, JIA Fumin, HE Peili, JIA Yuqing, SHUI Fei, LIU Xuling, LIU Xing, WANG Xin, XU Man, GENG Zhaoyu
匍匐性状是鸡品种中存在的一种特有的矮小表型，其特征为胫短身矮、翅膀短小。IHH基因是影响软骨细胞增殖和分化的重要调节因子，其介导软骨细胞增殖、分化和造骨细胞分化过程，在机体的骨骼发育中起着重要的作用。实验室前期研究证明，IHH是调控匍匐性状的关键基因[1]，但还需从细胞和分子水平进一步研究验证该机理，从而有助于更加深入地了解匍匐性状。
IHH属于一个非常保守的Hedgehog分泌蛋白家族。在哺乳动物中，IHH有两个结构高度相似的成员，Sonic hedgehog (SHH)和Desert hedgehog (DHH)[2]。IHH主要由生长板中的前肥大软骨细胞和早期肥大软骨细胞分泌和表达。前期研究证实，IHH是调控骨生长发育的主要因子，通过与受体结合，活化Smoothed (Smo)膜蛋白，从而将信号转导，其在软骨细胞增殖、分化和成骨分化等方面起着重要的作用[3-4]。St-Jacques等[5]发现，早期肥大软骨细胞分泌的IHH可以调控其周围软骨细胞分化为成骨细胞。PTHrP-IHH信号通路是软骨内成骨中的关键调节通路，PTHrP通过下调骨形态蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)信号，抑制成骨细胞的分化[6]。IHH与PTHrP各自或共同调节软骨细胞与成骨细胞的分化。Murakami和Noda[7]发现，在成年大鼠股骨骨折愈合过程中，IHH主要表达于软骨细胞和成骨细胞，这表明IHH可能是软骨内骨化的调节因子。目前，已有研究证实IHH信号通路在骨骼生长发育及维持稳态方面起着至关重要的作用[8-9]，但IHH对软骨细胞表型及功能的调控机制尚不清楚。
因此，本研究通过构建过表达载体进行细胞转染，采用CCK-8法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，试剂盒法检测ALP活性，旨在从细胞水平上探究过表达IHH对体外培养的鸡软骨细胞增殖和分化的影响，为改善鸡匍匐性状提供指导。
1 材料与方法 1.1 材料鸡原代软骨细胞于安徽农业大学家禽分子遗传育种与生产实验室细胞间培养，质粒pEGFP-N1购自美国Invitrogen公司。
1.2 主要试剂与仪器RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；Transgen反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；TransStart Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶EcoR Ι和BamH Ι购自TaKaRa；无毒素质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和LipofectamineTM2000购自美国赛默飞公司；Cell Counting Kit-8购自南京翼飞雪生物科技有限公司；细胞周期试剂盒和细胞凋亡试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。
细胞培养箱(ThermoFisher, USA)；PCR仪(Eppendoorf，Germany)；荧光定量PCR仪(Roche，Switzerland)；流式细胞仪(BD，USA)；酶标仪(BIO-RAD，USA)。
1.3 方法1.3.1 IHH克隆引物的设计及合成 根据NCBI数据库中IHH基因全长编码序列(IHH, 1 227 bp, NM_204 957.2)，结合插入的载体酶切位点信息，设计其PCR扩增信息，并在引物上游引入EcoRⅠ酶切位点和Kozak序列(GCCACC)，下游引入BamHⅠ酶切位点。该引物由上海生工生物工程有限公司合成，见表 1。
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表 1 IHH基因克隆引物序列 Table 1 Primers used for cloning IHH gene |
1.3.2 重组过表达质粒的构建及鉴定 根据IHH基因及pEGFP-N1载体(OV-NC)序列设计引物，在上、下游引物插入EcoR Ι、BamH Ι酶切位点。PCR方法扩增IHH基因片段，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带，然后用凝胶试剂盒回收纯化PCR产物。分别取PCR扩增产物和pEGFP-N1载体用EcoR Ι、BamH Ι进行双酶切，酶切后，回收目的片段和线性载体，采用T4 DNA连接酶进行连接，于37 ℃转化培养14 h，挑选单菌落，筛选阳性克隆，进行重组质粒的提取。双酶切凝胶电泳鉴定重组质粒DNA大小正确后，将酶切鉴定正确的质粒送至上海生工生物工程有限公司进行测序，并于NCBI网站进行Blast比对，质粒命名为OV-IHH。
1.3.3 细胞转染及分组 将鸡软骨细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。质粒转染前24 h将细胞以1×106的密度接种于6孔板中，待细胞融合度达到80%~90%时进行转染，转染40 h后，荧光显微镜下观察细胞转染效率，并收取细胞，提RNA进行反转录，qPCR检测IHH基因的mRNA表达量。再分别检测软骨细胞在24、48、72 h的IHH基因表达效率，以确定转染最佳时间。试验细胞分为对照组、空载体组(OV-NC)和过表达组(OV-IHH)，每组设置3个生物学重复。
