猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是引起初生仔猪腹泻的主要病毒性疾病之一，可感染所有年龄的猪, 7~10 d的仔猪死亡率高达80%~100%[1]，PEDV毒株的变异以及多种腹泻病毒的交叉感染导致现有疫苗对PEDV感染的保护有限[2]。中药的应用效果和安全性已得到广泛验证，成为畜牧业疾病防治的研究热点。白头翁散临床上常用于治疗腹泻，含有多种活性成分(如白头翁皂苷、小檗碱、盐酸巴马汀等)，具有抗菌、抗病毒和免疫调节等作用，主要作用于胃肠道[3]；对溃疡性结肠炎有良好的治疗效果[4]，还可通过调节小鼠TLR4/Myd88信号通路治疗流感病毒FM1诱导的肺炎[5]。益生菌发酵可裂解植物细胞壁并转化其代谢产物，提高中药的功效和适口性，调节肠道菌群，增强肠道功能，从而达到防控疾病及健康养殖的目的[6]。如中药及其乳杆菌发酵物可改善头孢曲松钠引起的小鼠异常腹泻[7]；枯草芽胞杆菌发酵中药可调节肉鸡肠道菌群组成，显著提高前肠中双歧杆菌的相对丰度[8]。此外，益生菌定植于宿主肠道，发挥调节肠道菌群平衡和增强免疫功能的作用[9]。因此，拟建立PEDV感染模型，探究白头翁散能否减轻感染PEDV仔猪的肠道损伤。尚未发现有文献报道白头翁散在减轻感染PEDV仔猪肠道损伤和调节肠道菌群方面的作用，本研究将为预防或治疗PEDV感染提供新的视角。
1 材料与方法 1.1 材料干酪乳酸杆菌R、猪流行性腹泻病毒(PEDV，HN2021)均由河南农业大学微生物实验室提供；黄连、黄柏、白头翁和秦皮购自北京同仁堂股份有限公司。
煎剂根据《中华人民共和国兽药典》规定配伍，将黄柏(45 g)、黄连(30 g)、白头翁(60 g)、秦皮(60 g)等原药材在常温下用蒸馏水浸泡1.5 h，再用2 000 mL蒸馏水煎煮2次，每次1 h，最后用旋转蒸发仪浓缩至1 g ·mL-1，保存于4 ℃。将干酪乳酸杆菌R在无菌液体MRS培养基中37 ℃培养24 h，菌液(4%)添加到白头翁散煎剂中(100 mL)，用食品级Na2CO3调节pH至6.5，37 ℃培养24 h，菌落达到109 CFU ·mL-1[7]。
1.2 试验设计试验方案遵循河南农业大学动物护理和使用专业委员会批准[许可证编号SCXK(河南)2013-0001]。从PEDV阴性农场购买24头7日龄体重相近(杜×长×大)杂交仔猪，采用隔离室饲养，每个隔离室有单独的通风和排水系统，防止交叉污染。将仔猪随机分为4组：对照组，PEDV组，煎剂组，发酵组，每组3个重复。试验期为12 d，经过3 d适应期，第4天对照组接种生理盐水，其他3组中每头仔猪以104.5 TCID50剂量接种PEDV(HN2021)；第5~9天，煎剂组和发酵组每天灌服煎剂和发酵液(0.2 mL ·kg-1)；经过3 d观察期，第12天，前腔静脉采集血液，然后处死全部仔猪，收集肠道样本并用4%多聚甲醛固定或液氮速冻，-80 ℃保存待用。
1.3 生长性能与腹泻指数指标试验期间每天记录仔猪体重、腹泻和采食量，收集新鲜粪便进行活菌培养。粪便评分如Zhang等[10]描述，分为4个等级：0=正常，1=糊状，2=半液体，3=液体。分数≥2为腹泻。计算公式：平均日增重(ADG)=总增重/试验时间。
料肉比(F/G)=每头仔猪总采食量/每头仔猪总增重。
1.4 肠道细菌组成指标新鲜粪便均质后在生理盐水中梯度稀释，将稀释度为10-1~10-7的样品涂布在不同的选择性琼脂培养基上。采用平板计数法对大肠杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌和双歧杆菌进行平板计数。
1.5 肠道中病毒拷贝量指标将0.5~1.0 cm的肠道样本切成碎片, 加入1 mL TRIzol进行RNA提取，用NanoDrop ND-2000分光光度计检测RNA质量，随后使用Prime-ScriptTM试剂盒合成cDNA。引物序列如表 1所示。qRT-PCR使用SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒建立，并在应用生物系统7500快速RT-PCR上进行分析，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，39个循环。用GAPDH作为内部对照，采用2-ΔΔCt法检测目的基因的表达水平。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
将肠道样本的固定组织沿横切面切成约1 cm的管状，4%多聚甲醛固定，经过脱水，透明并包埋在石蜡中，切片至4 μm厚，苏木精-伊红染色后晾干制片，测量绒毛高度(VH)、隐窝深度(CD)、绒毛高度/隐窝深度的比值(VH/CD)。
将采集的血液样本在4 ℃下、3 000 r ·min-1离心10 min，获得血清。按照试剂盒说明书中提供的步骤和方法检测血清中D-木糖含量，肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)和二胺氧化物(DAO)的活性。
1.7 血清和肠道抗氧化酶指标称取0.15 g肠道组织，剪碎混匀制备10%的组织匀浆，3 000 r ·min-1离心10 min，取上清，用于检测抗氧化指标。根据试剂盒的说明书检测血清和肠道中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。
1.8 数据分析至少进行3次独立试验。结果以“x±s”表示，用SPSS 22.0进行单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。GraphPad Prism 8.0绘制直方图。
