角膜溃疡与损伤是犬猫极为常见的眼部疾病，通常归因于眼表疾病或感染。局部药物治疗对于单纯性、浅表性溃疡可起到积极的治疗效果^[1-4]。深度角膜溃疡、损伤以及角膜穿孔等较为严重的情况则需尽快手术治疗以挽救视力甚至眼球^[5]。而坏死性角膜炎是猫(feline corneal sequestrum, FCS)的一种特有且常见的角膜疾病，多个品种猫均可患病，最常见于波斯猫，被认为与角膜慢性刺激和猫疱疹病毒1型感染等因素有关^[6-9]。

多年来，各种眼表手术应用于犬猫角膜相关疾病的治疗中，其中包括角膜移植术、结膜瓣移植术、角膜结膜移植、猪小肠黏膜下层或膀胱黏膜下层移植、羊膜移植、牛心包膜以及马肾包膜移植等^{[7, 10-21]}。其中同种异体角膜移植术可提供最佳的光学以及解剖学治疗效果，但供体匮乏以及储存技术等因素使其无法在兽医临床中广泛开展。而其他材料与技术均存在光学性差、获取困难以及角膜形态改变等局限性。

角膜脱细胞生物组织工程材料是通过脱细胞、灭活病毒以及γ射线灭菌等方式获得的猪角膜脱细胞支架。由于该类材料具有组织反应轻、匹配度高等特点，近年来已被广泛研究并逐步应用于人、犬和猫的角膜移植中^[22-24]。本研究是全球首次大型回顾性评估犬猫单独使用新型生物组织工程角膜进行眼表修补与重建后的相关并发症、角膜长期结构与光学效果，以期为该类材料广泛、安全地用于兽医临床提供数据支撑，同时为比较眼科学提供较高参考价值。

1 材料与方法 1.1 试验动物

收集2018—2022年在西南大学教学动物医院、新瑞鹏宠物医疗集团相关眼科诊疗机构和厦门御宝贝宠物医院接受显微眼科手术的139例犬、猫的病例记录。所有动物均接受了全面的眼科检查(包括威胁反射、瞳孔对光反射、角膜反射、泪液量测试、荧光素钠染色、裂隙灯检查、眼内压测量和间接检眼镜检查)，其中49例猫病例进行了猫疱疹病毒-1型(feline herpesvirus-1，FHV-1)检测；所有动物均进行常规体检、血常规与血液生化检查以及胸腔X线检查。手术动物的医疗记录信息包括：物种、品种、性别、年龄、眼别、眼部疾病、治疗史、植片大小与厚度以及随访结果(限于篇幅未列出，可扫描OSID码获取)。所有手术均获得动物主人知情同意。本研究仅纳入至少随访3个月的患畜。

1.2 主要仪器与材料

裂隙灯生物显微镜(日本KOWA有限公司)；回弹式眼压计(芬兰Icare公司)；间接检眼镜(美国Keeler公司)；光学相干断层扫描仪(OCT，深圳市斯尔顿科技有限公司)；手术显微镜(德国目乐，德国徕卡)；呼吸麻醉机(首美达实业股份有限公司，迈瑞公司，美国Matrx)；心电监护仪(美国Masimo公司)；PCR仪(上海基灵生物科技有限公司，Bio-Rad公司)；I/A系统(美国眼力健公司，瑞士傲帝仪器股份公司，博士伦公司)。

Schirmer泪液试验(STT I)试纸条(天津晶明新技术开发有限公司)；荧光素钠试纸条(天津晶明新技术开发有限公司)；新型生物组织工程角膜(三河宠明宠物食品用品销售有限责任公司)；10-0可吸收缝合线(威海威高富森医用材料有限公司)；10-0尼龙线(日本马尼公司)；角膜环钻(苏州明仁医疗器械有限公司)；隧道刀(日本马尼公司)；角膜刀(日本马尼公司)；黏弹剂(华熙生物科技股份有限公司)。

