50%。在莱芜猪和DLY猪盲肠中微生物丰度排名第2、3位的属分别为苏黎世杆菌属(Turicibacter)和狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)，在莱芜猪结肠中微生物丰度排名第2、3位的属分别为狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)和苏黎世杆菌属(Turicibacter)，而在DLY猪结肠中微生物丰度排名第2、3位的属分别为链球菌属(Streptococcus)和狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)。品种间比较，莱芜猪盲肠中(Oscillospiraceae_UCG-007)和候选单胞生糖菌属(Candidatus_Saccharimonas)的相对丰度显著低于DLY猪(0.004 347 % 和0.019 69% vs. 0.013 30% 和0.158%，P＜0.05, 图 5B、5C)。另外，莱芜猪结肠中甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)、活泼瘤胃球菌([Ruminococcus]_gnavus_group)和盲肠中的梭杆菌属(Fusobacterium)的相对丰度远高于DLY猪对应菌属的相对丰度(2.47%、3.11%和2.54% vs. 0.03%、0.22%和0.01%)，莱芜猪结肠中的链球菌属(Streptococcus)和乳酸菌属(Lactobacillus)相对丰度远小于DLY猪对应菌属的相对丰度(0.7%和2.21% vs. 15.50%和15.37%)，但差异均没有达到显著水平(P>0.05)。
此外，为了鉴定显著影响莱芜猪和DLY猪盲肠和结肠的特定微生物菌群，本研究进一步使用LEfSe开展组间物种差异判别分析(图 6)。从图 6中可以看出，莱芜猪盲肠中检测到的特异菌属最多，包括变形菌门(Proteobacteria)中的大肠志贺杆菌属(Escherichia_Shigella)、厚壁菌门(Firmicutes)中的克里斯滕森菌科_R-7菌属(Christensenellaceae_R_7_group)和颤螺旋菌科(UCG-005属)、梭杆菌门(Fusobacteria)中的梭菌属(Fusobacterium)等特异菌属。在DLY猪盲肠中检测到的特异菌属包括厚壁菌门(Firmicutes)中的苏黎世杆菌属(Turicibacter)和消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)中的Intestinibacter、真杆菌属成员(unidentified_Eubacterium_coprostanoligenes_group)等。在莱芜猪结肠检测到的特异菌属包括厚壁菌门(Firmicutes)中的狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)、放线菌门(Actinobacteriota)中的棒状杆菌属(Corynebacterium)等。在DLY猪结肠中检测到的特异菌属包括厚壁菌门(Firmicutes)中的乳酸菌属(Lactbbacillus)、链球菌属(Streptococcus)和(Subdoigranulum)等。
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图 6 莱芜猪和杜长大猪盲肠和结肠微生物群落LEfSe多级物种差异判别分析结果 Fig. 6 Bacterial taxa differentially represented in the corresponding segment of caecum and colon of Laiwu and DLY pigs identified by LEfSe |
为探讨肠道菌群丰度与背膘厚和血清生化指标间的关系，本研究计算了肠道微生物菌群前40个菌属的丰度与背膘厚、TP、GLU、TG和HDL-C在两品种显著差异指标间的Spearman相关系数，详见图 7。由图 7可知，肠道微生物菌属丰度与背膘厚和部分血清生化指标具有的显著相关性(P＜0.05)，且盲肠和结肠的微生物菌属与各性状的相关模式不同。例如盲肠中背膘厚与拟杆菌属(Bacteroides)、颤螺菌科成员(Oscillospiraceae-UCG-005)、拟梭菌属(Clostridioides)、欧陆森氏菌属(Olsenella)和小杆菌属(Dialister)呈显著正相关，与苏黎世杆菌属(Turicibacter)、狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)和肠杆菌属(Intestinibacter)呈显著负相关；结肠中背膘厚与狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacte)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、土壤芽孢杆菌属(Solibacillus)、拟梭菌属(Clostridioides)、罗氏菌属(Rothia)和不动杆菌属(Acinetobacter)与呈显著正相关，与链球菌属(Streptococcus)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)和阴沟杆菌属(Agathobacter)呈显著负相关。