2 结果 2.1 对生长性能和PEDV复制的影响由图 1可知，PEDV感染前，4组间仔猪平均日增重(ADG)和料肉比(F/G)无明显差异，无腹泻现象；PEDV感染后仔猪ADG显著降低，F/G显著升高(P < 0.05)；灌药可逆转这种现象，患病仔猪ADG显著升高(P < 0.05)。感染PEDV仔猪粪便评分显著升高，与PEDV组相比，灌药后粪便评分显著降低(P < 0.05)。结果表明灌药后可改善患病仔猪的生长性能，降低腹泻率。
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A. 平均日增重(ADG)；B. 料肉比(F/G)；C. 粪便评分；D. PEDV复制。差异显著性以小写字母表示，标有相同字母为差异不显著(P>0.05)，标记字母不同为差异显著(P < 0.05)，下同 A. Average daily gain (ADG); B. Feed to meat ratio (F/G); C. Fecal score; D. PEDV replication. The significance of the difference is indicated by lowercase letters, the same letter means the difference is not significant (P>0.05), and the different letter means the difference is significant (P < 0.05), the same as below 图 1 灌药对平均日增重、料肉比、粪便评分和PEDV复制的影响 Fig. 1 Effect of administration on Average daily gain, feed to meat ratio, fecal score and PEDV replication |
为了检测灌药对肠道中病毒复制的影响，检测了PEDV M基因在十二指肠，空肠和回肠中的表达量。结果表明，PEDV感染后M基因在十二指肠、空肠和回肠中均高表达，对照组未检测到M基因表达。与PEDV组相比，煎剂组和发酵组M基因表达量显著降低(P < 0.05)。表明灌药后可显著抑制PEDV在肠道中的复制。
2.2 对肠道细菌组成的影响由图 2可知，与对照组相比，PEDV组第5、7、10天大肠杆菌和沙门菌数量显著增加，乳酸杆菌和双歧杆菌数量显著减少(P < 0.05)，表明感染PEDV仔猪肠道菌群组成遭到破坏，灌药后肠道菌群组成显著改善，乳酸杆菌和双歧杆菌数量显著增加(P < 0.05)。发酵组第10天乳酸杆菌和双歧杆菌数量显著增加，与对照组相比也有显著升高的趋势(P < 0.05)。
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A.大肠杆菌的活菌计数；B. 灌药对沙门菌数量的影响；C. 灌药对乳酸杆菌数量的影响；D. 灌药对双歧杆菌数量的影响 A. Live bacteria counts of Escherichia coli; B. Live bacteria counts of Salmonella; C. Live bacteria counts of Lactobacillus; D. Live bacteria counts of Bifidobacterium 图 2 灌药对试验第5、7和10天大肠杆菌、沙门菌、乳酸杆菌和双歧杆菌数量的影响 Fig. 2 Effect of administration on the number of Escherichia coli, Salmonella, Lactobacillus and Bifidobacterium on days 5, 7 and 10 of test |
表明灌药后可改善患病仔猪肠道细菌组成，有助于乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖。
2.3 对肠道形态和屏障功能的影响由图 3可知，对照组肠道绒毛结构正常，无明显组织学病变。PEDV感染后组织学病变主要出现在十二指肠、空肠和回肠，表现为肠绒毛萎缩、溶解，肠腺损伤，上皮细胞部分脱落，灌药后可大量减少组织病变。PEDV组十二指肠、空肠和回肠VH降低，CD增加，灌药后各肠道组织中VH显著升高，CD显著降低，VH/CD显著升高(P < 0.05)(图 4)。表明灌药后可改善患病仔猪的肠道形态。
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红箭头.绒毛溶解，萎缩，损伤，上皮细胞排列不规则 Red arrow. Villus dissolution, atrophy, damage, and epithelial cells arranged irregularly 图 3 灌药对十二指肠，空肠和回肠组织病理学结构的影响(苏木精-伊红染色，100×) Fig. 3 Effect of administration on the histopathological structure of duodenum, jejunum and ileum (hematoxylin and eosin staining, 100×) |