1.3 术前治疗以及新型生物组织工程角膜移植术

术前给药包括：0.5%左氧氟沙星滴眼液(日本东亚制药株式会社)4~6次·d^-1；1%阿托品眼凝胶(沈阳兴齐眼药股份有限公司)2~4 d 1次；0.3%透明质酸滴眼液(I-DROP^® VET GEL, I-MED ANIMAL HEALTH SANTÉ ANIMALE, Saint-Laurent, QC, Canada)3次·d^-1；对于FHV-1 PCR检测为阳性的患猫局部给予碘苷滴眼液(Meds for Vets，LLC，Sandy，UT，USA)8次·d^-1；口服泛昔洛韦(中国台湾诺华股份有限公司)90 mg ·kg^-1，BID。

术前通过OCT检查进一步辅助确定某些病灶(例如FCS)深度。使用右美托咪定(硕腾公司)肌注(5 μg ·kg^-1)和丙泊酚(广东嘉博制药有限公司)静脉推注(2 mg ·kg^-1)诱导麻醉，随后使用异氟烷(江苏中牧倍康药业有限公司)维持麻醉。动物仰卧保定后，使用真空头枕塑形头部。使用1%聚维酮碘溶液对术眼进行消毒。对于存在眼睑内翻的病例先进行眼睑内翻矫正术，同时存在大疱性角膜病变或角膜糜烂者则使用角膜热成形术与角膜清创术进行辅助治疗(图 1A、B)。所有病例的角膜移植术均在手术显微镜下进行，彻底清创后首先使用眼科量规测量病灶直径(完全覆盖病灶)，随后使用环钻与隧道刀制作植床，全层角膜移植病例在术中补充黏弹剂维持前房(图 1C、D)。根据角膜切割深度选择不同型号的无菌生物组织工程角膜(本研究使用的型号包括200、300、400和450 μm)(图 1E)。使用无菌平衡盐液对生物组织工程角膜复水5~10 s后再次使用环钻制作植片，最后使用10-0缝线进行对称性结节缝合(8、16或32针)(图 1F)。术中持续监测动物心率、心电图、血氧饱和度、无创血压以及体温等生理指标。术后即刻再次进行OCT检查以评估植片状态。所有动物术后严格佩戴脖圈直至植片稳定。

1.4 术后治疗

所有病例术后当天即刻开始治疗。局部使用0.5%左氧氟沙星滴眼液6~8次·d^-1，持续4周；透明质酸纳滴眼液6次·d^-1，持续4~8周；1%阿托品眼凝胶1次·d^-1，持续1~3周；表皮生长因子滴眼液(桂林华诺威基因药业有限公司)6次·d^-1，持续3周；0.03%他克莫司滴眼液(MEDS FOR VETS, Utah, USA)2次·d^-1，直至角膜血管与肉芽增生基本消退；自体血清(对于存在角膜大疱或溶解的病例)8~12次·d^-1直至角膜形态稳定；妥布霉素地塞米松滴眼液(爱尔康公司)3~6次·d^-1(对于穿透性角膜移植和部分犬病例)直至角膜炎性情况与免疫反应得到控制；口服美洛昔康(上海汉威生物医药科技有限公司)0.1 mg ·(kg ·d)^-1，持续5 d；对于穿透性角膜移植病例还包括全身静脉给予抗生素、止血药以及类固醇等药物1周。

1.5 术后检查与随访

所有病例在术后2个月内每周进行常规眼科检查，随后术后3、6和12个月进行随访。部分病例在术后第3、6和12月对角膜进行OCT检查以评估其形态。对本研究中的所有动物进行最终角膜恢复情况与视力评估等级(本研究中所有动物术后观察期至少不低于3个月)，评估标准如表 1、图 2所示。最终对所有动物主人进行问卷调查询问其满意度。

