2. 北京市农林科学院畜牧兽医研究所, 北京 100097;
3. 扎鲁特旗畜牧业良种繁育中心, 通辽 029100
2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Municipal Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100097, China;
3. Zhalute Banner Livestock Breeding Center, Tongliao 029100, China
副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum, Apg)为革兰阴性菌，无鞭毛，其毒力菌株常常存在荚膜结构。Apg是一种兼性厌氧菌，目前常用的Page分型方法[1]可将其分为A、B、C三个血清型。研究表明，这三个血清型菌株均有致病性。Apg是引起鸡传染性鼻炎(infectious coryza, IC)的病原菌。IC最明显的症状是鼻道和鼻窦等上呼吸道有浆液性或黏液性分泌物流出、面部水肿和结膜炎，导致蛋鸡的产蛋率下降和生长停滞[2]。该病在世界范围内广泛分布。最新的调查显示，在国内17个省市地区的240个规模化养殖场中，Apg阳性场有119个，场阳性率高达49.6%[3-4]。国际上，在印度, 该病是仅次于沙门菌感染的第二大细菌性疾病[5]，在南非和美国的部分地区肉鸡中也广泛感染，引起严重的肉质下降，增加淘汰率，给养鸡业造成严重的经济损失[6]。
深入研究病原菌的毒力因子和致病机理是建立科学防控策略的基础和前提[7]。近年来，对Apg毒力因子的研究取得了一定的进展，这对于挖掘疫苗候选抗原和研究弱毒疫苗具有重要意义。本文将从该病原菌的结构成分和功能性分泌物等方面进行系统综述，以便深入研究Apg的致病机制和防控策略。
1 细菌被膜及组分 1.1 荚膜和荚膜多糖荚膜是许多细菌的关键毒力因子，其位于细菌细胞壁表面。荚膜表现为一层边界不明显，易被洗脱的松散黏液物质，具有介导免疫反应和抵抗物理应激的作用[8]。细菌荚膜多糖(capsule polysacharides, CPS)是荚膜上的多糖结构，可以保护细菌免受吞噬作用和补体介导的杀伤，直接影响细菌的毒力[9]。一些细菌能够在感染的不同阶段调节荚膜表达，这对疾病的发生和发展至关重要。CPS具有阻止细菌与宿主受体结合、干扰细菌定植的作用，因此被认为是一种优质的疫苗候选抗原[10]。
Wu等[11]研究发现，Apg中的荚膜生物合成位点有两种基因型(Ⅰ和Ⅱ)，但与血清型无关。基因型Ⅰ和Ⅱ的荚膜生物合成基因座分别由6个和5个基因组成。基因型Ⅰ编码的蛋白质与多杀性巴氏杆菌荚膜A型和F型的蛋白质最相似，而基因型Ⅱ编码的蛋白质与多杀性假单胞菌荚膜D型和大肠杆菌K5的蛋白质最相似。这些蛋白质分别含有合成软骨素和肝素的特异性基因。同时，提取并纯化Apg荚膜多糖，并以Apg血凝素(hemagglutinin, HA)为目标抗原，结合后进行免疫保护，发现可以显著提高血清抗体水平[12]。以上结果表明HA和CPS作为两种不同性质的细菌外膜成分，均具有一定的免疫原性，可以作为候选抗原，具有研发重组疫苗的应用潜力。
Sawata等[13]发现一种含有透明质酸的荚膜，它与细菌定植有关，也是引起IC及其相关病变的主要因素。该荚膜能抵抗正常鸡血清的杀菌活性，从而起到保护细菌的作用。具有荚膜结构的Apg分离株往往拥有更强的毒力[14]。
为了进一步验证荚膜对Apg毒力的影响，Tu等[15]通过TargeTronH基因敲除系统构建了hctA基因沉默的Apg荚膜突变株，发现该突变株的血凝活性与野生型菌株相比有明显提升。此外，突变株表现出对鸡胚成纤维细胞DF-1更强的黏附性和在非生物表面上形成生物膜的能力。毒力测定表明，荚膜突变株的毒性低于野生型菌株，敲除荚膜在增加了血凝和黏附活性的同时降低了毒力。