1.3.4 CCK-8法检测细胞增殖 将鸡软骨细胞接种至96孔细胞板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，将过表达质粒转染至细胞内，分别在培养24、48和72 h后加入10 μL的CCK-8试剂，轻轻摇晃混匀，37 ℃静置孵育3 h, 酶标仪检测450 nm波长下的OD值。
1.3.5 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡 利用Cell cycle staining Kit细胞周期试剂盒进行细胞周期检测。取转染48 h细胞，胰酶消化后用PBS洗涤，1 500 r·min-1离心5 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇，－20 ℃固定；取固定的细胞8 000 r·min-1离心4 min，PBS洗涤后，加入100 μg·mL-1的RNAase 100 μL重悬细胞，37 ℃孵育30 min；再加入400 μL PI(50 μg·mL-1)染色液混匀，置4 ℃条件下避光孵育30 min，用流式细胞仪进行检测。
利用Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测。取转染48 h细胞，把细胞培养液吸出至合适离心管内，PBS洗涤后用胰酶消化细胞，加入细胞培养液，混匀后1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；取1~5×105重悬的细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入500 μL结合液轻轻重悬细胞；随后加入Annexin V-PE，轻轻混匀后加入10 μL 7-ADD，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，用流式细胞仪进行检测。
1.3.6 试剂盒检测ALP活性 将鸡软骨细胞接种于12孔培养板中，细胞密度为4×105个·孔-1，当细胞融合度达到80%~90%时，将过表达质粒转染到细胞内，转染48 h后，采用成骨诱导分化培养基进行诱导分化至21 d，分化后的细胞使用ALP试剂盒检测ALP活性。
1.4 统计学分析mRNA相对表达量采用2-△△Ct法处理，并整理成“平均值±标准差”的形式，再利用Sigmaplot 14.0软件进行图形绘制；应用统计学软件SPSS 20.0进行统计分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05表示差异具有显著统计学意义。
2 结果 2.1 重组过表达质粒的构建及鉴定以cDNA为模板进行PCR扩增，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否扩增成功。IHH基因PCR产物大小约1 227 bp，与GenBank中报道的IHH序列大小相对应，表明IHH基因PCR产物扩增成功。
用限制性内切酶EcoR Ι、BamH Ι双酶切重组过表达质粒，获得4 000 bp的pEGFP-N1载体和1 227 bp的IHH基因片段(图 1)，表明重组过表达质粒构建成功。IHH基因重组过表达质粒经酶切鉴定为阳性，将质粒送到通用生物系统(安徽)有限公司进行测序，测序结果与在GenBank中检索的IHH基因cDNA序列进行比对，测序结果中的基因序列与GenBank登录序列完全一致，表明重组过表达质粒构建成功。
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M. DNA相对分子质量标准；1.重组过表达质粒；2.空载体；3.重组过表达质粒双酶切；4.PCR产物 M. DNA marker; 1. Recombinant overexpression plasmid; 2. Empty vector; 3. Double enzyme digestion of recombinant overexpression plasmid; 4. PCR product 图 1 重组过表达质粒双酶切电泳图 Fig. 1 Double enzyme digestion electrophoretogram of recombinant overexpression plasmid |
由图 2可知，将空载体和重组过表达质粒转染软骨细胞40 h后，在荧光显微镜下，OV-NC组和OV-IHH组都可观察到绿色荧光，表明重组过表达质粒已成功转入软骨细胞。转染过表达质粒后，与对照组和OV-NC组相比，OV-IHH组IHH基因mRNA表达量显著增加(P < 0.01)，IHH基因的表达效率扩大2 700倍左右(图 3)，表明过表达质粒构建成功。
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OV-NC为空载体；OV-IHH为重组过表达质粒，下同 OV-NC is the empty vector; OV-IHH is the recombinant overexpression plasmid, the same as below 图 2 重组过表达质粒转染鉴定 Fig. 2 The transfection identification of recombinant overexpression plasmid |
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*表示差异显著，**表示差异极显著，下同 * means significant difference, ** means extremely significant difference, the same as below 图 3 重组过表达质粒的IHH过表达效率 Fig. 3 IHH overexpression efficiency of recombinant overexpression plasmids |