1.6 数据统计分析

使用GraphPad Prism5.0或SPSS 18.0对数据进行统计分析。分类变量数据(例如动物品种、性别、角膜疾病类型、植片型号、角膜透明度等级以及并发症等)以百分比表示；连续变量数据(例如术后随访时间、角膜上皮化时间等)以“平均值或平均值±标准差”表示。使用卡方检验分析物种、动物年龄、角膜再上皮化时间、植片大小及厚度、角膜修复时间、术后并发症与角膜透明度的相关性。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果 2.1 治疗动物信息

本研究包括109只猫(112只眼)和27只犬(27只眼)。涉及品种、年龄范围、性别、眼别、病灶位置等信息如表 2所示。角膜疾病类型在猫中以FCS(94/112，83.93%)居多，而犬中则以角膜穿孔(17/27，62.96%)为主，共计板层移植103例(74.10%)，全层移植36例(25.90%)。患眼基本均伴有角膜新生血管、角膜水肿、角膜上皮糜烂、大疱性角膜病变、虹膜嵌顿等并发症。32例(32/49, 65.31%)猫病例FHV-1为阳性。

2.2 手术与植片信息

在本研究中，除4例猫曾接受结膜瓣遮盖术(病例21)、生物补片移植(病例78)、角膜结膜移植术(病例39)和角膜板层切除术(病例55)外，所有动物均为首次接受角膜手术(图 3A、3E、3I和3M)。角膜植片的直径范围为3~13 mm(中位数为7.50 mm)。植片厚度包括：200 μm(2例，1.44%)、300 μm(42例，30.22%)、400 μm(53例，38.13%) 和450 μm(42例，30.22%)。所有病例均单独采用生物组织工程角膜移植术进行手术治疗，所有术眼均使用10/0或9/0可吸收带针线进行缝合，对于术后植片出现明显裂开的个别病例使用10/0尼龙线进行加强固定缝合。除了穿透性病例在处理脱垂虹膜时偶见虹膜粘连与出血外，未见其他明显术中并发症。

2.3 术后随访、并发症与手术结果

术后137例患眼最终完成角膜再次上皮化，时间范围为5~21 d(中位数为8 d)；2例最终未能完成上皮化(病例69和76)。最终139个植片均与受体角膜完全整合。在猫中，术后1周植片出现轻度水肿且略有增厚，持续2~3周。所有病例均可见角膜新生血管，从术后第2周或第3周开始出现，并逐渐向植片迁移(图 3B)。根据个体差异，7例植片显示出不同程度的血管化和大量细胞浸润，使得植片呈现显著肉芽增生样外观，但在接下来的4~6周内无明显感染迹象。局部使用他克莫司后，植片血管化及凸起现象在术后3~8周内逐渐改善。角膜的透明度通常在手术后的第2~4个月开始逐渐恢复(图 3C)，术后第6个月时移植物几乎完全透明，仅通过裂隙灯生物显微镜可见少许“幽灵血管” (图 3D)。全层移植病例愈合过程及特点与板层类似，最终根据植片大小而存在不同程度的瘢痕(图 3F~H)。

犬角膜术后的愈合模式与猫大体相似，但在术后特点以及预后方面仍存在一定差异。无论板层或全层移植手术，大多数病例在术后2~3周可观察到植片存在较为明显的血管化以及外周角膜水肿(图 3J)。植片经2~3周的融合期，其特征为角膜完全上皮化、明显血管化以及显著的突起和细胞浸润。部分病例待角膜上皮化完成后局部给予妥布霉素-地塞米松滴眼液可逐步改善此情况，此时植片变得平坦、稳定且具有一定的透光性(图 3K)。板层移植病例基本在术后第4~6个月植片趋于透明，仅少量血管残留时植片具有良好的光学性(图 3L)，而全层移植病例术后角膜透光性相对较差(图 3M~P)。总体而言，犬角膜术后透明度较猫差。