1.2 脂多糖脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰阴性菌细胞壁外壁的组成成分，与致病菌的黏附、侵染和宿主细胞间的扩散有关。脂多糖是一种“内毒素”，细菌在生长过程中不会主动分泌，只有在细菌死亡时才会从破碎的菌体中被释放出来。现有研究表明，Apg的毒力强弱与脂多糖有关，从血清型A、C菌株培养上清液中分离的脂多糖能引起心包积液，导致动物发生中毒症状，产蛋率下降[16]。
1.3 磷酸胆碱磷酸胆碱(phosphorylcholine, ChoP)是在许多黏膜病原体表面发现的重要毒力因子，其主要在LPS上表达，具有增强细菌在黏膜上定植的作用[17]。Chiang等[18]研究发现在Apg台湾分离株TW07的全基因组测序中，含有与流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的lic1ABCD操纵子[19]和多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)的pcgDABC操纵子[20]具有高度序列相似性的四基因操纵子，编码胆碱激酶、胆碱通透酶、磷酸胆碱胞苷转移酶和磷酸胆碱转移酶；两个操纵子都参与细菌LPS上ChoP的代谢和合成。在鸡抗菌肽的杀菌试验中，ChoP的高表达增加了Apg的存活率。这些结果表明，ChoP与LPS的生物合成有关，并具有一定保护效果，是影响Apg毒力强弱的重要因子。
1.4 外膜蛋白外膜蛋白(outer membrane protein, OMPs)是革兰阴性菌外膜的主要结构成分，同时也是最先与宿主细胞相互作用的部位，在维持细菌自身结构、营养运输、致病性和免疫保护性等方面发挥着重要作用。OMPs还具有较强的免疫原性且能诱导保护性免疫反应[21]。HMTp210是Apg外膜蛋白上最主要的抗原之一，它包含一种在致病过程中起重要作用的外膜血凝素[22]，具有血凝、细胞黏附和影响生物膜形成活性的功能[23]。其全长约6.1 ku，分为“区域1”“区域2”和“区域3”三个区域。区域2的序列(大约位于HMTp210的编码核苷酸3300-4800处)已被确定为高变区[24]，可以作为抗原起到有效保护效果[25]，并且与Apg的血清型分型有关[1]，也是亚单位疫苗研发的重要靶点。全细菌灭活苗因为含有大量内毒素等非保护性抗原成分，毒副作用比较强，而亚单位疫苗克服了这一缺点，在降低生产成本的同时减轻了毒副作用，具有更高的安全性和保护效力。早期进行过以外膜蛋白HagA作为Apg亚单位疫苗的抗原的相关研究，但由于免疫保护效果较差，因此未用于疫苗开发[26]。随着对于Apg外膜蛋白的深入研究，发现利用HMTp210区域2构建的重组融合肽可以起到和全菌灭活疫苗相同的保护效果，并且无明显毒副作用，为新型IC疫苗的制备提供了思路[25]。
2 细菌分泌物 2.1 外膜囊泡致病菌毒力因子的释放有赖于专属的分泌系统，许多革兰阴性菌通过分泌系统将毒力因子从细菌的胞内分泌到宿主细胞或环境中。外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)是一种在革兰阴性菌中普遍存在的包含生物学活性物质的球状囊泡状结构[27]。目前已知的大多数革兰阴性菌如铜绿假单胞菌、幽门螺杆菌等分泌的OMVs可携带多种生物活性物质[28-29]，不仅是致病性病原的毒力因子[30]，而且具有很好的免疫原性，是极具潜力的新型疫苗抗原[31]。早在2005年Ramón等[32]就发现Apg的外膜囊泡中含有RTX蛋白、血凝素抗原等毒力因子。Mei等[33]通过质谱分析发现Apg的OMVs蛋白组分包含膜蛋白、ATP依赖的RNA解旋酶、磷酸甘油酸激酶等。将该OMVs与鸡巨噬细胞共培养，细胞中炎症相关基因表达水平显著升高。将提取的A型Apg的OMVs制成疫苗进行动物免疫攻毒试验，发现接种疫苗的鸡血清中IgG水平显著提高，说明OMVs刺激了鸡的体液免疫。但是免疫后的试验鸡仅对A型Apg菌株的攻毒保护率高达80%，对于B型和C型菌株的保护率不超过30%[33]，这表明OMVs携带的抗原成分具有特异性，并且没有血清型之间的交叉保护作用。
