牛流行热病毒(bovine ephemeral fever virus，BEFV)是弹状病毒科、暂时热病毒属的代表性物种，可引起牛高热、呼吸迫促、消化机能障。BEFV目前分布在热带和亚热带地区的40多个国家，导致奶牛产奶产量严重减少、瘫痪或死亡，造成严重的经济影响^[1]。病毒RNA编码10个基因，其中N、P、M、L和G基因编码病毒结构蛋白，G_NS、α1、α2、α3、β和γ编码非结构蛋白^[2-3]。G蛋白是病毒保护性抗原，α1可以结合importin β1和importin 7来调节核内运输途径，α3可与核内不均一性核糖核蛋白K互作引起细胞凋亡并促进BEFV复制，但其它非结构蛋白的功能尚未完全阐明^[4-5]。

在血清学诊断方面，微量中和试验以及基于G蛋白ELISA检测可用于非疫苗免疫动物BEFV感染的诊断，但不能区分疫苗接种和自然感染动物^[6-8]。作者前期全面筛选可用于疫苗免疫和自然感染甄别的病毒抗原，发现BEFV G_NS 蛋白N端截短体、G_NS蛋白C端截短体、α2等蛋白可用于BEFV感染牛和免疫牛血清抗体甄别，且G_NS 蛋白N端截短体与G_NS蛋白C端截短体均具有较好的反应原性^[9]。在实际应用中，作者以蛋白复合物为检测抗原以增加检测准确度^[10]。为了避免制备蛋白复合物的繁琐流程，本研究利用大肠杆菌表达系统制备G_NS全长蛋白，建立了一种与现有疫苗配套的鉴别诊断ELISA方法，为BEFV血清流行病学监测和防控提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料

BEFV HN1/2012株cDNA、pP_ROEXHTb原核表达载体、BEFV临床血清样本、阴性血清、标准阳性血清、标准阴性血清、感染血清，FMDV O型、A型标准免疫血清、Trans5α、Rosetta(DE3)感受态细胞，均保存于中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室。BEF灭活疫苗、BVD-IBR二联灭活疫苗免疫牛血清，由宁夏农林科学院动物科学研究所王建东老师惠赠。

1.2 主要试剂

DNA聚合酶、即用型无缝克隆试剂盒、Ni-NTA琼脂糖纯化树脂以及化学发光试剂盒，为工生物工程(上海)股份有限公司产品。辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG购自Sigma公司。

1.3 原核表达载体构建

以HN1/2012株cDNA为模板，利用G_NS (nt31-666)上游引物：5′-TTTCAGGGCGCCATGGGATCCGTATACTGTGTAAAAACCTC-3′、G_NS(nt 673-1635)下游引物：5′-TCCATGGGATATCGGGGATCCTGATGATTCCTCATTCCAATA-3′PCR扩增并进行胶回收，之后利用快速克隆试剂盒与BamHⅠ、HindⅢ预先处理的pP_ROEXHTb载体进行重组，经转化、菌落PCR筛选、测序验证获得重组表达载体pPRO-G_NS。

1.4 重组蛋白His-G_NS的表达纯化及鉴定

将pPRO-G_NS转化Rosetta(DE3)感受态细胞，在100 mL LB液体培养基中37 ℃培养，在OD值达到0.6~0.8时加入IPTG(终浓度为1.0 mmol·L^-1)继续培养，6 h后收集菌体进行SDS-PAGE确定目的蛋白His-G_NS的表达。离心收集菌体重悬于10 mL PBS中，超声波处理20 min (功率40 W，每破碎5 s后间隔2 s)，然后10 000 g 4 ℃离心10 min，进行可溶性分析确定目的蛋白的可溶性。参照Ni-NTA琼脂糖纯化树脂操作说明，对沉淀中的目的蛋白进行纯化，利用透析液(10 mmol·L^-1 Tris, pH 8.0, 0.1% TritonX-100)透析过夜，保存备用。分别利用1:200倍稀释的BEFV感染牛血清、BEF疫苗免疫牛血清为一抗，HRP标记兔抗牛IgG(1:8 000)为二抗，进行Western blot鉴定。经一抗、二抗分别孵育1 h，用TBST洗膜3次，利用超敏化学发光底物室温避光作用5 min并拍照保存。