尽管术后14例眼睛(10.07%)出现了一些并发症：植片部分松脱与裂开(5例，3.60%，其中2例随后进行补针缝合)(图 4A)、植片溶解或穿孔(8例，5.76%，随后1例配合使用结膜瓣遮盖术、1例配合瞬膜遮盖术、1例配合角膜结膜移植术)(图 4B)、角膜植床出现坏死(1例，0.72%，随后再次手术)和眼球萎缩(1例，0.72%)(图 4C、D)，但在最后一次随访评估中，所有猫术眼(112/112, 100%)均保持视力，且绝大部分患眼角膜具有良好的透明度与稳定的结构，其中角膜透明度评级结果为0级80例(80/112，71.43%)、1级23例(23/112，20.54%)、2级8例(8/112，7.14%)和3级1例(3/112，2.68%)，未见任何坏死灶复发迹象。犬眼在最后一次随访评估时27只患眼均保持光滑的角膜结构，其中25例(25/27, 92.59%)患眼具有视力，角膜透明度评级结果为0级2例(2/27，7.41%)、1级5例(5/27，18.52%)、2级15例(15/27，55.56%)、3级3例(3/27，11.11%)、4级1例(1/27，3.70%)以及5级1例(1/27，3.70%)。5级病例(病例114)由于术前眼内结构破坏较为严重，从而最终导致眼球萎缩，但角膜保持完整与光滑。

所有病例的术后随访时间范围为3~50个月(中位数为18个月)。共有114例患眼(82.01%)随访时间不低于6个月，其中99例患眼(71.22%)随访时间≥12个月。参与问卷调查的畜主(135/139, 97.12%)在最后一次随访时对手术结果(动物角膜外观与视力效果)表示满意(图 5)。

2.4 OCT扫描结果

本研究共有35只动物进行了OCT扫描(鉴于畜主接受度与依从性等因素)。术前评估猫坏死灶深度几乎均超过角膜1/3厚度，穿透性病例可见角膜破损处无正常组织结构(图 6A、B)。术后即刻OCT检查可见植片与植床紧密连接，连接处自然过渡且光滑，复水后的植片密度暂时高于植床角膜(图 6C、D)。术后第3个月，OCT显示角膜上皮与前泪膜完整，植片和角膜稳定融合。在板层病例中，植片与受体角膜植床之间的连接线在大多数猫的病例中已不可见，但在犬中还相对常见。某些板层移植病例可见植片显著变薄；而穿透性病例此时植片区域与临近正常角膜之间已形成连接结构，但缺乏内皮细胞层。某些病例(植片直径较大病例)可观察到植片增厚(图 6E、F)。术后第6个月，板层移植病例的整体角膜保持高度均质的形态结构；全层移植病例上皮与泪膜完整，角膜厚度存在一定区别(图 6G、H)。术后1年再次进行OCT检查时，板层移植病例的整个角膜的厚度和纤维走向趋势保持高度一致；但部分全层移植病例(植片直径较大病例)仍表现出植片区域厚于临近的非手术角膜区域(图 6I、J)。

2.5 角膜透明度与手术及临床特征相关性

本研究综合患眼最终角膜透明度与形态特征，将等级为0~1级视为术后最佳恢复效果，根据等级结果与动物自身情况及手术等特征进行了相关性分析(表 3)。结果显示术后角膜透明度与动物年龄(P=0.021)、物种(P=0.000)、植片直径(P=0.032)、是否全层移植(P=0.000)以及角膜再上皮时间(P=0.000)显著正相关，与角膜修复时间(半年为界限)(P=0.196)和术后并发症(P=0.356)无统计学差异。