Xu等[34]对Apg分离株P4chr1及其OMVs进行比较基因组分析，发现OMVs具有携带和转移抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes, ARGs)的能力。测序和数据分析表明，分离株P4chr1的基因组大小约为2.77 Mb，包含一个大小为25 kb，涵盖11种ARGs的耐药基因岛。该OMVs囊括的基因组大小约为2.69 Mb，覆盖了97%的基因组长度和P4chr1株几乎所有基因序列。经过纯化和DNase处理后，来自耐药分离株的OMVs与抗生素敏感的参考株在含有氯霉素、红霉素、四环素或链霉素的培养基平板上共同培养，发现均有菌落生长，并可在这些菌落中检测到对应的ARG，表明OMVs具有传递携带Apg耐药基因的特性。
2.2 金属蛋白酶细菌蛋白酶，特别是由病原体产生的蛋白酶，会对其宿主产生毒性作用[35]，并与毒力和致病性有关。金属蛋白酶(metalloproteinases, MPs)是一类活性中心含有金属离子的蛋白酶[36]，可以有效地水解蛋白质和多肽[37]。金属蛋白酶最初以不活跃的酶原形式产生，由胞内和胞外蛋白(如纤溶酶)激活。Rivero-García等[38]就发现Apg在体内生长时，黏膜表面可以分泌一种金属蛋白酶，能降解鸡免疫球蛋白IgA和IgG，尽管不能做到完全降解，但这种蛋白酶活性可能是一种毒力因子，促进细菌定植并逃避免疫防御或获得营养，在Apg引起致病过程中发挥作用。
2.3 RTX毒素RTX毒素(repeats in the structural toxin)是由多种革兰阴性细菌产生的一种外毒素，可对人和动物致病，也是评估细菌毒力的重要标志物[39]。Mena-Rojas等[40]在Apg中纯化出一种相对分子质量为110 ku的蛋白，并通过试验证明该蛋白可能属于RTX蛋白家族，被认为是不同于革兰阴性病原体的重要毒力因子，该蛋白家族还包含溶血毒素、金属蛋白酶和脂肪酶等[41]。以前的报道也提到嗜血杆菌中有潜在的RTX毒素基因[42]，这些基因在Apg中更可能以细胞毒素的形式出现。2014年，Küng和Frey等[43]发现一种名为avxA的二价丝氨酸蛋白酶-RTX孔蛋白毒素(bivalent serine-protease-RTX-porin toxin)，并构建得到Apg突变株JF4965(包含特定的重组基因avxA-RTX、avxC和hlyBD)。该毒素编码RTX操纵子结构，具有激活基因avxC、结构丝氨酸蛋白酶-RTX毒素基因avxA和适当的Ⅰ型分泌系统基因avxBD。AvxA属于复合RTX毒素，在结构毒素中具有两个主要结构域，这在RTX毒素中相当罕见。在AvxA中，N端结构域代表丝氨酸蛋白酶，C端结构域代表RTX细胞毒素，这两个结构域相互切割。因此，AvxA被称为多功能自动处理RTX毒素(MARTX)，属于具有多种活性的RTX毒素[44]。AvxA-RTX对禽巨噬细胞HD11具有细胞毒性，但对牛巨噬细胞BoMac无细胞毒性。来自血清A型Apg菌株的重组AvxA-RTX单特异性兔抗血清中的IgG能够中和Apg血清型A、B和C培养物上清液的细胞毒活性[43]，表明AvxA是Apg的主要细胞毒力因子。
3 铁离子获取和利用铁是大多数细菌必不可少的微量元素，参与细胞内酶的合成，影响细胞代谢过程。细菌的获铁系统在其感染宿主及致病过程中起着重要作用，细菌获铁系统相关的蛋白也是重要的毒力因子。然而，宿主中游离铁的浓度不足以支持细菌的生长[45]。为了实现有效的铁稳态，细菌已经进化出复杂的铁获取系统，以从周围环境(铁载体、血细胞或宿主分子结合蛋白)中获取铁，以确保充足的供应[46]，从而发挥其毒力。