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图 7 猪盲肠(左)和结肠(右)微生物菌群与背膘厚和血清生化指标相关性热图 Fig. 7 Correlation heatmap between caecum(left) and colon(right) bacterial microbiota and backfat thickness and serum biochemical parameters in Laiwu and DLY pig |
为探讨肠道菌群影响宿主表型的机理，利用Tax4fun对莱芜猪和DLY猪盲肠和结肠微生物菌群进行了功能预测分析(图 8)。可以看出，盲肠和结肠微生物菌群的功能主要富集在代谢、免疫、信息处理等通路。与结肠相比，盲肠富集了更多的通路。品种间比较，莱芜猪和DLY猪微生物菌群功能富集的通路有很大不同。莱芜猪盲肠和结肠富集了异种生物降解和代谢、辅助因子和维生素代谢、能量代谢、其他次生代谢产物的生物合成、氨基酸代谢、多酮类和萜类化合物的代谢等代谢相关通路；细胞过程和信号、细胞群落-原核生物、细胞生长和死亡、细胞运动等细胞过程相关通路；衰老、癌症、内分泌和代谢疾病、免疫系统等生物体系统和疾病相关通路。DLY猪盲肠和结肠富集了其他氨基酸代谢、核苷酸代谢、碳水化合物代谢、脂类物质代谢、多糖生物合成与代谢等代谢相关通路；转录、复制和修复、翻译、折叠、分类和降解等遗传信息处理相关通路；抗药性、传染病等疾病相关通路。
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图 8 基于Tax4fun在第二层级上的功能预测的热图聚类 Fig. 8 The heatmap of microbial functions at the second level predicted by Tax4fun |
目前，猪肠道微生物研究主要集中在对消化道的粪便或直肠微生物菌群研究[22-24]。然而，由于解剖结构和生理特性的差异，猪的肠道各部位菌群在种类、丰度上也明显不同[25-26]。粪便只能定性地反映肠道的菌群种类，却不能定量反映不同肠段的菌群丰度[27]。盲肠的结构有利于食糜停留，结肠中食糜的流通速度缓慢，猪的盲肠和结肠给予细菌大量增殖的机会，是猪主要的发酵器官。本研究中莱芜猪盲肠和结肠的Shannon指数为5.52和5.31，低于谭占坤等[28]报道的放牧藏猪、舍饲藏猪和DLY猪盲肠的Shannon指数8.68、7.48和7.21以及Shang等[29]报道的藏猪和约克夏猪结肠的Shannon指数5.68和6.22。且本研究中莱芜猪盲肠和结肠的微生物多样性高于Yang等[4]报道的莱芜猪的空肠和回肠的Shannon指数(1.8~2.4)以及Holman等[26]荟萃分析的十二指肠、空肠和回肠的Shannon指数(1.87、3.06和2.72)，表明盲肠和结肠的微生物多样性高于小肠肠段。
本研究中，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)是盲肠和结肠肠道微生物中丰度占比最高的菌门(图 4)，厚壁菌门和拟杆菌门丰度之和分别占莱芜猪盲肠和结肠微生物的92.86%和91.15%，占DLY猪盲肠和结肠微生物的96.13%和96.51%。这与Isaacson和Kim[30]研究中猪盲肠和结肠有超过90%的细菌归属于厚壁菌门和拟杆菌门的结果相一致。而且，本研究发现，与DLY猪相比较，莱芜猪具有独特肠道菌群组成。在门水平上，莱芜猪盲肠和结肠中的厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度占比均低于DLY猪，其中盲肠的
差别达到显著水平(69.16% vs. 89.59%)。对人类和小鼠的研究表明，在肥胖个体粪便微生物菌群研究中，厚壁菌门(Firmicutes)的丰度占比例较大[31]，而拟杆菌门(Bacteroidota)的比例较低[32]，与本文中的研究不一致。这种差异可能是由于物种以及粪便微生物组和盲肠肠道微生物组成的差异所致。莱芜猪盲肠和结肠微生物中占比例较高菌属为土孢杆菌属(Terrisporobacter)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)和狭义梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)，这与石宝明等[2]报道的金华猪和藏猪肠道微生物丰度较高的菌属种类有着较高的一致性。