为探究重组过表达质粒转染效率的最佳时间，将重组过表达质粒转染软骨细胞，分别在24、48和72 h收取细胞，提RNA反转录后进行qPCR检测。由图 4可知，重组过表达质粒在24、48和72 h的IHH基因的表达效率分别扩大了4 300、5 580和4 430倍，因此取转染后48 h为过表达效率最佳时间。
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图 4 重组过表达质粒在不同时间的IHH过表达效率 Fig. 4 IHH overexpression efficiency of recombinant overexpression plasmids at different times |
将重组质粒转染至软骨细胞，由图 5可知，与对照组和OV-NC组相比，OV-IHH组细胞OD值显著增加(P < 0.01)。表明过表达IHH基因促进细胞增殖。
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图 5 过表达IHH对细胞增殖的影响 Fig. 5 Effect of IHH overexpression on the cell proliferation |
由图 6可知，对照组、OV-NC组和OV-IHH组的S期细胞占比分别为8.04%、9.81%和19.56%。与对照组和OV-NC组相比，OV-IHH组S期细胞占比显著增加(P < 0.01)。表明过表达IHH基因促进细胞增殖。由图 7可知，对照组、OV-NC组和OV-IHH组的细胞凋亡比例分别为7.98%、8.94%和2.23%。与对照组和OV-NC组相比，OV-IHH组细胞凋亡显著减少(P < 0.01)。表明过表达IHH基因抑制细胞凋亡。
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图 6 过表达IHH对细胞周期的影响 Fig. 6 Effect of IHH overexpression on the cell cycle |
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图 7 过表达IHH对细胞凋亡的影响 Fig. 7 Effect of IHH overexpression on the cell apoptosis |
由图 8可知，对照组、OV-NC组和OV-IHH组的ALP活性分别为78.15、78.41、101.20 U·mg-1。与对照组和OV-NC组相比，OV-IHH组的ALP活性显著升高(P < 0.01)，表明过表达IHH基因促进了细胞的分化能力。
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图 8 过表达IHH对ALP活性的影响 Fig. 8 Effect of IHH overexpression on the ALP activity |
近年来，随着群体中匍匐性状的鉴定，禽类骨骼发育成为人们日益关注的问题，胫骨、软骨发育不良严重影响着禽类的生产性能。为了进一步探讨IHH影响鸡匍匐性状的作用机制，本研究构建了IHH的重组过表达质粒，并成功转染到鸡软骨细胞中。所用软骨细胞为实验室前期培养，并经软骨细胞标志蛋白Col Ⅱ的免疫荧光检测确定为软骨细胞[10]。查阅资料发现，IHH是HH家族中的一员，主要表达于软骨细胞，在软骨细胞增殖和分化方面起调节功能[11]。在软骨细胞增殖和肥大时，IHH是必需的[5, 12]。因此，本研究继续探讨了IHH对鸡软骨细胞增殖凋亡的作用。研究发现，过表达IHH使得鸡软骨细胞的S期细胞占比显著增加，促进了细胞增殖。而Deng等[13]研究发现，IHH下调导致软骨细胞周期在G1至S期之间受到阻滞。这也从侧面佐证了本试验结果。进一步检测发现，过表达IHH使得鸡软骨细胞的凋亡细胞比例显著下降，抑制了细胞凋亡。上述研究结果与前人的报道类似，如在人骨关节炎软骨和培养的鸡软骨细胞中研究中发现，IHH的激活对软骨细胞肥大化加速发挥重要作用[14-15]。此外，研究发现敲除IHH基因导致小鼠的四肢变短，软骨细胞的生长受到抑制[13, 16]。张洁靖[17]在研究大鼠软骨细胞中发现，经HH信号通路作用后，细胞活性受到影响，细胞凋亡也因此被损害，结果表明在软骨损伤过程中，IHH有可能参与其中。Mak等[18]将软骨中HH信号提高，促进软骨细胞肥大，关节软骨数量减少。
本研究对软骨细胞进行干扰和过表达IHH处理后，通过体外诱导分化后检测其细胞碱性磷酸酶(ALP)活性，以探究IHH对鸡软骨细胞分化的影响。ALP是机体中重要的酶类，当相应细胞向成骨方向转化时，可根据ALP活性进行判定。在不同类型细胞中，ALP含量不同。在成熟软骨细胞中，只有少量的ALP存在，而当细胞处于肥大化时期，或者是细胞出现钙化时，ALP含量增加，表现出较高的活性[19]。因此，越来越多的研究根据ALP活性判断软骨细胞是否成熟。Deng等[13]研究发现，IHH敲除降低了软骨细胞的ALP活性和矿物质沉积。这些结果提示，IHH下调软骨细胞生长和分化的抑制作用可能与TGF-β/Smads和OPG/RANKL信号通路有关。此外，有研究证实了过表达IHH增加MC3T3-E1细胞中ALP活性和OCN mRNA表达水平[20]。在本研究中，过表达IHH，ALP活性升高。结果表明IHH基因能够促进软骨细胞分化。
4 结论本试验成功构建了IHH基因过表达载体；过表达IHH可促进软骨细胞增殖和分化，研究结果为从细胞水平上进一步解析IHH基因对鸡匍匐性状的作用机制提供理论依据。
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(编辑 孟培)