3.1 铁载体转运系统能够获取游离无机铁的铁载体转运系统由细菌外膜上的铁载体和TonB依赖性转铁蛋白受体(TonB-dependent transferrin receptors, TBDR)组成[47]。三价铁载体通过外膜受体运输时需要耗能，而这种能量是由TonB能量系统提供的。因此，在铁限制条件下，细菌会增加一些与TonB能量系统相关的蛋白表达，以促进铁载体穿过外膜进入胞质。TonB依赖性转运蛋白(TonB-dependent transporters, TBDT)是一种膜蛋白，能够高亲和地结合铁、维生素B12、铁载体和碳水化合物，其中一些成分还可能作为毒力因子发挥作用[48]。
TonB ExbB-ExbD蛋白存在于许多革兰阴性细菌中，其中大多数存在于大肠杆菌系统中。Huo等[49]研究发现在铁刺激条件下，Apg中发生了TonB系统转运蛋白ExbD和ExbB共转录现象，很可能还存在TonB ExbB-ExbD蛋白质复合物。由于将铁从周质转运到细胞质需要细胞质膜上的ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC transporter)参与，因此转运蛋白ATP结合蛋白的表达也被上调，以更好地促进铁进入细胞质并提高细菌对铁的利用率。以上试验结果表明，ExbD和ExbB通过铁载体转运系统发挥作用，影响细菌的铁获取和毒性。
3.2 血红素利用系统血红素利用系统在细菌的铁获取和致病性中起到重要作用[50]。通常，血红素摄取系统由TonB依赖性外膜受体蛋白、周质结合蛋白和内膜相关ABC转运蛋白组成[45]。对病原菌而言，游离铁的可用性受到严格限制，导致铁载体获取不足[51]。因此，为了从血红素中获取铁，细菌利用了复杂的血红素获取机制[46]。革兰阴性菌还可以通过外部TBDR将血红素转运至周质，然后周质血红素结合蛋白将其转运至细胞质[52]。在细胞质中，血红素可以被血红素降解酶降解，从而获得铁离子[51]。
HutZ是一种储存血红素的蛋白，它在血红素利用、生物膜形成和某些细菌的致病性方面起着重要作用[50]。研究发现，HutX是一种细胞质血红素转运蛋白，有促进血红素向HutZ的转移的作用，通过特定的蛋白质相互作用实现[53]。在铁限制条件下，HutZ和HutX蛋白会优先表达[52]，这表明血红素摄取可能是获得铁的重要途径之一。HutZ也可以被视为在细胞质中释放铁的血红素降解酶，而HutX则是HutZ的细胞质血红素转运蛋白，有助于Apg获得铁和利用血红素。
4 内源性质粒质粒是一种独立于细菌基因组之外的携带遗传信息并具有自主复制能力的环状DNA分子，可以携带耐药基因或其他功能元件，是细菌产生耐药性以及额外功能的重要途径，同时也是影响细菌毒力的一个重要因素[54]。
质粒可能还携带一些特殊基因，会对菌株的生长特性或者毒力产生影响。最早在2003年，Terry等[55]在Apg分离株HP250中首次检测到一种大小为6.29 kb的质粒p250。该质粒上存在一个细菌素编码位点，该基因与流感嗜血杆菌素的细菌素(haemocin)编码基因高度同源，但因其基因座中的基因无法扩增，所以蛋白功能尚不清楚。
直到2007年，Hsu等[56]从18株中国台湾地区Apg分离株中检测鉴定了两种质粒：pYMH5和pA14。pYMH5是一种大小为5 047 bp的耐药性相关质粒，编码功能性链霉素、磺胺、卡那霉素和新霉素的抗性基因，并显示出与广泛宿主范围质粒pLS88具有显著的同源性，这是Apg中报道的第一个多重抗生素抗性质粒。pA14是另一种质粒，可以通过克隆获得两种表达载体：pYMH11和pYMH12。测序发现它们分别编码MglA蛋白和外切核糖核酸酶(RNaseⅡ)。已有研究表明，在流产布鲁氏菌(Brucella abortus)和土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)中也中也存在MglA蛋白，并且对其毒力产生重要影响。MglA通过诱导巨噬细胞产生细胞因子，导致细胞存活能力下降[57]，并且影响土拉弗朗西斯菌中噬菌体与溶酶体的结合[58]。其他Apg分离株的全基因组测序分析也发现了RNase Ⅱ基因序列的存在[34]。编码RNase Ⅱ的主要蛋白VacB在先前的试验中已被证实是福氏志贺菌(Shigella flexneri)和肠侵袭性大肠杆菌(Escherichia coli)中表达毒力所必需的基因，缺乏RNase Ⅱ会导致细胞无法正常生长[59-60]。2018年，在我国的Apg分离株中也重复发现了这三种质粒[61]，表明这些质粒的存在并不是偶然事件。2023年，刘洋洋等[62]诱导构建了质粒p250和p A14缺失株APG-HuΔ，攻毒试验表明，质粒缺失株的毒力显著下降。综上所述，这些结果表明质粒是Apg的重要毒力因子，需要进一步研究其作用机制。