1.5 间接ELISA方法的建立

1.5.1 抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定 　　用碳酸盐包被液将不同浓度的His-G_NS蛋白(4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg·mL^-1)包被酶标板，4 ℃放置12 h；经5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，依次加入1:10或1:20稀释的BEFV阳性血清和阴性血清、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG(1:4 000)、TMB底物、终止液，之后测定OD_{450 nm}值。所用稀释抗原、待检血清以及辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG的体积为100 μL，在加入前均利用PBST洗涤酶标板3次。待检血清和辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG的孵育时间均为30 min，TMB作用时间为10 min。最终根据阳性血清OD_{450 nm}与阴性血清OD_{450 nm}比值(P/N值)判定最佳反应条件。

1.5.2 辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG最佳稀释倍数确定 　　按照上述最佳抗原包被浓度和血清稀释度，利用1:2 000、1:4 000、1:8 000、1:16 000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG，进行ELISA，根据最大P/N值确定辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG的最佳稀释度。

1.5.3 临界值确定 　　选取前期利用标准G蛋白抗体ELISA确定的28份阴性牛血清和32份自然感染BEFV的阳性牛血清进行检测，利用公式S/P=(样品OD_{450 nm}-平均阴性对照OD_{450 nm})/(平均阳性对照OD_{450 nm}-平均阴性对照OD_{450 nm})计算S/P值，应用MedCalc v20.0.10进行交互式点图分析，确定cut-off值。

1.5.4 敏感性试验 　　利用建立的间接ELISA，将阳性血清按照1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320稀释，测定其OD_{450 nm}，同时设定阴性对照，计算不同稀释度血清的S/P值。

1.5.5 特异性试验 　　利用建立的ELISA方法，分别对BVD-IBR双价疫苗免疫牛血清、FMDV O型、A型、BEFV感染牛血清进行检测，重复测定3次，确定方法的特异性。

1.5.6 重复性试验 　　分别在同一批包被的酶标板进行5次检测(批内)和5个不同批次制备的酶标板对6份待检血清进行检测，计算变异系数评价ELISA方法的批内、批间重复性。

1.6 临床样本检测

利用建立的间接ELISA方法检测来源于江苏某奶牛场BEF灭活疫苗免疫牛血清95份、云南某奶牛场BEF灭活疫苗免疫牛血清146份并统计检测结果。

2 结果 2.1 G_NS表达载体的构建

以HN1/2012株cDNA为模板进行PCR扩增，获得了1 605 bp的G_NS目的基因片段(图 1A)，与BamHⅠ、HindⅢ双酶切处理的pP_ROEXHTb载体进行重组，菌落PCR鉴定结果表明10个克隆均为阳性(图 1B)，测序表明重组质粒pPRO-G_NS具有正确的读码框。

2.2 重组蛋白的表达纯化与Western blot鉴定

将重组质粒pPRO-G_NS转化至Rosetta(DE3)感受态细胞，利用终浓度1.0 mmol·L^-1的IPTG诱导，SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为73 ku，主要存在于超声沉淀中，纯化获得较为单一的His-G_NS重组蛋白(图 2)。Western blot结果显示，重组蛋白His-G_NS可与BEFV感染血清发生特异性反应(图 3A)，而不与BEF疫苗免疫血清反应(图 3B)。

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1 抗原包被浓度和血清最佳稀释度的确定 　　方阵滴定结果表明，在His-G_NS蛋白包被浓度为0.5 μg·mL^-1，血清稀释度为1:20条件下，P/N值最大。因此，确定0.5 μg·mL^-1的抗原包被浓度和1:20的血清稀释度为最佳反应条件。

2.3.2 辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG最佳稀释倍数确定 　　利用1:2 000、1:4 000、1:8 000、1:16 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG酶标二抗进行检测，结果在稀释度为1:4 000时，P/N值最大，因此确定辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG的最佳稀释度为1:4 000。

2.3.3 临界值的确定 　　检测背景清晰的28份阴性牛血清和32份阳性牛血清并根据OD_{450 nm}值计算S/P值，结果表明，当敏感性为97%、特异性为100%时，其最优cut-off值为0.206 9，因此确定ELISA的临界值为S/P值0.206 9(图 4)。

2.3.4 敏感性试验 　　利用建立的间接ELISA对阳性感染血清进行1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320倍比稀释测定，结果表明当血清稀释度为1:160时，仍判为阳性(S/P>0.206 9)，表明建立的ELISA具有较好的敏感性。