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A. 绒毛高度(VH)；B. 隐窝深度(CD)；C. 绒毛高度/隐窝深度(VH/CD)；D. D-木糖、二胺氧化物和肠型脂肪酸结合蛋白水平 A. Villus height (VH); B. Crypt depth (CD); C. Villus height/crypt depth (VH/CD); D. D-xylose, diamine oxide (DAO) and intestinal fatty acid binding protein (I-FABP) level 图 4 灌药对绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度以及D-木糖、二胺氧化物(DAO)和肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)水平的影响 Fig. 4 Effect of administration on villus height, crypt depth, villus height /crypt depth, D-xylose, diamine oxide and intestinal fatty acid binding protein level |
由图 4可知，PEDV感染后血清中D-木糖含量显著降低(P < 0.05)，I-FABP和DAO浓度均显著提高(P < 0.05)。相比之下，灌药后可显著提高D-木糖含量，降低血浆中I-FABP的浓度(P < 0.05)，表明灌药后可增强肠道屏障功能。
2.4 对血清和肠道抗氧化酶的影响由图 5可知，PEDV组血清中GSH-Px活性以及血清和十二指肠T-SOD活性均显著降低(P < 0.05)，十二指肠，空肠和回肠中MDA含量显著升高(P < 0.05)。然而，灌药后PEDV感染仔猪十二指肠，空肠和回肠中GSH-Px活性以及MDA含量显著降低(P < 0.05)。与对照组相比，灌药后回肠GSH-Px活性和空肠MDA含量无显著性差异(P＞0.05)。表明灌药后可改善患病仔猪血清和肠道中的抗氧化酶水平，提高抗氧化能力。
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A. 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性；B. 总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；C. 丙二醛(MDA)含量 A. Glutathione peroxidase (GSH-Px) activity; B. Total superoxide dismutase (T-SOD) activity; C. Malondialdehyde (MDA) content 图 5 灌药对谷胱甘肽过氧化物酶活性、总超氧化物歧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的影响 Fig. 5 Effect of administration on glutathione peroxidase activity, total superoxide dismutase activity, and malondialdehyde content |
PEDV感染临床症状包括腹泻、呕吐，以及体重减轻，与PEDV引起的肠道功能障碍密切相关[11]。本试验中，灌服白头翁散煎剂和发酵液可显著提高感染PEDV仔猪的ADG，从而改善患病仔猪的生长性能。白头翁散对生长性能的有利作用可能是通过增强肠道功能来促进肠道吸收，与此观点一致的是，感染PEDV仔猪腹泻减轻，如粪便评分降低所示。值得注意的是，发酵液治疗效果优于煎剂，表明发酵后白头翁散复方中的活性成分大量释放，并且添加干酪乳杆菌R有助于减少腹泻。据报道，罗氏乳杆菌HY25101治疗可降低PEDV引起的腹泻和死亡率[12]。此外，作者发现十二指肠中病毒拷贝量最高，这与Jung等[13]的研究结果不一致，Jung等认为空肠和回肠是PEDV复制的主要靶点。这种差异可能是由于检测方法和毒株的不同，重要的是白头翁散煎剂及其发酵液均可降低肠道组织中病毒基因的表达。
PEDV感染与肠道菌群之间存在潜在关联，调节肠道菌群有助于降低PEDV的发病率和死亡率[14]。中药可通过增加乳酸杆菌和双歧杆菌的数量改善腹泻引起的肠道菌群紊乱[15]。作者发现白头翁散可提高PEDV感染仔猪肠道益生菌数量，抑制有害菌群，这与白头翁皂苷通过调节肠道菌群的组成，改善大鼠炎症的发现一致。乳酸菌可改善仔猪腹泻，提高肠道细胞对大肠杆菌的抵抗力[16]。目前尚不清楚肠道中乳酸杆菌数量的增加是否抑制PEDV感染，但有助于抑制有害菌群增殖，增强肠道免疫。肠道菌群组成对胃肠功能和健康至关重要，调节肠道菌群可能是预防或治疗PED的一种措施。需要进一步研究来确定菌群物种水平上的具体变化，尤其是乳酸菌群。
PEDV感染易产生大量氧自由基，导致氧化损伤；MDA含量作为氧化应激的标志，可用来判断细胞的损伤程度[17]。在本试验中，感染PEDV仔猪十二指肠、空肠和回肠MDA含量显著升高，这与Wang等[18]的发现一致。作者发现灌药可显著降低MDA含量，升高血清和十二指肠中T-SOD活性，表明白头翁散可调节氧化还原状态，减轻氧化损伤。
PEDV感染主要破坏肠道上皮细胞和绒毛形态，可引起肉眼可见和显微镜下的组织学病变[19]，白头翁散煎剂和发酵液可使患病仔猪肠黏膜损伤明显降低，表明白头翁散有助于保护感染PEDV仔猪的肠黏膜结构的完整性。此外，PEDV感染显著降低D-木糖含量，提高DAO活性，引起肠道功能障碍，作者发现灌药治疗扭转了这一现象，从而增强肠道屏障功能。考虑到患病仔猪腹泻率的降低，调节肠道菌群组成以及肠道形态和屏障功能的改善，可认为白头翁散有利于PEDV感染仔猪的肠道健康。
4 结论白头翁散可增强感染PEDV仔猪的肠道屏障功能，且灌服煎剂发酵物的治疗效果优于煎剂，具有改善患病仔猪生长性能、降低腹泻率，调节肠道菌群组成，保护肠黏膜结构的完整性和增强肠道屏障功能，并提高抗氧化能力。
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(编辑 白永平)