3.2 盲肠与结肠微生物菌群对宿主背膘厚、血清生化指标表型的影响莱芜猪是我国华北黑猪的典型代表，具有很强的脂肪沉积、抗病和耐粗饲能力。DLY猪是我国养猪生产中应用最为广泛的商品猪种，以生长速度快、瘦肉率高著称。本研究发现，除了背膘厚外，莱芜猪与DLY猪的部分血清生化指标(TP、GLU、TG和HDL-C)也存在着显著差异性(P＜0.05，表 1)。血清生化指标是反映机体健康状况、内环境平衡及养分消化代谢的重要参数，这些指标可能通过影响消化代谢进而影响生产性能。本研究开展了肠道微生物菌属丰度与背膘厚、两品种间显著差异血清生化指标的相关性分析，发现了一些与这些性状显著相关的肠道微生物类群(P＜0.05)，这些微生物类群可能对莱芜猪和DLY猪的重要性状有重要影响。
结肠中的甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)与背膘厚呈显著正相关。甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)属于广古菌门(Euryarchaeota)，可能在宿主的能量代谢和脂肪沉积中起着至关重要的作用，将人类甲烷短杆菌接种到无菌小鼠的模型试验证明了这一点[33]。而且，人类肥胖症研究中发现，肥胖个体利用h2产甲烷菌数量明显高于瘦人个体[34]。梭杆菌属(Fusobacterium)和大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)与TG呈显著负相关。人类肥胖研究证明梭杆菌属(Fusobacterium)和大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)的丰度占比在肥胖人群中同样大幅度增加[35]。而且梭杆菌属(Fusobacterium)和大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)均为莱芜猪LEfSe差异判别分析结果中的特异菌，说明梭杆菌属(Fusobacterium)和大肠杆菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)可能通过影响莱芜猪血清中TG从而影响了莱芜猪的脂肪沉积。莱芜猪结肠中的活泼瘤胃球菌([Ruminococcus]_gnavus_group)相对丰度远高于DLY猪(3.11% vs. 0.22%)，拟杆菌属(Bacteroides)为LEfSe物种差异判别分析中鉴定出的莱芜猪盲肠微生物菌属。以往研究表明，拟杆菌属(Bacteroides)在饲喂高纤维日龄的猪肠道中丰度显著提高[36]，活泼瘤胃球菌([Ruminococcus]_gnavus_group)是猪肠道微生物中纤维素和半纤维素分解的重要细菌菌属[37]，这两个菌属，通过分解宿主消化系统的纤维素来获取营养，可能是导致莱芜猪高纤维消化能力的主要因素之一，当然这也可能是由于莱芜猪饲喂高纤维传统日粮造成的菌群差异。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)是国际上公认的益生乳酸菌，可改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患肠道疾病。前期研究表明，罗伊氏乳杆菌Lactobacillus_reuteri与背膘厚呈负相关[38]，具有降低胆固醇[39]和预防肥胖[40]的作用。本研究中罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)在DLY猪结肠中丰度占比远高于莱芜猪(2.34% vs. 0.33%)，为DLY猪LEfSe差异判别分析结果中的特异菌，故可能是影响DLY猪低背膘厚、高生长速度的菌属之一。
动物肠道微生物与宿主之间相互选择与适应，构成一个相对稳定的超有机体。宿主遗传特征、饮食、环境和抗生素使用等因素均可影响肠道微生物的多样性和功能[41]。本研究初步探索自然生产状态下莱芜猪肠道微生物的特点，以后研究中需要在控制饲养环境、饲粮和体重(或日龄)一致的情况下进一步研究分析，以验证本研究中结果。
4 结论本研究分析了自然生产状态下莱芜猪和DLY猪育肥阶段肠道微生物菌群组成、结构和功能，初步探索了莱芜猪肠道微生物的特点。莱芜猪具有与DLY猪不同的盲肠和结肠微生物菌群多样性和相对丰度，且莱芜猪盲肠微生物菌群多样性显著高于DLY猪；莱芜猪肠道内的一些微生物菌群与脂肪沉积、耐粗饲和抗逆性强等有关，可能是影响莱芜猪特性的原因之一。
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(编辑 范子娟)