3 讨论

在兽医临床中，角膜疾病是占比最高的眼科疾病类型，其中不乏一些特异性或代表性的角膜病，将严重影响动物视力与眼球完整性。FCS是一种猫高发的角膜疾病，在本研究中，FCS占据了猫病例的83.93%，且波斯猫所占比例高达70.64%(77/109)，该趋势与其他报道相似^{[18, 25]}。鉴于FCS病灶绝大多数均位于角膜视轴区或旁中央，因此该疾病的治疗原则应包括尽可能保留视轴区透光性。就光学性效果而言，同种异体或自体角膜移植或许是最佳术式选择，但供体来源匮乏以及自体角膜取材有限极大地制约了这些术式的广泛开展^{[11, 25]}。因此，数年来有多种其他方法与材料尝试应用于临床中，但均存在瘢痕明显以及一定复发率的弊端^{[13, 20-21, 26-31]}。深度角膜溃疡以及各种原因导致的角膜穿孔是兽医临床中常见的眼科急症，在较短时间内可直接威胁动物视力以及眼球完整性。本研究中角膜溃疡/穿孔为50例(50/139，35.97%)，病因主要为外伤、继发于FCS以及短头颅犬综合征等。类似于板层角膜损伤，多种技术与修补材料也曾用于深层角膜溃疡、损伤以及角膜穿孔，其中包括深板层或穿透性角膜移植术、结膜瓣遮盖术、角膜结膜移植术、生物材料修补术(猪小肠黏膜下层、膀胱黏膜、肾包膜、心包等)^{[13, 20-21, 26-31]}。上述各种手术方法或移植材料的选择取决于角膜缺损的程度、角膜并发症情况、材料的适应症以及操作者的技术与经验，但仍存在各种较为明显的短板，例如严重的角膜瘢痕、角膜表面不光滑、明显角膜色素化等。

为寻找天然角膜的良好替代物，近年来，通过脱细胞技术获得的生物组织工程角膜已广泛用于实验动物中，以评估其安全性与有效性^{[23, 32-33]}。在人与动物各种角膜疾病的前期临床治疗中，猪脱细胞角膜组织展现出了较好的组织相容性、低并发症和免疫排斥反应，以及较好的光学性^{[24, 34-36]}。本研究所采用的新型生物组织工程角膜通过温和洗涤的方法获得无抗原、无病原体的脱细胞幼猪角膜支架。该无菌材料易于储存(冷藏可保存18个月)与便携，并且具有最大直径12 mm以及不同厚度的特点，几乎可覆盖犬猫各种类型的角膜缺损。该材料具有良好的生物相容性和机械支撑作用，所有术眼在术后2~3个月后均表现出光滑的角膜表面，并且在板层移植病例中形成规律的基质纤维走向。

角膜再上皮化对于任何类型的角膜移植手术而言均至关重要，对移植物存活扮演着关键角色^[37]。通过上皮化可稳定移植物状态，防止基质感染或溶解。本研究结果显示，除了2例上皮化失败外，其余所有病例术后角膜完成再上皮时间为5~21 d(平均8.79 d)，这与天然角膜植片趋势大体一致，且犬猫之间未见明显差异^[11]。此外，本研究发现植片直径与再上皮时间也并非完全正相关。植片与植床的匹配度、眼表是否存在感染、眼表物理性刺激等则可能是导致上皮化延迟甚至失败的主要因素。出现类似情况须酌情对植片再次进行缝合或其他相应处理，以确保植片稳定与存活。根据作者的经验，当植片厚度略低于植床时往往可获得更快、更顺利的角膜再上皮化过程，这可能与上皮细胞爬行过程中所需历经的障碍程度相关。此外，角膜血管化是对炎症的非特异性反应，在角膜疾病过程中非常普遍^[38]。在本研究中，尽管作者观察到几乎所有植片均会出现不同程度的血管化，但与其他移植手术(如BIOSIS、结膜瓣、和其他类型的脱细胞材料)相比较少，且在术后2~3个月内逐渐消退。角膜细胞浸润在基质重塑过程中至关重要，新型生物组织工程角膜的特点是细胞浸润较为显著，其中犬较猫更为明显，17例术眼可见植片显著凸出，通过局部配合使用他克莫司或地塞米松滴眼液使其逐渐消退。这可理解为角膜修复和重塑过程中细胞因子和受体介导的上皮细胞与基质细胞之间相互作用的结果^[39]。白细胞介素-1、血小板衍生生长因子等细胞因子参与介导基质反应，并进一步激活角膜细胞的静息状态以分化，最终促进角膜基质重塑^[40-42]。作者推测，新型生物组织工程角膜作为一种天然无细胞角膜支架，可与多种细胞因子和化学途径结合，从而促进犬猫角膜细胞的内源性再生与填充。此外，对于角膜神经的内源性生长也具有明显促进作用^[43]。尽管无细胞特性的生物组织工程角膜术后抗原免疫反应极低，但为了缓解角膜炎性反应和降低植片瘢痕化，本研究在植片完成上皮化后局部使用了免疫抑制剂或类固醇滴眼液。未来可进一步开展相关临床研究评估不给予免疫抑制剂情况下的愈合效果。

