, ZHANG Yushi, JI Haigang, LIU Yang, NIU Yufang, HAN Ruili, LIU Xiaojun, TIAN Yadong, KANG Xiangtao
, LI Zhuanjian
骨骼肌是畜禽机体重要组成部分之一，对畜禽运动的维系具有重要作用[1]。肌肉组织的终生维持是由卫星细胞介导的[2]，骨骼肌卫星细胞(muscle satellite cells, MSCs)是位于细胞膜和基膜之间的一类肌源性干细胞[3]，通常情况下，处于静止状态仅零星增殖[4]。而当机体损伤，骨骼肌卫星细胞被激活，进行分裂以重建纤维完整性和功能[5]。分离培养PMSCs对于禽类骨骼肌研究来说是一个复杂且耗时的过程，并且每次试验中细胞产量有限。同时，得到的细胞通常在一次或两次传代后停止生长，且存在内源性污染[6]。细胞永生化是指通过自发或人为诱导原代细胞[7]，使其度过复制衰老期，持续增殖分裂。永生化细胞系保留了原代细胞所具有的特定免疫标记和功能特性[8]，且能够提供均一的细胞群和可重现的结果[9-10]。常用于建立永生化细胞系的外源基因包括EB病毒[11]、猿猴病毒40 Large T (SV40-LT)[12]和人端粒酶逆转录酶[13]等。SV40是一种双链DNA病毒，因其能够快速且使原代细胞稳定转化为永生化细胞而应用广泛[14-15]。
本试验通过慢病毒转染SV40-LT以培养鸡骨骼肌卫星细胞系，从而为家禽骨骼肌的功能研究及永生化细胞系的建立提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料DMEM：F12、多聚甲醛(PFA)、胶原酶I、牛血清白蛋白、红细胞裂解液、嘌呤霉素、Triton X-100、马血清购自索莱宝公司；胎牛血清FBS购自Gibco公司；PAX7购自DSHB公司；CY3、山羊血清购自博奥森公司；Fluoromount-G荧光封片剂购自SourthernBiotech公司；质粒无内毒素提取试剂盒购自天根公司；动物总RNA快速提取试剂盒购自GENERay公司；5×All-In-One RT MasterMix购自Abm公司；SYBR Green qPCR Master、CCK-8试剂购自vazyme公司；Agarose购自擎科生物公司；pHY-SV40-Puro病毒液购自赛百慷公司。
1.2 试验方法1.2.1 原代鸡骨骼肌卫星细胞的分离、培养 取15胚龄的鸡胚20~30枚常规消毒后，超净台内分离胸部肌肉于平皿；PBS缓冲液冲洗3次，剔除血管、脂肪、结缔组织等非肌肉组织；平皿中加入少量消化酶(0.1% I型胶原酶、2%牛血清白蛋白混合于DMEM/F12)，将组织剪碎并移至50 mL离心管中；加入组织块5倍体积的消化酶溶液，封口，置于37 ℃水浴消化45 min左右；加入3倍体积的完全培养基终止消化；混合液依次过100目、200目、500目的细胞过滤筛，细胞悬液1 000 r·min-1离心5 min；弃上清，完全培养基重悬细胞接种于T75培养瓶，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养。4 h后进行差速贴壁，即可分离得到PMSCs。
1.2.2 PMSCs免疫荧光鉴定 取F1代细胞接种于24孔板中，每孔3×106个细胞。将细胞用PBS缓慢洗涤；4%多聚甲醛于4 ℃固定30 min；0.1%Triton X-100室温透膜10 min；PBS洗涤；滴加山羊血清[16]封闭1 h；弃封闭液，加入PAX7一抗，4 ℃过夜孵育；回收一抗，PBS洗涤；加入CY3二抗，37 ℃避光孵育1 h；PBS洗涤；加入DAPI染核5 min；PBS洗涤；荧光显微镜下观察。
1.2.3 最佳药物筛选浓度的确定 取F2代细胞接种于24孔板，将嘌呤霉素设置如下梯度：1、2、3、4、5、6、7 μg·mL-1对F2代细胞进行加压筛选，每2 d换一次液；观察细胞状态，以细胞全部死亡的最低浓度为最佳筛选浓度。PMSCs的嘌呤霉素最佳筛选浓度为1 μg·mL-1。
1.2.4 慢病毒载体的包装 取HEK293T细胞接种于培养皿，将质粒pBobi-SV40-Puro与Lenti-Mix(pMDLg/pRRE∶pVSV-G∶pRSV-Rev=5∶3∶2比例混合)混匀，加入0.25 moL· mL-1 CaCl2吹匀；加入2×HBS，室温静置10 min；将Lenti-Mix-DNA转染体系液逐滴加入培养皿，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱培养8~10 h；弃液，加入完全培养基继续培养24~48 h，收集上清，500 g离心10 min；取上清用0.45 μmoL·L-1过滤器过滤；加入慢病毒浓缩液，4 ℃过夜；4 ℃ 10 000 r·min-1离心30 min，用无血清培养基重悬，分装后冻存于-80 ℃。