5 其他毒力因子随着对Apg的研究愈发深入，人们发现了更多的毒力因子，例如Tn10转座子、菌毛蛋白和CDT毒素等。然而，这些毒力因子的作用机制尚不十分明确。
5.1 Tn10转座子Tn10是一种大小为9 147 bp的复合转座子，携带四环素抗性基因(tetR/A/C/D)[63]。Tn10被广泛应用于诱变研究，以研究突变对适应度的影响，并用于构建标记的mini-Tn10质粒库，以削弱病原体的毒力，可用于减毒活疫苗的制备[64]。2013年，Requena等[65]在秘鲁Apg分离株中发现一个与转座子Tn10相似性高达99%的6 488 nt片段，其中包含四个四环素抗性基因。此外，基因组中还发现了IgA蛋白酶，表明其可能具有水解鸡的IgA样免疫球蛋白的能力。这种蛋白酶可以切割宿主分泌的IgA免疫球蛋白，从而绕过宿主黏膜防御机制，增强感染呼吸道的能力[66]。
5.2 菌毛蛋白菌毛是许多病原菌表面的蛋白质细丝，参与细菌对宿主细胞的黏附和侵袭，在微生物的定植中起重要作用[67]。2016年Liu等[68]通过对Apg TW07的测序发现了一个flfA蛋白，它是F17样菌毛基因簇的一部分。研究发现，在攻毒试验中，fifA蛋白可以诱导机体产生特异性抗体。同时，发现flfA基因缺失株TW07-DflA的毒力低于其亲本野生型菌株TW07，表明flfA基因也可能是Apg的一个重要毒力因子。
5.3 CDT毒素细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin, CDT)是由革兰阴性致病菌产生的基因毒素。完整的CDT是由CdtA、Cdt B和Cdt C三个亚基组成的异源三聚体，其主要功能是破坏真核细胞的染色体DNA，导致细胞分裂周期阻滞，进而引起细胞凋亡，这有助于细菌有效突破宿主的防御并实现定植感染[69]。2013年Chen等[70]通过对Apg分离株进行全基因组测序分析，发现了一段全长约为2.1 kb的CdtABC基因。PCR结果显示，不同的Apg分离株中均能扩增CdtABC基因，并且其序列高度保守。采用HeLa细胞和DF-1细胞进行细胞毒性测定试验，结果表明Apg中的CDT毒素可以完全杀死DF-1细胞，并引起HeLa细胞出现细胞质膨胀和细胞核增大等中毒病变。免疫试验结果显示，使用CdtABC基因制备的多克隆抗体可以有效中和CDT毒素的活性，为Apg疫苗的研发提供了新的方向。
6 小结Apg作为IC的病原菌，近年来在国内外广泛传播，持续受到关注。最近有学者报道在发病的鹅和鹌鹑中分离到Apg，表明Apg的宿主动物不再单一，有可能感染其他禽类，造成更严重的经济损失。
随着分子生物学技术的发展，对Apg毒力因子的研究日益深入，不断有新的毒力因子被发现，其中部分毒力因子间具有协同作用。然而，至今还没有完全阐明与Apg毒力分泌系统调控、信号转导以及涉及的转录调控因子、群体感应系统、外膜囊泡携带ARG转移等上游机制有关的信息。鉴于细菌毒力系统的重要性，了解各毒力因子在致病过程中的地位和协同作用至关重要。通过结合生物信息学分析，可以综合研究Apg的毒力相关基因表达、蛋白功能和生物学特性。同时还可以运用蛋白-蛋白/蛋白-核酸互作技术，深入探究Apg毒力因子的作用机制。希望通过这些研究，解决不同血清型Apg疫苗无法提供有效交叉保护的难题，为IC的防控和新型疫苗的开发提供新的思路和理论基础。
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(编辑 白永平)