2.3.5 特异性试验 　　利用建立的ELISA方法，分别对BVD-IBR双价疫苗免疫牛血清、FMDV O型、A型、BEFV感染血清进行检测，结果显示只有BEFV感染牛血清检测结果为阳性，其余全为阴性(图 5)，表明建立的ELISA方法具有较好的特异性。

2.3.6 重复性试验 　　统计结果显示，建立的ELISA批内变异系数为6.59%~9.90%，批间变异系数为4.83%~9.93%，均小于10%，表明所建立的间接ELISA方法具有较好的重复性。

2.4 临床样本检测

利用建立的间接ELISA方法检测来源于江苏某奶牛场BEF灭活疫苗免疫牛血清95份、云南某奶牛场BEF灭活疫苗免疫牛血清146份并统计检测结果(图 6)，从江苏奶牛场检出3份阳性血清，阳性率为3.15%；从云南奶牛场检出5份阳性血清，阳性率为3.42%。

3 讨论

牛流行热至今已有150余年的历史，该病主要感染奶牛和黄牛，其特点是发病率高死亡率低，但近年来在我国河南省和台湾省以及国外的土耳其等地均报道了该病在牛的较高病死率，引起较为广泛关注^[11-14]。利用灭活疫苗免疫是牛流行热防控必不可少的重要措施，但现有抗体诊断方法无法区别牛自然感染BEFV或BEF疫苗免疫产生的抗体，因此感染与免疫鉴别诊断方法的建立成为牛流行热防控中亟待解决的问题。

作者在前期证实G_NS截短体的反应原性的基础上，进一步表达纯化获得了G_NS全长蛋白并建立了ELISA方法。作者发现G_NS全长蛋白只与BEFV感染牛血清反应而不与疫苗免疫牛血清反应，表明灭活疫苗中不含G_NS蛋白或含量很低不足以在免疫牛产生抗体，且本研究进一步证实G_NS与牛常见病毒FMDV、BVDV、IBRV抗体均不存在交叉反应，特异性良好，是一种理想的鉴别诊断靶标。与作者前期基于G_NS截短重组蛋白建立的ELISA方法^[9]相比，本研究发现利用G_NS全长重组蛋白建立ELISA，其抗原最佳包被浓度(0.5 μg·mL^-1)和待检血清浓度(1:20)低于G_{NS aa 11-222}截短重组蛋白包被浓度(1.0 μg·mL^-1)和待检血清浓度(1:10)，可能在于全长G_NS重组蛋白较截短重组蛋白含有较多的抗原表位，更适用于抗体诊断试剂盒制备。通过阳性血清系列稀释，血清稀释度为1:160仍可检出，本研究建立的ELISA与作者前期建立的基于G蛋白的ELISA方法具有类似的敏感性^[15]，且批内和批间CV均小于10%，表明该DIVA ELISA具有良好的敏感性和重复性。由于现有血清学诊断方法只能通过中和抗体判定牛的BEF疫苗接种史或自然感染史，但不能进行甄别。本研究在方法建立过程中，利用前期基于G蛋白抗体ELISA方法筛选的健康牛血清和BEFV自然感染牛血清进行标定，确保了检测BEFV感染的准确率(结果“2.2.3”)。通过检测源于江苏某奶牛场BEF灭活疫苗免疫牛血清95份、云南某奶牛场BEF灭活疫苗免疫牛血清146份，结果从江苏和云南疫苗免疫群体检出BEFV感染率分别为3.15%和3.42%，与前期报道江苏省免疫牛的BEF发病率一致^[16]，但略低于云南省部分地区未免疫牛的BEFV感染率(4.93%~21.69%)^[17]，进一步表明疫苗免疫在阻断BEFV中起到至关重要的作用。

4 结论

本研究利用原核表达系统成功表达纯化BEFV G_NS全长蛋白，从包涵体中纯化复性获得只与BEFV感染牛血清具有反应特异性的重组G_NS蛋白，建立了BEFV感染与疫苗免疫鉴别诊断的间接ELISA方法，具有良好的敏感性、特异性和重复性，适用于BEFV自然感染和疫苗免疫牛的鉴别诊断，为我国牛流行热诊断提供了新的技术储备。