1.2.5 永生化鸡骨骼肌卫星细胞的建立 取F2代细胞，加入病毒液；12 h后抽弃一半培养基并加入一半新鲜培养基，培养24~48 h；加入筛选培养基；显微镜下观察对照组细胞全部死亡，将筛选培养基中的嘌呤霉素浓度减半，直至有阳性细胞的出现；将阳性细胞不断连续培养后，获得鸡骨骼肌卫星细胞系IMSCs；将传代至第12代的鸡骨骼肌卫星细胞系称为IMSCs P12[17]。
1.2.6 细胞增殖分析 将细胞接种于96孔板，每孔5×102个细胞；设置8组，每组10个重复；依次在1~8 d将完全培养基与CCK-8试剂按照9∶1的比例混合；抽弃原有培养基，加入CCK-8试剂的培养液，孵育2 h；用酶标仪测定450 nm处吸光度值并绘制生长曲线。
1.2.7 细胞周期检测 将细胞接种于6孔板，每孔2×106个细胞；消化细胞，2 000 r·min-1离心4 min；弃上清，加入1 mL预冷的PBS，2 000 r·min-1离心4 min；弃上清，重复两次；加入1 mL预冷的70%乙醇，4 ℃固定12~24 h；1 200 r·min-1离心5 min，弃上清；加入PBS，1 200 r·min-1离心5 min；弃上清，碘化丙啶染色，37 ℃避光温浴30 min；用流式细胞仪在488 nm波长处检测细胞周期。
1.2.8 血清依赖性分析 将细胞接种于96孔板，培养12 h；配制0%、5%、10%、20%胎牛血清[18]的DMEM/F12培养基，加入细胞中，每个浓度至少3个重复；加入10 μL CCK-8试剂，孵育2 h。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值并绘制柱状图。
1.2.9 软琼脂分析 将1.2%的Agarose培养基与20%FBS的DMEM/F12培养基混合，铺到6孔板；将IMSCs P12稀释至每毫升1 000个，HEK293T细胞稀释到每毫升200个；将0.7%的Agarose培养基与20%FBS的DMEM/F12培养基缓慢混合后加入细胞悬液，铺至下层胶；每隔2 d补加200 μL培养基[19]；培养2周，待HEK293T细胞长出克隆后，显微镜拍照保存。
1.2.10 鸡骨骼肌卫星细胞诱导分化模型构建及分析 将细胞接种于24孔板；将培养基替换成诱导分化培养基(含2%马血清[20]的DMEM/F12培养基)，分别收取增长至70%，分化后1~4 d的细胞。
1.2.11 实时荧光定量PCR检测基因的表达 SV40-LT、PAX7、MyoD及MyHC的引物如表 1所示，β-actin用作为内参基因。使用SYBR Green Master Mix试剂，cDNA作为模板，在QuantStudio 5实时荧光定量仪进行实时荧光定量PCR，参数如下：95 ℃预变性30 s；聚合酶链式反应95 ℃持续10 s，60 ℃持续30 s，共35个循环；95 ℃持续15 s，60 ℃持续1 min，95 ℃持续15 s。采用2—ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。每组样品至少3个生物学重复。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences |
试验数据采用SPSS 27.0软件中的One-way ANOVA和多重比较进行统计分析，结果以“Mean±SEM”表示。0.01＜P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 鸡骨骼肌卫星细胞细胞鉴定在PMSCs中，有92%的细胞PAX7在细胞核中呈阳性表达(图 1)，可用于后续研究。
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图 1 PMSCs中PAX7免疫荧光染色结果(100×，标尺：100 μm) Fig. 1 Immunofluorescence staining result of PAX7 in PMSCs (100×, Bar=100 μm) |
对照GFP慢病毒包装24 h左右后，荧光效果显示GFP阳性率约90%以上，病毒滴度为1×108 tu·mL-1(图 2)。