缝合技术在角膜移植术中具有重要意义。在本研究中，绝大多数病例采用与其他研究相同的结节缝合方法固定植片，尽管在个别病例中使用了额外的缝合线来加强某些象限的稳定性^{[11, 16, 18]}。术后有5例术眼出现不同程度的植片裂开，但仅对2例进行了补针。移植物开裂的原因可能是由于植片直径较大，在上皮未能充分覆盖的情况下由于角膜自身张力、眼睑摩擦甚至动物抓蹭等物理性刺激所造成。在本研究中，10-0可吸收聚乙醇酸和10-0不可吸收尼龙线用作缝合材料。尼龙或许可提供更少的刺激和更好的稳定性，但需要去除。

角膜病灶的直径与深度极大地限制了传统眼表移植手术和各种材料的应用，例如角膜结膜移植或自体板层角膜移植^[28]。目前较深的角膜缺损甚至需要使用多层生物材料进行修补^{[16, 44]}。本研究中根据切割深度以及角膜厚度选择不同型号的生物组织工程角膜(200、300、400和450 μm)。如前所述，除考虑上皮化因素外，结合移植后期的肿胀，选择略薄于植床深度的植片，复水后的膨胀将弥补微小的差异。移植物厚度的减少可能与胶原蛋白的降解有关，降解区域最终由新形成的胶原蛋白补充^[35]。新型生物组织工程角膜在复水后具有一定的弹性，直径可拉伸至14 mm。本研究中使用的移植物直径为3~13 mm，基本涵盖了绝大多数临床适应症。有趣的是，临床结果与统计学分析均并未发现植片直径与预后存在显著相关性，该特点完全不同于传统移植材料，提示大直径的角膜移植也可获得理想的愈合效果。值得一提的是，该类产品在人医领域仅用于板层角膜移植术，但本研究中有高达25.90%(36/139)的病例为角膜穿孔(植片范围3~13 mm)，术后长期效果观察未见一例出现因内皮功能障碍而存在的持续角膜高度水肿，对于穿孔直径较小或微穿孔的病例，术后整个移植区甚至可保持高度透明，这或许与该材料的天然无细胞支架属性有关，内皮细胞可代偿性迁移至植片内表面继续发挥脱水作用。

严重并发症将在一定程度上影响手术预后。本研究中术后较为明显的并发症包括角膜溶解、穿孔以及坏死灶复发。其中角膜溶解仍然与上皮化程度密切相关；部分穿孔病例在很大程度上与术后护理有关；而唯一的1例出现坏死灶复发与切割不彻底的病史有关，提示无论选择何种移植材料，均应彻底移除坏死灶。但无论如何，新型生物组织工程角膜在术后并发症方面仍优于目前其他常用的修补材料，并给予角膜极大的支撑作用，也有利于后期配合使用其他方式进一步处理^[18]。

本研究在长达数年的随访中，观察到该生物组织工程角膜在术后数月内逐渐透明，这吻合其细胞外基质的特性。随着角膜基质细胞、胶原纤维以及神经等物质不断填充该支架，使得角膜逐渐恢复其正常的生理结构与功能^[45]。

4 结论

本研究表明，新型生物组织工程角膜便于保存，对犬猫同种异体的板层或全层角膜移植手术而言均为极好的替代方法；其术后并发症较少且角膜最终可保持良好的结构与光学功能；该材料与相关术式可广泛应用于小动物临床的治疗中，对其他物种或许同样具有较好的治疗效果。