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图 2 GFP对照病毒包装效果(200×) Fig. 2 Comparison virus packaging rendering of GFP (200×) |
鸡骨骼肌卫星细胞系连续传至12代(IMSCs P12)后仍具有与PMSCs相似的形态(图 3)，且SV40-LT基因在IMSCs P12中的表达是PMSCs的15倍(图 4)。
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A.PMSCs生长近融合状态；B.IMSCs P12生长状态 A.PMSCs growth near fusion state; B.Growth state of IMSCs P12 图 3 PMSCs和IMSCs P12形态图(100×，标尺：100 μm) Fig. 3 The morphology of PMSCs and IMSCs P12(100×, Bar=100 μm) |
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图 4 IMSCs P12中SV40-LT mRNA表达 Fig. 4 SV40-LT mRNA expression in IMSCs P12 |
将PMSCs与IMSCs P12连续培养8 d，在1~5 d细胞处于生长潜伏期，5~6 d处于对数生长期，然后细胞进入平台期(图 5)。
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图 5 PMSCs和IMSCs P12增殖曲线 Fig. 5 The growth curves of PMSCs and IMSCs P12 |
IMSCs P12处在S期的细胞明显多于PMSCs，二者差异极显著(P＜0.01)；IMSCs P12处在G2M期的细胞明显多于PMSCs，二者差异极显著(P＜0.000 1)(图 6)。说明与PMSCs相比，IMSCs P12具有更高的增殖活性。
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图 6 PMSCs和IMSCs P12细胞周期检测 Fig. 6 Cell cycle detection of PMSCs and IMSCs P12 |
本试验采用不同血清浓度来培养IMSCs P12，结果如图 7所示，在无血清时，IMSCs P12不能正常生长；血清浓度为5%、10%、20%时，IMSCs P12能够增殖，且20%的血清浓度促进增殖的能力要明显高于5%的血清浓度, 两者差异极显著(P < 0.000 1)；15%、20%的血清浓度促进细胞增殖的能力极显著高于5%时细胞增殖的能力(P < 0.000 1)。
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图 7 IMSCs P12血清依赖性分析 Fig. 7 Serum dependence analysis in IMSCs P12 |
在培养5D、10D、14D后，显微镜下镜检结果表明，IMSCs P12在软琼脂中均为单独的细胞(图 8A、B、C)，没有形成细胞克隆，而HEK293T细胞形成了明显的独立细胞克隆团(图 8D、E、F)。
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A.软琼脂培养2 d的IMSCs P12；B.软琼脂培养5 d的IMSCs P12；C.软琼脂培养2周的IMSCs P12；D.软琼脂培养2 d的HEK293T细胞；E.软琼脂培养5 d的HEK293T细胞；F.软琼脂培养2周的HEK293T细胞 A.Culture IMSCs P12 in soft agar for 2 days; B.Culture IMSCs P12 in soft agar for 5 days; C.Culture IMSCs P12 in soft agar for 2 weeks; D.Culture HEK293T in soft agar for 2 days; E.Culture HEK293T in soft agar for 5 days; F.Culture HEK293T in soft agar for 2 weeks 图 8 PMSCs和IMSCs P12软琼脂分析(100×，标尺：100 μm) Fig. 8 Soft agar analysis of PMSCs and IMSCs P12 (100×, Bar=100 μm) |
鸡骨骼肌卫星细胞经2%马血清诱导处理后，可以向成肌细胞、肌纤维进行分化。PAX7、MyoD、MyHC分别为鸡骨骼肌卫星细胞、成肌细胞、肌纤维的标志基因。PAX7在PMSCs与IMSCs P12增殖到70%、诱导分化1 d、2 d的表达趋势是一致的，先下降后上升(图 9A)；MyoD在PMSCs与IMSCs P12增殖到70%、诱导分化1 d的基因表达趋势一致，都是上升(图 9B)；MyHC在PMSCs与IMSCs P12增殖到70%、诱导分化1~3 d的基因表达趋势一致，都是上升(图 9C)。
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A.PAX7 mRNA在PMSCs和IMSCs P12中的表达变化；B.MyoD mRNA在PMSCs和IMSCs P12中的表达变化；C.MyHC mRNA在PMSCs和IMSCs P12中的表达变化 A. PAX7 mRNA expression in PMSCs and IMSCs P12; B.MyoD mRNA expression in PMSCs and IMSCs P12; C.MyHC mRNA expression in PMSCs and IMSCs P12 图 9 PMSCs和IMSCs P12诱导分化 Fig. 9 Induced differentiation of PMSCs and IMSCs P12 |
一般而言，原代细胞增殖传代到一定的代数后会停止分裂并伴有衰老、死亡[21]。原代细胞的分离过程比较复杂且不同批次的细胞会带来异质性，影响试验结果[22]。永生化细胞系因其可以提供均质的细胞材料、可重复的试验结果、避免了内源性污染的风险[23]并且具有更好的增殖特性等优势[24]。本研究成功培养了一种鸡骨骼肌卫星细胞系，其生长曲线与细胞周期结果显示增殖趋势与PMSCs保持一致，且IMSCs P12具有更高的增殖活性。
软琼脂试验是检测永生化细胞是否发生恶性转化的标准之一，正常的细胞在软琼脂中并不会生长，而肿瘤细胞可以在软琼脂中生长形成集落[25-27]。HEK293T细胞作为包装慢病毒载体常用的细胞系之一，比较适合作为软琼脂分析的的阳性对照[28]。血清依赖性分析是鉴定细胞是否发生恶性转化的另一标准，肿瘤细胞即使在低血清培养基中也会增殖[29]。SV40法构建的细胞系在低血清培养基中很难形成集落，增加血清浓度后，可见细胞增殖[30]。本研究中，IMSCs P12在软琼脂培养2周后，依旧为单独的细胞克隆，且随着血清浓度的升高，IMSCs P12的增殖能力在逐渐升高，可见IMSCs P12没有发生恶性转化。
干细胞具有多能分化潜能，可以通过外部因素诱导分化成其他细胞，这种能力使得干细胞的研究非常有价值[31-33]。在构建永生化细胞时，干细胞优先作为选择的对象之一[34]。已有许多研究表明，骨骼肌卫细胞可以向成肌、成脂等细胞分化，永生化细胞系的建立将为肌肉、脂肪分化相关调控过程提供体外细胞模型[35-39]。骨骼肌卫星细胞在未分化时主要表达PAX7基因，而MyoD、MyHC低表达；在分化过程中，PAX7的表达下调，MyoD、MyHC的表达上调[40-43]。本研究通过对IMSCs P12诱导分化，当IMSCs P12增殖到70%到诱导分化第1天这一段时期，PAX7基因表达下调，MyoD、MyHC基因表达上调。基于这些结果，该细胞系具有与PMSCs相似的分化能力。
SV40-LT基因的转导可以使细胞越过复制衰老期，同时也保留许多原代细胞的分化特性[44-45]。有研究表明，转染SV40-LT可建立永生化细胞系[46]，但由于宿主具有特异性，SV40-LT能否在鸡细胞中发挥作用还是未可知的[47]。在研究家禽骨骼肌功能方面，可供使用的细胞系相对有限[48-49]。本研究成功地建立了一种稳定传代至12代的鸡骨骼肌卫星细胞系，下一步将利用其来探究与骨骼肌发育和功能相关基因的表达和功能。但所建立的细胞系培养传代至后期细胞增殖较慢，并且在诱导分化2 d后，IMSCs P12中PAX7、MyoD、MyHC基因的表达显著高于PMSCs。由此推断，SV40-LT基因并不适用于鸡骨骼肌卫星细胞永生化的建立。
4 结论本研究通过慢病毒包装SV40-LT基因转染PMSCs得到连续传代、生长良好的鸡骨骼肌卫星细胞系，这为研究家禽骨骼肌相关的功能基因提供了新的细胞模型，也为家禽永生化细胞系的建立提供了研究依据。
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(编辑 郭云雁)